一種檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。本發(fā)明公開(kāi)的一對(duì)引物，由SEQ?ID?No.1所示的DNA分子和SEQ?ID?No.2所示的DNA分子組成。本發(fā)明公開(kāi)的方法是一種快速、準(zhǔn)確、高效的黃萎病抗性分子診斷體系，為大白菜抗黃萎病資源篩選和抗性轉(zhuǎn)育奠定了良好基礎(chǔ)；此外，該方法還可用于大白菜黃萎病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，對(duì)于大白菜的安全生產(chǎn)具有重要意義。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃萎病多是由黃萎輪枝菌屬的大麗輪枝菌、黑白輪枝菌從根部侵染引起的土傳維管束病害，該病的寄主范圍廣，存在不同的生理小種，其微菌核在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)，具有高度抵抗不良環(huán)境的能力，防治難度大，目前已對(duì)棉花、番茄、辣椒、茄子等多種作物造成嚴(yán)重影響，被稱為植物的“癌癥”。
[0003]大白菜屬十字花科蕓薹屬，是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物，目前已逐漸成為世界性的蔬菜作物。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，我國(guó)大白菜年種植面積近4000萬(wàn)畝，占蔬菜總播種面積的15%左右，可見(jiàn)大白菜在我國(guó)菜籃子工程中舉足輕重。目前對(duì)大白菜病害的研究多集中在病毒病、軟腐病、霜霉病三大病害上，而近年來(lái)在北京和一些大規(guī)模大白菜生產(chǎn)基地發(fā)生了十分嚴(yán)重的黃萎病，并呈逐年上升趨勢(shì)。研究表明該病害是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的白菜黃萎病，此病害在包心期開(kāi)始發(fā)病，其癥狀表現(xiàn)為葉片枯黃，植株矮化，維管束變褐變黑，嚴(yán)重時(shí)則會(huì)導(dǎo)致白菜絕產(chǎn)。
[0004]傳統(tǒng)的寄主抗病性鑒定一般是采用溫室人工接種鑒定和田間病圃鑒定，但易受環(huán)境條件、人為因素和非目標(biāo)病原菌的影響，給鑒定結(jié)果帶來(lái)一定誤差。黃萎病發(fā)生時(shí)，最早出現(xiàn)的癥狀是基部葉片變黃，進(jìn)一步發(fā)展是葉片出現(xiàn)枯斑，生長(zhǎng)遲緩，萎蔫，葉片脫落，最后維管束系統(tǒng)變褐色。黃萎病人工接種抗病性鑒定，一般在三葉期，采用蘸根接種法，由于白菜幼苗木質(zhì)化水平低，接種黃萎病菌后緩苗慢，葉片也容易出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，給黃萎病癥狀的區(qū)分帶來(lái)很大的困難。因此，`要在早期對(duì)白菜育種材料的黃萎病抗性進(jìn)行鑒定，必須建立一種簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的病原菌檢測(cè)技術(shù)。
[0005]在病原菌檢測(cè)方法中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已廣泛運(yùn)用于植物病原菌及植物病毒的檢測(cè)。該方法利用特異性引物來(lái)擴(kuò)增植物材料中目標(biāo)物的DNA，能較為準(zhǔn)確地檢測(cè)不同組織、不同材料中病原菌的相對(duì)含量。Gayoso等應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了被大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)侵染的辣椒和番爺中的病原菌含量，發(fā)現(xiàn)感病植株中病菌的相對(duì)含量高于抗病植株，并且不同基因型的植株所表現(xiàn)病癥的嚴(yán)重程度與植株體內(nèi)病原菌的相對(duì)含量有相關(guān)性。Dan等利用馬鈴薯植株中病原菌DNA含量的多少來(lái)評(píng)價(jià)植株對(duì)黃萎病的抗感水平。傳統(tǒng)病原菌含量檢測(cè)通常采用菌落計(jì)數(shù)法，例如NP-10平板檢測(cè)法，但是該方法從病株中分離病原菌大概需要耗時(shí)兩周，因此不能用于大批量的檢測(cè)實(shí)踐；其次該方法不能有效的區(qū)分大麗輪枝菌的近緣種。與傳統(tǒng)病原菌檢測(cè)方法相比，qRT-PCR技術(shù)具有靈敏、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)。具體優(yōu)點(diǎn)如下:
[0006]1.檢測(cè)的特異性。可有效的區(qū)分大麗輪枝菌的近緣種。真菌在rDNA-1TS區(qū)段在種內(nèi)具有高度的保守性，在屬間或種間又存在著廣泛的多態(tài)性，已被廣泛用于病菌的分類鑒定、監(jiān)測(cè)及病害診斷等。
[0007]2.檢測(cè)的靈敏性。檢測(cè)的最低值可達(dá)到5X l(T3ng.μ L'[0008]3.檢測(cè)的快速性。從樣品準(zhǔn)備到DNA提取再到利用real-time PCR技術(shù)獲得病原菌含量的總時(shí)間不超過(guò)8小時(shí)。
[0009]4.檢測(cè)的高通量性。利用羅氏公司LightCycler480PCR儀的384模塊，50分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)384個(gè)樣本病原菌的準(zhǔn)確定量。
[0010]5.檢測(cè)材料生長(zhǎng)時(shí)間的廣泛性。該技術(shù)能夠檢測(cè)從白菜幼苗到成株的任意時(shí)期的黃萎病原菌感染情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
[0012]本發(fā)明提供的一對(duì)引物，由SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子組成。
[0013]一種定量檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含上述引物對(duì)。
[0014]上述試劑盒中，所述大白菜黃萎病病原菌為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，具體為大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2。
