一種半乳糖苷酶和編碼這種酶的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個克隆自大理洱源65℃熱泉宏基因組的β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷酶，EC3.2.1.23)和編碼這種酶的核苷酸，該半乳糖苷酶在37-55℃具有較高的催化活性，可作為乳糖降解和雙糖合成催化劑，并有水解生物體內(nèi)儲存的多糖和半乳糖殘基，另外該酶還具有轉(zhuǎn)糖苷作用，能生成一些功能性的低聚糖，如低聚半乳糖。低聚糖幾乎不被小腸消化，是一種低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纖維；低聚半乳糖作為腸道內(nèi)雙歧桿菌的增值因子，只能被雙歧桿菌所利用，增殖的雙歧桿菌競爭性地拮抗腐敗菌的生長，減少毒素和酶的產(chǎn)生，有整腸效果。
【專利說明】一種半乳糖苷酶和編碼這種酶的多核苷酸
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種克隆于大理洱源熱泉宏基因組的β-半乳糖苷酶，以及編碼此酶的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術產(chǎn)生這種酶的方法和應用。
【背景技術】
[0002]豬的乳汁中含有約3飛％的乳糖，當乳豬仔小腸粘膜絨毛β -半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足時會發(fā)生乳糖消化不良，未分解吸收的乳糖進入結腸后，被腸道存在的細菌發(fā)酵成為小分子的有機酸如醋酸、丙酸、丁酸等，并產(chǎn)生一些氣體如甲烷、H2, CO2等，這些產(chǎn)物大部分可被結腸重吸收，而未被吸收者或仍未被分解的乳糖可引起腸鳴、腹脹、腹痛、排氣、腹瀉等癥狀，長期如此并會嚴重影響乳豬仔的生長。
[0003]豆柏是畜禽飼料中常用的植物蛋白原料，而豆柏中含有較高的乳糖，飼料中的乳糖消化不良同樣會引起腹脹和腹瀉等癥狀。β -半乳糖苷酶(β -D-半乳糖苷酶，EC.3.2.1.23)又名乳糖酶，是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，可作為乳糖降解和雙糖合成的催化劑，并有水解生物體內(nèi)儲存的多糖和半乳糖殘基，具有治療乳豬仔腹瀉和提高飼料利用效率的作用。早在50年代初Aronson和Pazur就報道了此酶的轉(zhuǎn)糖苷活性，乳糖酶轉(zhuǎn)糖苷作用生成低聚半乳糖等功能糖。這種轉(zhuǎn)移反應的產(chǎn)物是雙糖、三糖和分子再大一些的低聚糖，是有多重組分構成的混合體系。我們所說的低聚半乳糖是以高濃度乳糖作為β_半乳糖苷酶的底物而生成的，是在乳糖分子的半乳糖殘基上以β鍵接上1~4個半乳糖而形成的雜低聚糖。低聚糖幾乎不被小腸消化，是一種低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纖維，只能被雙歧 桿菌所利用，雙歧桿菌是腸內(nèi)最有代表性的有益菌，它能調(diào)節(jié)和恢復腸道內(nèi)微生態(tài)菌群的平衡、抑制腸內(nèi)有害菌及病原菌的繁殖、促進腸蠕動、防治便秘及下痢、增進礦物的吸收和維生素的合成、提高機體抗病免疫功能等。功能糖是雙歧桿菌、乳酸桿菌最直接、最有效的養(yǎng)料，它能排除消化系干擾，選擇性地進入到雙歧桿菌、乳酸桿菌最適宜生長的大腸，促使雙歧桿菌快速生長和大量繁殖，增強機體免疫力的作用。由于微生物的快速生長和高效代謝的生物學特性，使其成為工業(yè)化酶制劑的主要來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種高溫β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，本半乳糖苷酶來源于大理洱源熱泉宏基因組。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼β_半乳糖苷酶的多核苷酸，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0006]本發(fā)明還提供一種重組載體，其含有編碼β_半乳糖苷酶的多核苷酸，且其是由多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運載體表達載體構建而成。
[0007]本發(fā)明的有益效果如下:
本發(fā)明獲得的β -半乳糖苷酶，該半乳糖苷酶在37-55 °C具有較高的催化活性，可作為乳糖降解和雙糖合成催化劑，并有水解生物體內(nèi)儲存的多糖和半乳糖殘基，能有效治療乳豬小腸粘膜絨毛β-半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足發(fā)生乳糖消化不良引起的腹瀉，具有治療乳豬仔腹瀉和提高飼料利用效率的作用；另外該酶還具有轉(zhuǎn)糖苷作用，在高濃度的乳糖作為底物時，該酶的轉(zhuǎn)糖苷作用能催化一種功能低聚糖---低聚半乳糖的生成，低聚半乳糖作為腸道內(nèi)雙歧桿菌的增值因子，只能被雙歧桿菌所利用，增殖的雙歧桿菌競爭性地拮抗腐敗菌(入產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長，減少毒素和酶的產(chǎn)生，有整腸效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明β -半乳糖苷酶基因的克隆片段；
