一株恥垢分枝桿菌極耐受過氧化氫突變菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種恥垢分枝桿菌極耐受過氧化氫突變菌及其應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種恥垢分枝桿菌Mycobacterium?Smegmatis?mc251，其保藏號(hào)為CGMCC.NO8947。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，該突變菌株是研究分枝桿菌應(yīng)答過氧化氫分子機(jī)制很好的對(duì)象，進(jìn)而為解釋結(jié)核分枝桿菌潛伏感染以及耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)，為疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)。
【專利說明】一株恥垢分枝桿菌極耐受過氧化氫突變菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一株恥垢分枝桿菌極耐受過氧化氫突變菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Μ.tb)是結(jié)核病的致病菌。活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、耐藥性和宿主之間的相互作用中起著非常重要的作用。過氧化氫(H2O2)是活性氧中的一種重要形式。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, M.smegmatis)與結(jié)核分枝桿菌同屬于分枝桿菌科分支桿屬，是一種條件致病菌?；蛏系拇罅客葱耘c生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)均使得M.smegmatis成為研究M.tb首選的模式菌株。由于巨噬細(xì)胞內(nèi)H2O2的生理濃度為5-10mM，在長(zhǎng)期的共進(jìn)化中，M.tb天然的抗H2O2,而作為研究M.tb的模式菌株M.smegmatis mc2155相對(duì)于M.tb對(duì)H2O2敏感，M.smegmatis幾乎能夠完全被清除而M.tb能夠部分潛伏下來,可能與他們的抗H2O2能力有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一株恥垢分枝桿菌極耐受過氧化氫突變菌及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供了恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatis mc251,其保藏號(hào)為CGMCC.N08947。
[0005]上述恥垢分枝桿菌mc251在制備具有抗氧化性產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0006]上述恥垢分枝桿菌mc251在制備耐受H2O2的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0007]上述恥垢分枝桿菌mc251在制備耐受巨噬細(xì)胞吞噬的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0008]上述產(chǎn)品為試劑盒。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有抗氧化性或耐受H2O2或耐受巨噬細(xì)胞吞噬的產(chǎn)品。
[0010]本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述的恥垢分枝桿菌mc251或其發(fā)酵產(chǎn)物或其重懸液或其代謝產(chǎn)物或其培養(yǎng)液。
[0011]恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatis mc251,于 2014 年 3 月 21 日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8947，分類命名為恥垢分枝桿菌Mycobacteriumsmegmatis。
[0012]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明篩選耐H2O2恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatismc251，并且測(cè)定突變株對(duì)H2O2的最小抑菌濃度(MIC)、世代時(shí)間、在宿主細(xì)胞中的存活率、在饑餓條件下的生長(zhǎng)情況以及對(duì)巨噬細(xì)胞生理H2O2濃度的反應(yīng)來鑒定此突變株的表型。另外，對(duì)此突變菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，與野生型全序列比對(duì)，找到若干突變位點(diǎn)(SNPs，單核苷酸多態(tài)性)。因此，該突變菌株是研究分枝桿菌應(yīng)答過氧化氫分子機(jī)制很好的對(duì)象，進(jìn)而為解釋結(jié)核分枝桿菌潛伏感染以及耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)，為疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)。與野生型相比，突變株極耐受過氧化氫，生長(zhǎng)速度變慢，在宿主細(xì)胞中的存活率增高，在饑餓條件下有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這些表型都與病原菌結(jié)核分枝桿菌相似，其表型更像結(jié)核分枝桿菌，使得其可能作為可行的活疫苗載體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatis mc251的菌落形態(tài)。
[0014]圖2為突變菌株mc251對(duì)H2O2的最小抑菌濃度。
[0015]圖3為突變菌株mc251過氧化氫處理點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)。
[0016]圖4為突變菌株mc251世代時(shí)間、starvation點(diǎn)板以及Macrophage killingassay。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0019]實(shí)施例1、恥垢分枝桿菌突變菌株的獲得
[0020]一、突變菌株的獲得
[0021]利用恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatis mc2155作為對(duì)象,通過逐步提高液體培養(yǎng)基中H2O2的濃度來篩選耐H2O2恥垢分枝桿菌,命名為MycobacteriumSmegmatismc251。
