一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，包括（1）松江鱸魚鰭條基因組DNA提取與稀釋；（2）微衛(wèi)星引物的合成；（3）PCR反應(yīng)體系及擴增程序優(yōu)化；(4)PCR產(chǎn)物檢測。本發(fā)明建立了進(jìn)行松江鱸魚親子鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)比較的3重PCR反應(yīng)體系，實現(xiàn)了在一個PCR反應(yīng)中同時檢測3個微衛(wèi)星位點。本發(fā)明操作簡便快捷、效率高，可以在松江鱸魚瀕危物種保護(hù)、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定中得到應(yīng)用。
【專利說明】—種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于松江鱸魚分子標(biāo)記領(lǐng)域，特別涉及一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]松江S盧魚分類地位為鈾形目(Scorpaeniformes)、杜父魚科(Cottidae)JMlCiA屬(Trachidermus)，是一種名貴的暖溫性淺水底層魚類，有降河洄游的習(xí)性，為“中國四大名魚”之一。廣泛分布于我國沿海，包括從渤海、黃海到東海的福建廈門等地，但最主要的產(chǎn)區(qū)為長江三角洲，歷史上松江附近(今上海地區(qū))所產(chǎn)的松江鱸魚最有名，故得名“松江鱸”。目前，松江鱸魚已被列入我國重點保護(hù)二級水生動物。然而，目前國內(nèi)對于松江鱸魚的研究多集中在其繁殖生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)方面，有關(guān)遺傳學(xué)方面的研究相對較少，為更好地保護(hù)和利用這一珍稀資源提供珍貴的背景資料，利用微衛(wèi)星標(biāo)記來進(jìn)行松江鱸魚遺傳學(xué)方面的研究顯得尤為必要。
[0003]微衛(wèi)星(microsatellite)又稱為短串聯(lián)重復(fù)(ShortTandem Repeats, STR)、簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats, SSR),廣泛地分布于真核生物的基因組中，每50~150kb左右就會出現(xiàn)一次，魚類尤以二核苷酸重復(fù)如CA、GT最為豐富。由于其分布廣泛、符合孟德爾共顯性遺傳、多態(tài)信息含量高、突變快、引物具有通用性強、便于檢測等優(yōu)點，已成為進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、分子進(jìn)化研究、群體遺傳學(xué)、家系分析與遺傳育種、標(biāo)記輔助選擇以及經(jīng)濟性狀的Q TL定位等的主要分子標(biāo)記之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，該方法操作簡便快捷、效率高，可以在松江鱸魚瀕危物種保護(hù)、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定中得到應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，包括:
[0006](I)剪取松江鱸魚的鰭條，提取基因組DNA ；
[0007](2)合成不同位點的微衛(wèi)星正反向引物，引物序列如下:
[0008]SJL-C47:F: GGAGGCGGATGATGTTGGA ；
[0009]R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC ;
[0010]SJL-B61:F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG ；
[0011]R:CCGACACGCTCACCGTATTTC ；
[0012]SJL-D25:F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG ；
[0013]R:GGCACATAACGGCTTCACTG ；
[0014](3)運用優(yōu)化好的PCR擴增體系和擴增程序?qū)Σ煌山|魚個體進(jìn)行3重PCR擴增；
[0015](4)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定個體的基因型，獲得松江鱸魚遺傳多態(tài)性圖譜。
[0016]所述步驟(3)中的PCR 擴增體系為 10XBuffer5y L，25mM MgCl23 μ L，各含 IOmMdNTPl.0 μ L，IOOng/ μ L 模板 I μ L, SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47 正反向引物各 I μ L, 5U/ μ LTaq DNA 聚合酶 0.4 μ L，ddH208.6 μ L。
