口腔中幽門螺桿菌pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明提供了口腔中Hp的PCR檢測(cè)方法的構(gòu)建方法；本發(fā)明以幽門螺桿菌鐵蛋白基因?yàn)闄z測(cè)靶基因建立了口腔中Hp的PCR檢測(cè)方法，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明通過建立口腔中Hp的PCR檢測(cè)方法，為臨床上胃病患者的病因診斷提供了新的依據(jù)。本發(fā)明所公開的技術(shù)方案與傳統(tǒng)技術(shù)相比，敏感性較高，利用所建立的方法對(duì)陽性對(duì)照稀釋倍數(shù)是104～1010的7組不同濃度標(biāo)準(zhǔn)陽性菌液進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，患者胃病由幽門螺桿菌感染引起的，可以通過本方法檢測(cè)到幽門螺桿菌，并且所建立的PCR檢測(cè)方法靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及口腔中幽門螺桿菌的檢測(cè)方法，具體涉及口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè) 方法。 口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法
【背景技術(shù)】
[0002] 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的人群在全球范圍內(nèi)約有50%以上， 是引起人類消化性潰瘍、慢性胃炎、胃黏膜出現(xiàn)淋巴瘤和胃癌的關(guān)鍵病因。Hp感染相關(guān)的病 原菌，在廣范圍內(nèi)可以大量的繁殖，生長(zhǎng)條件要求低，可以通過不同的途徑進(jìn)行傳播，其感 染還具有傳染性、致癌性、普遍性和隱蔽性，嚴(yán)重威脅人們的身體健康。在世界范圍內(nèi)，與癌 癥有關(guān)的致死率中，Hp感染引起的胃癌高居第二。目前，Hp已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為第 一類致癌因子，因此，加快對(duì)Hp感染的研究十分重要和必要。
[0003] Hp的宿主主要是人類，人體胃幽門是Hp特定的定居部位。1983年Warern和 Marhsal 1首次從活動(dòng)性慢性胃炎患者的胃黏膜中成功培養(yǎng)出Hp，兩人因此還在2005年獲得 了諾貝爾獎(jiǎng)。Hp是目前所知的唯一一種能在人胃中生存的微生物。1989年，Krajedn從口腔 唾液和牙菌斑生物膜中首次成功分離出Hp，從此口腔作為Hp的第二個(gè)宿主部位引起人們的 關(guān)注?？谇籋p可以伴隨口腔中的食物和唾液經(jīng)消化系統(tǒng)的吞咽過程進(jìn)入胃內(nèi)，反之，胃內(nèi)Hp 可通過反酸與食物返流的方式流入到消化道后進(jìn)入口腔[4]。后來經(jīng)證實(shí)，口腔Hp和胃內(nèi)Hp 具有$父尚的同源性。
[0004] 胃中Hp感染和口腔Hp檢出確實(shí)存在著一定的聯(lián)系。檢測(cè)口腔Hp的存在與否也許會(huì) 在不同程度的胃炎疾病的鑒定和癌前病變方面有一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)慢性萎縮性胃炎 (CAG)患者的口腔中Hp的檢出率要高于淺表性胃炎和消化性潰瘍(PU)患者。因口腔和胃內(nèi) Hp有著較高同源性，故唾液和牙菌斑可作為診斷Hp感染類型的可靠的非侵入性檢查的標(biāo) 本。此外，亦可通過對(duì)唾液中Hp抗原和抗體的檢測(cè)給胃部疾病的診斷提供依據(jù)。綜上所述， 根除口腔Hp可能是防止胃內(nèi)Hp感染的重要措施，檢測(cè)口腔Hp的存在與否將會(huì)在臨床上有著 非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了 口腔中Hp的PCR檢測(cè)方法的構(gòu)建方法;在 此基礎(chǔ)上建立了 口腔中Hp的PCR檢測(cè)方法，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明 通過建立口腔中Hp的PCR檢測(cè)方法，為臨床上胃病患者的病因診斷提供了新的依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法，其特征是：以幽門螺桿菌 鐵蛋白基因?yàn)闄z測(cè)革巴基因。
[0007] 根據(jù)權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，具體包括以下步 驟：
[0008] 樣品的采集:樣品來源于口腔唾液和牙菌斑;早晨空腹未刷牙前，研究對(duì)象戴無菌 手套手持無菌EP管，向無菌EP管中收集唾液，及時(shí)用封口膜密封管口，以防交叉污染；
[0009]樣品的處理:樣品收集結(jié)束后，立即將樣品置于沸水煮沸25min，沸水浴的過程中 勿讓沸水進(jìn)入無菌EP管中；煮沸后，封口膜封口，置于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0010] 普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)體系如下：5yL菌液模板，2.5yL 10XPCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，濃度均為20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5yL 的TaqDNA聚合酶，其余為無菌三蒸水；
[0011] 其中，正向引物F為：5' -TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3'
[0012] 反向引物R為：S'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。