[0022]具體過程如下:
[0023](I)根據(jù)測(cè)得的me2155對(duì)H2O2的最小抑菌濃度選擇菌液初始H2O2處理濃度(0.039mM)；
[0024](2)將新鮮的mc2155菌液按1:1000接種至5ml含H2O2的7H9培養(yǎng)基。(H2O2的濃度設(shè)置要稍小于mc2155對(duì)H2O2的最小抑菌濃度)
[0025](3)待該菌液生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)后期再按步驟(2)逐步提高H2O2濃度，使菌株受到持續(xù)高濃度H2O2刺激而對(duì)H2O2產(chǎn)生耐受。
[0026](4)由于篩選出的耐H2O2菌液是一個(gè)群體,所以將這些菌液在7H10固體培養(yǎng)基上劃線得到的單菌落再培養(yǎng)收集到的菌體才是對(duì)H2O2有單一 MIC (最小抑菌濃度)的突變株。
[0027](5)為了保證得到的單克隆有遺傳穩(wěn)定性，需要再將上述得到的對(duì)H2O2有單一 MIC突變株在沒有H2O2壓力條件下傳10次，劃7H10平板后得到的單菌落即為突變菌恥垢分枝桿菌 Mycobacterium Smegmatis mc251。
[0028]恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatis mc251,于 2014 年 3 月 21 日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8947，分類命名為恥垢分枝桿菌Mycobacteriumsmegmatis。[0029]二、恥垢分枝桿菌 Mycobacterium Smegmatis mc251 的表型
[0030]1、恥垢分枝桿菌 Mycobacterium Smegmatis mc251 的形態(tài)特征
[0031]菌落形態(tài)特征如圖1所示，菌落干燥，細(xì)皺至粗褶，乳脂白色；細(xì)菌形態(tài)纖細(xì)桿菌，長(zhǎng)3.0-5.0微米，有時(shí)彎曲，有分枝或Y形細(xì)胞。
[0032]2、生理生化特征
[0033]mc251需氧菌，革蘭氏陽性菌，可被石碳酸品紅染色法以及羅丹明熒光染色法染色。
[0034]3、世代時(shí)間測(cè)定
[0035]1)活化菌液:上述一制備恥垢分枝桿菌突變菌株mc251和野生型mc2155種子液按1:50接種5ml至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6qq=0.5左右)，再按初始OD為0.02接種IOml，長(zhǎng)至OD6tltl=0.1左右。
[0036]2)測(cè)定菌液OD值，并使初始OD均為0.1。
[0037]3)按濃度稀釋涂平板，計(jì)數(shù)得N0。
[0038]4)將OD=0.1的菌液分裝到15ml離心管，每管2ml。37°C，200rpm，培養(yǎng)20h，涂平
板計(jì)數(shù)得Nt。
[0039]2)根據(jù)公式n= (IgNt-1gNci)/lg2計(jì)算世代時(shí)間。
[0040]結(jié)果如圖4a所示，突變菌株mc251世代時(shí)間為3.448±0.087小時(shí)，野生型me2155世代時(shí)間為2.734±0.051小時(shí)，突變株比野生型要長(zhǎng)，即生長(zhǎng)速度變慢。
[0041]4、Starvation 點(diǎn)板檢測(cè)
[0042]將上述一制備恥垢分枝桿菌突變菌株mc251和野生型mc2155從種子液按1:100的比例接到5mL的7H9培養(yǎng)基中，搖到0D600=0.3，取出Iml菌液，按10倍梯度稀釋至10」，將濃度從高到低的菌液依次點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)有限的培養(yǎng)基(M9)平板以及營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基(M9+10%ADS)平板。
[0043]結(jié)果如圖4b所示，突變菌株mc251在饑餓條件下(M9培養(yǎng)基)生長(zhǎng)比野生型要好很多，在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基上(M9+10%ADS)生長(zhǎng)沒有什么差別。
[0044]5、恥垢分枝桿菌突變菌株全基因組測(cè)序
[0045]I)取IOml由上述一制備恥垢分枝桿菌突變菌株mc251的菌液離心12000rpm，lmin,棄上清，加500ul DNA裂解液，充分混勻，重懸菌體；
[0046]2)加入300ul5M NaCl，充分混勻，沉淀蛋白，12000rpm離心15min ；
[0047]3)取上清,加氯仿800ul,混勻，12000rpm離心10min ；
[0048]4)取上清，加2.5倍體積的無水乙醇，_20°C沉淀15min ；
[0049]5) 2000rpm離心10min,棄上清，用70%乙醇Iml洗一次；
[0050]6)再離心2min，棄凈乙醇，烘干，溶于50ul水，存于_20°C ；
[0051]7)將基因組DNA進(jìn)行測(cè)序。
[0052]測(cè)序后(genbank號(hào)JAJD00000000及提交時(shí)間2014.1.12)與野生型mc2155的基因組DNA (genbank號(hào)NC_008596提交時(shí)間2006.10.19)進(jìn)行比對(duì)，找到若干突變位點(diǎn)(SNPs，單核苷酸多態(tài)性)，如表1所示。
[0053]表1為與野生型mc2155比對(duì)后突變菌株mc251的基因組DNA的SNPs
[0054]
【權(quán)利要求】
1.恥垢分枝桿菌Mycobacterium Smegmatis mc251,其保藏號(hào)為 CGMCC.N08947。
2.權(quán)利要求1所述的恥垢分枝桿菌mc251在制備具有抗氧化性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的恥垢分枝桿菌mc251在制備耐受H2O2的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的恥垢分枝桿菌mc251在制備耐受巨噬細(xì)胞吞噬的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.一種具有抗氧化性或耐受H2O2或耐受巨噬細(xì)胞吞噬的產(chǎn)品，包括權(quán)利要求1所述的恥垢分枝桿菌mc251 或其發(fā)酵產(chǎn)物或其重懸液或其代謝產(chǎn)物或其培養(yǎng)液。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103898021SQ201410128566
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】米凱霞, 李曉靜, 陶均, 胡新玲 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所