圖2為本發(fā)明β-半乳糖苷酶基因保守結構域分析示意圖；
圖3為本發(fā)明β-半乳糖苷酶基因與表達質(zhì)粒連接菌落PCR檢測，圖中:Μ為Marker，泳道廣8皆為轉(zhuǎn)化后挑取的8個轉(zhuǎn)化子；
圖4為本發(fā)明構建成功的重組質(zhì)粒雙酶切圖譜，圖中:M為marker，泳道f 3為三個構建好的重組質(zhì)粒；
圖5為本發(fā)明β -半乳糖苷酶基因表達蛋白的SDS-PAGE分析檢測電泳圖，其分子量約為92000道爾頓，圖中:Μ為Protein Marker，泳道I為pET32a_GAL/Rosetta誘導前破碎上清，泳道2為pET32a-GAL/Rosetta誘導后破碎上清，泳道3為pET32a_GAL/Rosetta誘導后破碎上清過柱透過液，泳道4為30mM咪唑緩沖液過柱第二管，泳道5為50mM咪唑緩沖液過柱第二管，泳道6為80mM咪唑緩沖液過柱第二管，泳道7為150mM咪唑緩沖液過柱第一管，泳道8為300mM咪唑緩沖液過柱第一管； 圖6為本發(fā)明溫度對β-半乳糖苷酶活性的影響結果示意圖；
圖7為本發(fā)明β-半乳糖苷酶對溫度的穩(wěn)定性結果示意圖；
圖8為本發(fā)明pH對β -半乳糖苷酶活性的影響結果示意圖；
圖9為本發(fā)明β -半乳糖苷酶對pH的穩(wěn)定性結果示意圖。
【具體實施方式】
[0009]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0010]實施例1: β -半乳糖苷酶的克隆和表達 一、半乳糖苷酶的克隆表達
1、樣品宏基因組DNA提取
(I)樣品預處理
將65°C溫泉的泥水樣充分振蕩,是泥水混合均勻,取30 ml樣品于500g離心5min,使樣品中的大部分泥沙沉淀，去除沉淀的泥沙，再次將剩余的溶液于1000g離心10min,棄沉淀，目的在于進一步去除樣品中攜帶的較為細小的雜質(zhì)，最后將含有菌體的懸液于5000g離心IOmin,棄上清并收集沉淀的菌體。
[0011](2)宏基因組DNA提取:采用Qiaamp dna mini kit試劑盒提取DNA,方法參照試劑盒說明進行；
①用適量的 TE buffer (20 mM Tris-HCl,2 mM EDTA、pH7.6)和 ATL 緩沖液懸浮菌體，使菌懸液總體積約180 μ L，再加入20 μ L濃度為20 mg/ml的Lysozyme溶液，37 °C孵育至少30 min ；
②加入20μ L proteinase K和200 μ I緩沖液AL，漩渦震蕩混勻，56 °C孵育30 min,70 °C 孵育 10 min ；
③加入200μ L無水乙醇(96-100%)到樣品中，輕搖混合15秒。混合后，短暫離心；(緩沖液AL，和乙醇充分混合，以得到均勻的溶液)。
[0012]④加入無水乙醇后，可能出現(xiàn)白色沉淀，將沉淀和液體全加入QIAamp吸附柱中，再將QIAamp吸附柱放入干凈的2ml收集管中，8000rpm離心Imin,，棄收集管中的濾液；
⑤向QIAamp吸附柱中加入500μ LAffl緩沖液(盡量不要沾到管壁)，8000 rpm離心Imin，棄濾液；
⑥向QIAamp吸附柱中加入500μ LAW2緩沖液，14000 rpm離心3 min ；
⑦將QIAamp吸附柱放入EP管，14000rpm離心I min,充分去除AW2緩沖液；
⑧將QIAamp吸附柱放入新的EP管中，加入100~150μ L AE緩沖液，在室溫靜置2min, 8000 rpm離心I min收集總DNA ;基因組DNA凍存于-80 °C。
[0013]2、半乳糖苷酶基因的擴增(以宏基因組DNA為模板)
(O半乳糖苷酶基因的擴增所用引物序列如下:
正向引物:5 ’ -CGCGGATCCATGGGCAAGCAAGATTGGTA-3 ’
反向引物:5 ’ -CCGGAATTCGTGCATAATATAAGATATA-3，
(2)擴增體系如下:
表1:擴增反應體系組分
【權利要求】
1.一種半乳糖苷酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種編碼權利要求1所述半乳糖苷酶的多核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
【文檔編號】C12N15/63GK103937767SQ201410137767
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月8日 優(yōu)先權日:2014年4月8日
【發(fā)明者】林連兵, 梁叢叢, 鄭健, 魏云林, 季秀玲, 張琦, 鄧先余 申請人:昆明理工大學