[0013] 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的幽門螺桿菌目的基因?yàn)?鐵蛋白基因，基因片段為SEQ ID No. 1:
[0014] ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACATGTC CATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAGTACG AGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCCAGAG CACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCAACAA CATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAACACG AGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTTGGCT GACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCCo
[0015] 所述普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán)：94°C變性 30s; 58 °C退火30s; 72 °C延伸40s;分別運(yùn)行29個(gè)循環(huán)，72 °C終延伸IOmin。
[0016] 該方法包括以下步驟：（1)樣品的采集:樣品來源于口腔唾液和牙菌斑；（2)樣品的 處理:樣品收集結(jié)束后，立即將樣品置于沸水煮沸25min，煮沸后，封口膜封口，置于4°C保存 備用。其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)體系如下:5yL菌液模板，2.5yL 10 X PCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，濃度均為20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5yL 的TaqD NA聚合酶，其余為無菌三蒸水。其中，正向引物F為：5' -T TGTC C A AG GACATCATCAAGTTGTTG-3'反向引物R為 j'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。
[0017] 所述的口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法，陽性菌液的最適稀釋梯度是107,檢測(cè)幽 門螺桿菌的極限是6 X IO8CFlVmL
[0018] 本發(fā)明的積極有益效果：
[0019] 本發(fā)明通過設(shè)定靶基因?yàn)镠p鐵蛋白基因，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)合成正向引物、反向引 物，摸索PCR的退火溫度、循環(huán)次數(shù)、模板量，建立了 □腔中Hp的PCR檢測(cè)方法，為臨床上胃病 患者的病因提供新的診斷方法。
[0020] 本發(fā)明所公開的技術(shù)方案與傳統(tǒng)技術(shù)相比，敏感性較高，利用所建立的方法對(duì)陽 性對(duì)照稀釋倍數(shù)是104~1010的7組不同濃度標(biāo)準(zhǔn)陽性菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:本發(fā)明中 Hp的檢測(cè)方法對(duì)陽性對(duì)照稀釋倍數(shù)是105~109都可以檢測(cè)到（圖1)，檢測(cè)下限為llCFU/mL; 利用建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，具有較好的重復(fù)性;利用不同的細(xì)菌和不同動(dòng)物 的血清進(jìn)行PCR檢測(cè)，都未擴(kuò)增出Hp目的條帶（圖2)，說明本發(fā)明具有較好的特異性;另外本 技術(shù)方案還具有樣品采集和處理方便、檢測(cè)通量高、操作簡(jiǎn)便、成本低以及定量準(zhǔn)確等特 點(diǎn)。
[0021 ]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，患者胃病由幽門螺桿菌感染引起的，可以通過本方法檢測(cè) 至Ij幽門螺桿菌，并且所建立的PCR檢測(cè)方法靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0022]圖I PCR檢測(cè)方法靈敏性電泳結(jié)果；
[0023]圖2 PCR檢測(cè)方法特異性電泳結(jié)果；
[0024] 圖3不同退火溫度的相同樣品PCR電泳結(jié)果；
[0025] 圖4不同循環(huán)次數(shù)相同樣品PCR電泳結(jié)果；
[0026] 圖5~13 PCR檢測(cè)方法對(duì)不同樣品的PCR檢測(cè)電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0028] 實(shí)施例1.含有外源轉(zhuǎn)入Hp鐵蛋白的大腸桿菌菌液的稀釋與計(jì)數(shù)
[0029] 用高壓滅菌移液器槍頭從含Amp(100yg/mL)的LB固體選擇培養(yǎng)基上挑取含有外源 轉(zhuǎn)入Hp鐵蛋白的大腸桿菌DH5a單菌落，接種于ImL含Amp (lOOyg/mL)的LB液體選擇培養(yǎng)基進(jìn) 行激活培養(yǎng)，在微需氧條件下37°C、140r/min振蕩培養(yǎng)約12h后，取ImL菌液加入9mL的生理 鹽水中，進(jìn)行1~10倍的梯度稀釋。稀釋后，分別從4~10倍的稀釋梯度下(一個(gè)稀釋梯度做 三個(gè)平行，外加一個(gè)空白對(duì)照)取ImL菌液于相應(yīng)的無菌平皿中，然后再向平皿中倒入9mL尚 未凝固的含Amp(100yg/mL)的LB固體選擇培養(yǎng)基，將其與菌液進(jìn)行混勾，靜置。待其凝固后 置于電熱恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)18~24h。計(jì)數(shù)。剩余的不同稀釋梯度下的菌液用來進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后檢測(cè)，用來確定此檢測(cè)方法的靈敏度，還可作為本研究最終的陽性模板。