[0017]所述10父811打61'中含有2001111 Tris-HCl pH8.825°C, IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,
1.0%Triton X-100。
[0018]所述步驟(3)中的PCR擴增程序為94°C變性5min后進(jìn)行下面程序:94°C變性30S，55°C退火30S，65°C延伸Imin，進(jìn)行30個循環(huán)，最后65°C延伸7min。
[0019]所述步驟(4)中的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測具體為:首先用2%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色判斷產(chǎn)物的有無，然后用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠200V恒電壓電泳1.5小時，7.5%的醋酸溶液固定15min，接著用去離子水洗膠3次，每次5min，然后0.15%的硝酸銀溶液銀染30min,顯影2_3min,最后固定5min。 [0020]所述步驟(4)中的確定個體的基因型的方法為:將電泳譜帶中的每一條DNA片段作為該位點的一個等位基因來處理，每個位點擴增的等位基因按其遷移率的不同從大到小依次定義為:1、2、3、…、k。由于微衛(wèi)星標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，在單個位點，純合子為一條帶，雜合子為兩條帶，統(tǒng)計各樣本基因型。
[0021]本發(fā)明中所涉及的3個微衛(wèi)星位點(3幾447、5幾-861、5幾-025)的序列如SEQ IDNO:1-3 所示。
[0022]圖1中:1-6為不同的松江鱸魚個體；圖中同時標(biāo)示出了 3個微衛(wèi)星位點在不同個體擴增的區(qū)間。引物SJL-D25擴增效率最低，在電泳圖譜中隱約可見；其次為SJL-B61，電泳圖譜相對較清晰；3幾447擴增效率最高，每個位點的等位基因均清晰可見。同時，也可以看出SJL-B61僅檢測到I個等位基因，不同個體在這個位點沒表現(xiàn)出多態(tài)性，而其他2個位點在不同個體中都檢測到了數(shù)量不等的等位基因。標(biāo)號為I的個體在位點SJL-C47僅檢測到一個等位基因，說明該個體在這個位點為純合子，其余個體均檢測到兩個等位基因，表明2至6號個體在位點SJL-C47為雜合子；同樣，6個不同個體在位點SJL-D25也是純合子雜合子并存。
[0023]有益.效果
[0024]本發(fā)明建立了進(jìn)行松江鱸魚親子鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)比較的3重PCR反應(yīng)體系，實現(xiàn)了在一個PCR反應(yīng)中同時檢測3個微衛(wèi)星位點，操作簡便快捷、效率高，可以在松江鱸魚瀕危物種保護(hù)、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定中得到應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為松江鱸魚3重PCR擴增聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。[0027]實施例1
[0028]1、松江鱸魚樣品采集和DNA制備取松江鱸魚，剪取鰭條放入95%的酒精保存，剪取鰭條約0.1g用雙蒸水沖洗,用濾紙吸干放入1.5mL的離心管,加入465 μ L STE( 150mmol/LNaCl,50mmol/L Tris, lmmol/L EDTA)緩沖液，25 μ L 的 10%SDS，10 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)混勻，55°C消化過夜，用苯酚、氯仿及酚/氯仿各抽提一次，等體積的異丙醇沉淀，12，OOOr/min離心30min，沉淀用70%的乙醇洗2次，再用50 μ L雙蒸水溶解，在0.8%的瓊脂糖凝膠上檢測DNA的質(zhì)量和濃度。
[0029]2、松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記引物的合成合成不同位點的微衛(wèi)星正反向引物。 [0030]引物序列如下:
[0031 ] SJL-C47:F:GGAGGCGGATGATGTTGGA ；
[0032]R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC ;
[0033]SJL-B61: F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG ；
[0034]R:CCGACACGCTCACCGTATTTC ；
[0035]SJL-D25:F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG ；
[0036]R:GGCACATAACGGCTTCACTG。
[0037]3、松江鱸魚3重PCR擴增運用以上優(yōu)化好的PCR擴增體系和擴增程序?qū)Σ煌山|魚個體進(jìn)行3重PCR擴增。
