一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體，通過將雙HA標簽序列片段與具有Gateway閱讀框B片段的載體pART27-35Sa-GWB連接得到并在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化表達。本發(fā)明構(gòu)建方法所得表達載體可以用于克隆的目的基因或其他來源的目的DNA片段的功能分析和蛋白表達，其方法具有快速、靈活、高效、省時、省力等優(yōu)點，在基因功能研究方面有重要意義。
【專利說明】—種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]Gateway技術(shù)是由Invitrogen公司開發(fā)的進行基因克隆的一項新技術(shù),是一種快速、高效的大規(guī)?？寺∠到y(tǒng)，與傳統(tǒng)方法相比，對載體和宿主沒有依賴性。
[0003]Gateway技術(shù)原理是建立在噬菌體DNA定點整合到細菌宿主基因組上。在噬菌體和細菌的整合因子(INF、Int)的作用下，lambda噬菌體的attP位點和大腸桿菌基因組的attB位點可以發(fā)生定點重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個新位點:attL和attR。Gateway技術(shù)可以方便快捷地克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)載體構(gòu)建過程中需進行的多次酶切和連接反應的繁瑣操作步驟及酶切位點的限制等缺點，同時典型的克隆效率高達90%或更高。當基因在目的表達載體之間快速簡便的穿梭時，還可以保證正確的方向和閱讀框。
[0004]Gateway技術(shù)主要包括2個反應(參考附圖1) =BP反應和LR反應。BP反應是創(chuàng)建入門克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將兩端攜帶attB位點的目的基因克隆進入門載體。LR反應是將包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體進行重組，構(gòu)建表達克隆。入門載體目的基因兩端具有attLl和attL2重組位點，目的載體上具有attRl和attR2重組位點，在LR Clonase II的作用下，兩個載體間發(fā)生定向重組，從而將目的基因連接到目的載體上。另外，Gateway重組技術(shù)利用了 ccdB致死基因。ccdB蛋白干擾大腸桿菌DNA促旋酶，抑制大腸桿菌大部分菌株的生長(例如DH5 α和TOPlO菌株)。由于ccdB蛋白的致死作用，只有攜帶重組成功的目的載體的克隆才能生長，而入門載體或未重組的目的載體克隆由于帶有ccdB致死基因而不能生長，極大地降低了高背景的缺點，減少篩選時間。同時，結(jié)合抗生素篩選，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物重組率可高達90%以上。目前該技術(shù)已廣泛用于基因的克隆和表達載體的構(gòu)建。
[0005]與Gateway技術(shù)兼容載體系統(tǒng)已開始應用于植物功能基因組的研究,但應用這些載體系統(tǒng)的一個瓶頸問題是如何簡單、經(jīng)濟和高效地將PCR產(chǎn)物或其他來源的目的DNA片段構(gòu)建到入門載體上獲得入門克隆。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開了一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體，其構(gòu)建方法將傳統(tǒng)的TA克隆技術(shù)與Gateway重組克隆技術(shù)進行整合,構(gòu)建了與Gateway技術(shù)兼容的目的克隆表達載體，用于克隆的目的基因或其他來源的目的DNA片段的功能分析和蛋白表達。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0008]—種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體的構(gòu)建方法,構(gòu)建方法包括下述步驟:
[0009]I)使用限制性內(nèi)切酶Not I分別酶切pART7載體質(zhì)粒DNA和pART27雙元載體質(zhì)粒DNA，將pART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段插入到pART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa載體質(zhì)粒DNA ;將該pART27_35Sa載體質(zhì)粒DNA通過限制性內(nèi)切酶Sma I進行酶切，插入Gateway閱讀框B片段，得到表達載體pART27-35Sa_GWB ；
[0010]其中，PART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段按照花椰菜花葉病毒35S啟動子和章魚堿合成酶基因3非編碼區(qū)與報告基因NPTII方向相同的順序插入到PART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa載體。
[0011]2)使用引物從表達載體PART7-DHA中擴增出90bp的雙HA標簽序列片段:5_AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3 ；
[0012]通過引入上述標簽序列可有效用于蛋白表達分析。
[0013]上述所得的雙HA標簽序列片段，對應的氨基酸序列為KLGGTGGSYPYDVPHYAGYPYDVPDYA-SR，其中HA抗原(YPYDVPDYA)的串聯(lián)重復前放置有隨機線圈序列(GGTGGS)。
[0014]其中，所用的特定引物序列如下:
[0015]PRl:
[0016]5-ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA-3 ；
[0017]PR2:
[0018]5-ATTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGGTAACCAGCGTAGTCTGGAACGT-3。
[0019]3)將雙HA片段和pART27-35Sa-GWB分別用HindIII和Xba I進行雙酶切后連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進行表達和篩選，從陽性克隆中提取質(zhì)粒DNA進行酶切和測序驗證，獲得用于Gateway克隆的表達載體pART27-35Sa-GWB_DHA。