[0030] 結(jié)果表明，含有外源插入Hp鐵蛋白的大腸桿菌菌液在培養(yǎng)基中的，計(jì)數(shù)結(jié)果見表 1〇
[0031 ]表1陽性對(duì)照不同稀釋梯度菌液平板計(jì)數(shù)
[0033]根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)和報(bào)告原則，可知在菌液稀釋梯度為IO5梯度下Hp菌液量為 1.03 X IO2CFUAiL;在菌液稀釋梯度為IO6梯度下Hp菌液量為70CFU/mL;在菌液稀釋梯度為 IO7梯度下Hp菌液量為60CFU/mL;在菌液稀釋梯度為108、109、10 1()梯度下Hp單菌落量不在30 ~300之間，不統(tǒng)計(jì)。
[0034]實(shí)施例2樣品的收集及處理
[0035] 在2016年1月~2016年3月期間，以新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院的學(xué)生為研究對(duì) 象，取人口腔唾液和牙菌斑共50例。
[0036] 口腔唾液收集要求及方法:早晨空腹未刷牙前，讓研究對(duì)象戴著無菌手套手持無 菌EP管，向無菌EP管中收集唾液，及時(shí)用封口膜密封管口，以防交叉污染。
[0037] 口腔牙菌斑收集要求及方法:早晨空腹未刷牙前，戴著無菌手套用無菌牙簽在研 究對(duì)象磨牙及磨牙鄰間隙內(nèi)刮取牙菌斑，刮取后及時(shí)置入含滅菌PBS的無菌EP管中，立即用 封口膜密封管口，以防交叉污染。
[0038]樣品收集結(jié)束后，立即將樣品置于沸水煮沸25min，沸水浴的過程中要小心，勿讓 沸水進(jìn)入到無菌EP管中。防止在煮沸的過程中無菌EP管崩開。煮沸后，封口膜封口，4°C保存 備用。
[0039] 實(shí)施例3靶基因的確定及引物設(shè)計(jì)
[0040] 將幽門螺桿菌鐵蛋白基因作為本研究PCR檢測(cè)方法的靶基因，所述的基因片段的 基因序列為SEQ ID No. 1 ：
[0041] ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACATGTC CATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAGTACG AGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCCAGAG CACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCAACAA CATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAACACG AGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTTGGCT GACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCCo
[0042]根據(jù)所述的基因序列設(shè)計(jì)引物，正向引物FSW-
[0043] TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3';反向引物R為 j'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-37 〇
[0044] 實(shí)施例4PCR檢測(cè)方法體系組成及反應(yīng)程序的確定
[0045]所述的PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)體系如下：5yL菌液模板，2.5yL IOX PCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，濃度均為20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL， 0.5yL的TaqDNA聚合酶，其余為無菌三蒸水。
[0046] 所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán)：94°C變性30s;58°C退火 30s; 72 °C延伸40s;分別運(yùn)行29個(gè)循環(huán)，72 °C終延伸IOmin。
[0047]實(shí)施例5最適退火溫度的摸索
[0048] 取已處理過的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)需要陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(含有外源轉(zhuǎn)入HP 鐵蛋白的大腸桿菌DH5a菌液模板作陽性對(duì)照）^CR反應(yīng)體系見表2和表3。
[0049]表2陽性菌液和樣品PCR反應(yīng)體系
L 〇〇53j 將上還PCR谷組分分別加人火菌EP営中進(jìn)仃瞬時(shí)離心混習(xí)，在PCR擴(kuò)增儀上執(zhí)行以 下反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán):94°C，30s; 55 °C、56 °C、57°C、58°C，30s; 72°C， 40s;運(yùn)行29個(gè)循環(huán)，72°C終延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物各5yL，用1.0%瓊脂糖凝膠 (含〇.5ygAiL EB)進(jìn)行電泳檢測(cè)。最后在紫外線凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，確定最適的退火 溫度。