[0038]松江鱸魚3 重 PCR 擴增體系:10XBuffer (200mM Tris-HCl (ρΗ8.825 °C )，IOOmM KCl, IOOmM (NH4)2S04,1.0%Triton X-1OO0 )5 μ L, MgCl2 (25mM) 3 μ L, dNTP(各含IOmM) 1.0μ L，模板(lOOng/μ L) I μ L，SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47 正反向引物各 I μ L, TaqDNA 聚合酶(5U/y L) 0.4μ L, ddH208.6 μ L。
[0039]松江鱸魚3重PCR擴增程序:94°C變性5min后進(jìn)行下面程序:94°C變性30S，55°C退火30S，65°C延伸lmin，進(jìn)行30個循環(huán)，最后65°C延伸7min。
[0040]4、產(chǎn)物檢測PCR擴增產(chǎn)物先用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中依據(jù)條帶的亮度判斷擴增產(chǎn)物的有無或擴增量的多少，然后用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行不同個體的基因分型。
[0041]4.1準(zhǔn)備制膠玻璃板
[0042]用Bind-Silane處理大玻璃板,使凝膠與之粘貼；用Repel-Silane處理小玻璃板，使凝膠易于剝離。通常分離放置兩塊玻板以免交叉污染，在兩塊玻板外緣刻劃標(biāo)記以區(qū)分未經(jīng)處理的一面。
[0043]I)用95%乙醇清洗玻璃板。
[0044]2)處理小玻板:加3ml Repel-Silane于小玻板未刻標(biāo)記的一面，用紙巾將其均勻涂抹在整個表面。室溫干燥5min用紙巾擦去多余的Repeo-Silane,去離子水浸泡玻板60min。在去離子水中用紙巾清洗玻板三次,再使之涼干,然后用95%乙醇清洗備用。
[0045]3)處理大玻板:在通風(fēng)櫥中準(zhǔn)備Bind-Silane,加I μ I Bind Silane于Iml含5%醋酸的95%乙醇中(50 μ I醋酸加950 μ I乙醇)。充分混合使清澈透亮，全部加到大玻板未刻標(biāo)記的一面，用抹布均勻涂抹整個表面。室溫5min揮干并用95%乙醇清洗3_4次洗去多余的 Bind-Silane。
[0046]4)清洗準(zhǔn)備0.4mm間隔條、加樣梳和金屬夾，將處理好的玻板置于水平制膠模具上，準(zhǔn)備制膠。
[0047]4.2配制聚丙烯酰胺凝膠
[0048](8% Acr/Bis Gel/0.4mm)
[0049]40%甲叉雙丙烯酰銨(19:1) IOml
[0050]5 X TBE5ml
[0051]去離子水35ml
[0052]在加熱磁力攪拌器上使尿素溶解。待尿素溶解后，用0.2μπι濾器過濾凝膠液，灌A 100mL 燒杯。
[0053]然后迅速加入:
[0054]TEMED25 μ I
[0055]10% 過硫酸銨250 μ I
[0056](新鮮配制)
[0057]I)用一支60ml注射器小心將凝膠混合液吸取并加入封好底和邊的兩塊玻板間，讓液體自底部向上連續(xù)注 入直到液面到達(dá)玻板頂端，避免氣泡產(chǎn)生。
[0058]2)迅速在頂端兩玻板間插入加樣梳,并用金屬夾固定玻板。
[0059]3)室溫使凝膠聚合Ih。
[0060]4.3預(yù)電泳
[0061]I)待凝膠聚合好后,去掉金屬夾,將凝膠板固定于垂直電泳槽上。
[0062]2)在垂直電泳槽的上下槽分別加入大約500ml0.5XTBE緩沖液。
[0063]3)小心去掉加樣梳，用移液器小心沖液加樣槽。
[0064]4.4聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0065]I)將3μ I擴增產(chǎn)物加入標(biāo)記好的微量離心管中(若樣本不足3ul，用去離子水補足 3ul)。
[0066]2)加入3 μ I甲酰胺載樣緩沖液(95%甲酰胺，0.05%溴酚蘭)。
[0067]3)設(shè)置等位基因參照物，每份3μ I等位基因加3μ I甲酰胺載樣緩沖液。
[0068]4)待凝膠預(yù)電泳結(jié)束后，用移液器再次沖洗加樣槽，然后自左向右依次將樣本和ladder加入凝膠加樣槽。注意動作要輕柔,避免樣品漂移。
[0069]5)恒電壓200V電泳1.5小時。
[0070]4.5 銀染
[0071]注意事項:
[0072]I)甲醛和冰醋酸可致皮膚和眼睛嚴(yán)重?fù)p害，使用時應(yīng)在通風(fēng)處以免吸入其揮發(fā)氣味。并著實驗服，戴手套和眼睛防護(hù)罩。
[0073]2)碳酸鈉、硫代硫酸鈉和硝酸銀亦可引起皮膚和眼睛刺激反應(yīng)，使用時應(yīng)采取防護(hù)措施。
[0074]4.5.1試劑配制
[0075]I)在通風(fēng)櫥內(nèi)配制固定液:(1000ml)
[0076]醋酸75ml
[0077]去離子水925ml
[0078]2)配制銀染液(500ml):[0079]硝酸銀0.75g
[0080]去離子水500ml
[0081]用前15分鐘加入750 μ I甲醛，注意蔽光保存。