[0020]相應的，本發(fā)明還公開了一種用于Gateway克隆的表達載體的構(gòu)建方法，如上所述。
[0021]通過上述方法，本發(fā)明得以得到一種用于Gateway克隆表達載體，該載體可作為Gateway克隆過程中的入門載體，該方法具有快速、靈活、高效、省時、省力等優(yōu)點，可用于多種基因功能研究和蛋白表達分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為Gateway克隆技術(shù)的流程示意圖；
[0023]圖2a、2b、2c、2d、2e、2f分別本發(fā)明表達載體的構(gòu)建方法各流程階段生成的質(zhì)粒或所插入的序列，依次為PART7載體質(zhì)粒、pART27雙元載體質(zhì)粒、pART27_35Sa載體質(zhì)粒、Gateway轉(zhuǎn)換盒閱讀框B、pART27-35Sa_GWB載體、雙HA標簽序列片段、pART27-35Sa-GWB-DHA 表達載體。

【具體實施方式】
[0024]在下述實施例中，所用質(zhì)粒和酶均可從生物制劑公司購買，GatewayKit可從Invitrogen公司購買。
[0025]參考圖2a_2f，本發(fā)明通過該過程獲得Gateway克隆表達載體:
[0026]1.將50-100叩的？六町7載體質(zhì)粒0嫩與0.5-14 1^限制性內(nèi)切酶吣七I混合，37°C保溫2h進行酶切，獲得一個表達片段。
[0027]2.把50-100ng雙元載體pART27質(zhì)粒DNA用0.5-1 μ L限制性內(nèi)切酶Not I酶切，將上述步驟I所得片段插入到酶切后的PART27中，構(gòu)建pART27-35Sa，在該載體中，花椰菜花葉病毒35S啟動子和章魚堿合成酶基因3'非編碼區(qū)與報告基因NPT II的方向相同。
[0028]3.將 50-100ng 的 pART27_35Sa 質(zhì)粒 DNA 與 0.5-1 μ L 限制性內(nèi)切酶 Sma I 混合，37°C保溫2h進行酶切。
[0029]4.把Gateway轉(zhuǎn)換盒的閱讀框B插入到酶切后的pART27_35Sa，獲得表達載體pART27-35Sa-GWB。
[0030]5.以
[0031]PRl:5 ' -ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA_3 ；
[0032]PR2:5 ' -ATTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGGTAACCAGCGTAGTCTGGAACGT-3為引物，從表達載體PART7-DHA中擴增得到I個90bp雙HA (Double HA)標簽序列片段，如下所示:
[0033]5-AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3。
[0034]6.將雙HA片段和pART27-35Sa-GWB分別用HindIII和Xba I進行雙酶切，純化后的DNA由T4連接酶連接。
[0035]7.上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl，在含20 μ g / mL卡那霉素的LB平板上進行篩選，挑選陽性克隆進行質(zhì)粒DNA提取。
[0036]8.通過BamH I酶切和pART7R04引物測序確定，獲得適用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體 pART27-35Sa-GWB-DHA。
【權(quán)利要求】
1.一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達載體，其特征在于其構(gòu)建方法包括下述步驟: 1)使用限制性內(nèi)切酶NotI分別酶切pART7載體質(zhì)粒DNA和pART27雙元載體質(zhì)粒DNA，將pART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段插入到pART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa載體質(zhì)粒DNA ;將該pART27_35Sa載體質(zhì)粒DNA通過限制性內(nèi)切酶Sma I進行酶切，插入Gateway閱讀框B片段，得到表達載體pART27-35Sa_GWB ； 2)使用引物從表達載體PART7-DHA中擴增出90bp的雙HA標簽序列片段:5_AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3 ； 3)將雙HA片段和pART27-35Sa-GWB分別用Hindlll和XbaI進行雙酶切后連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進行表達和篩選，從陽性克隆中提取質(zhì)粒DNA進行酶切和測序，獲得用于Gateway 克隆的表達載體 pART27-35Sa-GWB_DHA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于所述步驟1)的將PART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段按照花椰菜花葉病毒35S啟動子和章魚堿合成酶基因3非編碼區(qū)與報告基因NPTII方向相同的順序插入到PART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27_35Sa載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于所述步驟1)的把Gateway閱讀框B片段插入到pART27-35Sa載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到表達載體pART27_35Sa_GWB。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于所述步驟2)的引物序列為
PR1:
5-ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA-3 ；
PR2:
5-ATTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGGTAACCAGCGTAGTCTGGAACGT-3。
【文檔編號】C12N15/63GK104250653SQ201410098146
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】高俊山, 吳楠, 巫飛飛, 孟艷, 蔡永萍, 林毅 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學