[0054]紫外凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果見圖3,結(jié)果顯示退火溫度在58°C時(shí)，目的條帶最亮，故確 定最適退火溫度為58 °C。
[0055]實(shí)施例6最適循環(huán)次數(shù)的確定
[0056] 取已處理過的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)需要陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(含有外源轉(zhuǎn)入HP 鐵蛋白的大腸桿菌DH5a菌液模板作陽性對(duì)照）^CR反應(yīng)體系見表4和表5。
[0057]表4菌液模板和樣品PCR反應(yīng)體系
[0061 ]將上述PCR各組分分別加入滅菌EP管中進(jìn)行瞬時(shí)離心混勻，在PCR擴(kuò)增儀上執(zhí)行以 下反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán):94°C，30s;上述確定的最適退火溫度，30s; 72 °(：，408;分別運(yùn)行25、26、27、28、29、30個(gè)循環(huán)，72°(：終延伸101^11。反應(yīng)結(jié)束后，取?〇?產(chǎn)物各 5yL，用1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5ygAiL EB)進(jìn)行電泳檢測(cè)，確定最適的循環(huán)次數(shù)。
[0062]結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明循環(huán)次數(shù)在29個(gè)和30個(gè)時(shí)目的條帶都符合要求，相對(duì)來 說循環(huán)次數(shù)越低，PCR擴(kuò)增效果越好，故確定最合適的循環(huán)次數(shù)為29次。
[0063]實(shí)施例7陽性模板量的確定
[0064]將IO5~101()不同稀釋梯度下的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)需要陰性對(duì)照和陽性樣品 做參比。PCR反應(yīng)體系見表6和表7。
[0065] 表6菌液和樣品PCR反應(yīng)體系
[0069] 將上述PCR各組分分別加入滅菌EP管中進(jìn)行瞬時(shí)離心混勻，在PCR擴(kuò)增儀上執(zhí)行以 下反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán):94°C，30s;上述確定的最適退火溫度，30s; 72 °C，40s;運(yùn)行上述確定的最適循環(huán)次數(shù)，72°C終延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物各5yL， 用1.0%瓊脂糖凝膠(含〇.5ygAiL EB)進(jìn)行電泳檢測(cè)。紫外線凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，將 不同稀釋梯度下的成像條帶和樣品成像條帶進(jìn)行對(duì)比，以確定最適稀釋梯度下的菌液為本 研究的陽性模板，用來做陽性對(duì)照。
[0070] 結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明IO7條帶與陽性樣品含量最為相近，故確定陽性對(duì)照菌 液的最適稀釋梯度在IO 7。
[0071] 實(shí)施例8樣品PCR擴(kuò)增檢測(cè)
[0072]將已處理過的所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要陰性對(duì)照和已確定的陽性模板作為陽 性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系見表8和表9。
[0073]表8樣品和陽性模板PCR反應(yīng)體系
[0077]將PCR各組分分別加入滅菌的EP管中進(jìn)行瞬時(shí)離心混勻，在PCR擴(kuò)增儀上執(zhí)行以下 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán)：94°C，30s ;上述確定的最適退火溫度，30s; 72 °C，40s;運(yùn)行已確定的最適循環(huán)次數(shù)，72°C終延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物各5yL，用 1.0%瓊脂糖凝膠(含〇.5ygAiL EB)進(jìn)行電泳檢測(cè)。最后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。
[0078]紫外凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果如圖6~14,在分子量約500bp處出現(xiàn)了特異的核酸條帶， 與理論值500bp基本相符，陽性率達(dá)到82%。
[0079]實(shí)施例9PCR方法靈敏度的檢測(cè)
[0080] 將IO5~101()的不同稀釋梯度下的菌液用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增后檢測(cè)，以確定此檢測(cè)方 法的靈敏度，過程與實(shí)施例8相同。
[0081] 結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明此檢測(cè)方法靈敏度高，可以檢測(cè)最低限度為llCFU/mL。
[0082] 實(shí)施例1OPCR方法特異性的檢測(cè)
[0083]分別用酵母菌、金黃葡萄球菌、大腸桿菌、小鼠血清和人血清進(jìn)行PCR檢測(cè)方法特 異性的檢測(cè)，觀察PCR產(chǎn)物中是否有此鐵蛋白基因的存在。