[0082]3 )配制顯影液(500ml):
[0083]碳酸鈉溶液125ml (120g/L)
[0084]硫代硫酸鈉溶液500ul (4mg/ml)
[0085]去離子水500ml
[0086]4°C _8°C保存，用前5分鐘加750ul甲醛。
[0087]4.5.2銀染步驟
[0088]1)電泳結(jié)束后，從電泳槽上取下凝膠玻板，小心分離兩塊玻璃板，凝膠粘附在大玻板上。將大玻板輕輕放入銀染盒中。在銀染各步操作中，凝膠均應(yīng)置于旋轉(zhuǎn)搖床上使之緩慢搖動。
[0089]2)加入500ml固定液浸膠15min，剩余固定液保存于4°C到第7步使用。
[0090]3)倒掉固定液,用去離子水洗膠三次,每次500ml,共5min。
[0091]4)倒掉去離子水，加500ml銀染液。蔽光，浸膠30min。
[0092]5)將銀染液倒入回收容器內(nèi)。用去離子水快速洗膠10-20s
[0093]6)加500ml顯影液。蔽光，浸膠2_3min，直至譜帶顯出。
[0094]7)倒掉顯影液,加入500ml固定液,浸膠5min。
[0095]8)倒掉固定液,將膠板豎立5min,或等玻板干燥。
[0096]9)待凝膠干 燥，譜帶將更清晰。
[0097]備注:
[0098]1)從玻板上清除凝膠時可用刀片輕輕刮剔，如果需要，殘留凝膠可在10%Na0H中浸泡1h時以徹底清除，最后用95%乙醇和水清洗。
[0099]2)處理硝酸銀廢液，在回收容器中加入使用過的顯影液，過夜，使銀離子沉淀，通過濾器過濾銀離子懸液，收集銀離子結(jié)晶，倒掉濾過上清液并用水沖洗。
【權(quán)利要求】
1.一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，包括: (1)剪取松江鱸魚的鰭條，提取基因組DNA； (2)合成不同位點的微衛(wèi)星正反向引物，引物序列如下:
SJL-C47:F:GGAGGCGGATGATGTTGGA ；
R:ACTGCGGTAATGTGCGTTTC ；
SJL-B61:F:ACCAGTTCCATCCAGCAGTTG ；
R:CCGACACGCTCACCGTATTTC ；
SJL-D25:F:GAATGCGGGTTCAAGGTAG ；
R:GGCACATAACGGCTTCACTG ； (3)運用優(yōu)化好的PCR擴增體系和擴增程序?qū)Σ煌山|魚個體進(jìn)行3重PCR擴增； (4)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定個體的基因型，獲得松江鱸魚遺傳多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，其特征在于:所述步驟(3)中的PCR擴增體系為10XBuffer5y L，25mM MgCl23yL，各含IOmMdNTPl.0 μ L，IOOng/ μ L 模板 I μ L, SJL-D25、SJL-B61、SJL-C47 正反向引物各 I μ L, 5U/ μ LTaq DNA 聚合酶 0.4 μ L，ddH208.6 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，其特征在于:所述 IOXBuffer 中含有 200mM Tris-HCl pH8.825°C, IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1.0%TritonX-100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，其特征在于:所述步驟(3)中的PCR擴增程序為94°C變性5min后進(jìn)行下面程序:94°C變性30S，55°C退火30S，65°C延伸lmin，進(jìn)行30個循環(huán)，最后65°C延伸7min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松江鱸魚微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR檢測方法，其特征在于:所述步驟(4)中的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測具體為:首先用2%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色判斷產(chǎn)物的有無，然后用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠200V恒電壓電泳1.5小時，7.5%的醋酸溶液固定15min，接著用去離子水洗膠3次，每次5min，然后0.15%的硝酸銀溶液銀染30min,顯影2_3min,最后固定5min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937882SQ201410118158
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】張志勇, 張志偉, 徐獻(xiàn)明, 許津, 沈德華, 張曹進(jìn), 吳建平, 吳國均, 任忠宏 申請人:江蘇省海洋水產(chǎn)研究所