[0084]結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明此檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，只能用于檢測(cè)幽門螺桿菌。
[0085]實(shí)施例1lPCR方法重復(fù)性的檢測(cè)
[0086]應(yīng)用本研究建立的PCR方法，重復(fù)5次檢測(cè)陽性樣品，觀察5次PCR檢測(cè)結(jié)果是否一 致，據(jù)此判斷本研究建立的PCR方法的重復(fù)性。
[0087]結(jié)果表明重復(fù)5次檢測(cè)陽性樣品，檢測(cè)結(jié)果一致，結(jié)果表明此檢測(cè)方法重復(fù)性好。 [0088]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法，其特征是：以幽門螺桿菌鐵蛋白基因?yàn)闄z測(cè)靶基 因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，具體包括以下步驟： 樣品的采集:樣品來源于口腔唾液和牙菌斑;早晨空腹未刷牙前，研究對(duì)象戴無菌手套 手持無菌EP管，向無菌EP管中收集唾液，及時(shí)用封口膜密封管口，以防交叉污染； 樣品的處理:樣品收集結(jié)束后，立即將樣品置于沸水煮沸25min，沸水浴的過程中勿讓 沸水進(jìn)入無菌EP管中；煮沸后，封口膜封口，置于4°C保存?zhèn)溆茫? 普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)體系如下：5yL菌液模板，2.5yL 10 X PCRBuffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，濃度均為20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5 yL的TaqDNA聚合酶，其余為無菌三蒸水； 其中，正向引物F為：5' -TTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTG-3' 反向引物R為 A'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的幽門螺桿菌目的基因?yàn)殍F 蛋白基因，基因片段為SEQ ID No. 1: ATGTTGTCCAAGGACATCATCAAGTTGTTGAACGAGCAAGTTAACAAGGAGATGCAATCCTCCAACTTGTACA TGTCCATGTCCTCCTGGTGTTACACTCACTCCTTGGACGGTGCTGGTTTGTTCTTGTTCGACCACGCTGCTGAGGAG TACGAGCACGCTAAGAAGTTGATCATCTTCTTGAACGAGAACAACGTTCCAGTTCAATTGACTTCCATCTCCGCTCC AGAGCACAAGTTCGAGGGTTTGACTCAAATCTTCCAAAAGGCTTACGAGCACGAGCAACACATCTCCGAGTCCATCA ACAACATCGTTGACCACGCTATCAAGTCCAAGGACCACGCTACTTTCAACTTCTTGCAATGGTACGTTGCTGAGCAA CACGAGGAGGAGGTTTTGTTCAAGGACATCTTGGACAAGATCGAGTTGATCGGTAACGAGAACCACGGTTTGTACTT GGCTGACCAATACGTTAAGGGTATCGCTAAGTCCCGTAAGTCC〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)程序 為:94°C預(yù)變性5min，進(jìn)行以下循環(huán):94°C變性30s;58°C退火30s;72°C延伸40s;分別運(yùn)行29 個(gè)循環(huán)，72°C終延伸lOmin。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法，其特征在于:該方法包括以下步驟： (1) 樣品的采集:樣品來源于口腔唾液和牙菌斑； (2) 樣品的處理:樣品收集結(jié)束后，立即將樣品置于沸水煮沸25min，煮沸后，封口膜封 口，置于4 °C保存?zhèn)溆茫? 其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25yL，反應(yīng)體系如下：5yL菌液模板，2.5yL 10 X PCR Buffer，2yL dNTP(2.5mmol/L)，濃度均為20ymol/L的正向引物和反向引物各0.5yL，0.5yL 的TaqDNA聚合酶，其余為無菌三蒸水； 其中，正向引物F為：5'-TTGTCCAAG GACATCATCAAGTTGTTG-3'; 反向引物R為 A'-GGA CTT ACG GGA CTT GGC GAT GCC-3'。6. 根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的口腔中幽門螺桿菌PCR檢測(cè)方法，其特征在于：陽性 菌液的最適稀釋梯度是1 〇7，檢測(cè)幽門螺桿菌的極限是6 X 108CFU/mL。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086213SQ201610650387
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月9日 公開號(hào)201610650387.4, CN 106086213 A, CN 106086213A, CN 201610650387, CN-A-106086213, CN106086213 A, CN106086213A, CN201610650387, CN201610650387.4
【發(fā)明人】朱艷平, 岳鋒, 何勇, 李鵬, 孫國(guó)鵬, 張艷芳, 邢瑞林, 徐文慧
【申請(qǐng)人】新鄉(xiāng)學(xué)院