[0015]一種定量檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法包括如下步驟:
[0016](I)將提取的黃萎病病原菌標(biāo)準(zhǔn)品的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的黃萎病病原菌的DNA，以其為模板，以SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以模板濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以每個(gè)反應(yīng)孔的熒光值達(dá)到所設(shè)閾值經(jīng)歷的循環(huán) 數(shù)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式I ;
[0017](2)將提取的未染任何病菌的大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA進(jìn)行兩倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的樣品的DNA，以其為模板，以擴(kuò)增GAPDH的引物為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以模板濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以每個(gè)反應(yīng)孔的熒光值達(dá)到所設(shè)閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2 ；
[0018](3)以待檢大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到循環(huán)數(shù)CP1，將CPl值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式1，得到待檢大白菜中大白菜黃萎病病原菌的絕對(duì)含量；以待檢大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA為模板，以GAPDH引物為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到循環(huán)數(shù)CP2，將CP2值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2，得到待檢樣品的GAPDH絕對(duì)含量；待檢大白菜內(nèi)黃萎病病原菌的相對(duì)含量=待檢大白菜中大白菜黃萎病病原菌的絕對(duì)含量/GAPDH絕對(duì)含量。
[0019]上述方法中，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的PCR反應(yīng)體系如下:實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增緩沖液(2X)5yL，濃度為IOyM的引物各lyL，模板3yL;
[0020]所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增緩沖液(2X)的商品名稱為SYBR Green IMaster (2 X),來(lái)自LightCycler? 480cSYBR Green I Master 試劑盒，該試劑盒購(gòu)自羅氏公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為04887352001 ；
[0021]PCR 程序如 下:預(yù)變性 95°C，5min ;95°C變性 30s，60°C 復(fù)性 30s，72°C延伸 50s, 40個(gè)循環(huán)；[0022]熔解曲線制作程序:95°C 5s, 65°C 60s，每IOs溫度遞升0.5°C到97°C結(jié)束，連續(xù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0023]上述任一所述的方法中，所述步驟(1)中提取的黃萎病病原菌BCHW10-2的DNA濃度為 50ng.μ I71 ;
[0024]所述步驟(2)中提取的大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA濃度為200ng.μ L—1 ;
[0025]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式I為Υ=-3.553Χ+10.04 ；
[0026]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2為Υ=-3.193Χ+23.22。
[0027]上述任一所述的方法中，所述黃萎病病原菌為大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2。
[0028]上述引物對(duì)在檢測(cè)大白菜中的大白菜黃萎病病原菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0029]或，
[0030]上述引物對(duì)在檢測(cè)大白菜是否感染大白菜黃萎病病原菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]上述試劑盒在檢測(cè)大白菜中的大白菜黃萎病病原菌的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0032]或，
[0033]上述試劑盒在檢測(cè)大白菜是否感染`大白菜黃萎病病原菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]上述任一所述的應(yīng)用中，所述大白菜黃萎病病原菌為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，具體為大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2。
[0035]黃萎病已發(fā)展成為大白菜生產(chǎn)中重要的土傳病害之一，挖掘抗病基因資源，培育穩(wěn)定、持久抗病品種，是防止大白菜黃萎病大面積流行的有效途徑。本發(fā)明提供的方法是一種快速、準(zhǔn)確、高效的黃萎病抗性分子診斷體系，為大白菜抗黃萎病資源篩選和抗性轉(zhuǎn)育奠定了良好基礎(chǔ)；此外，該方法還可用于黃萎病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，對(duì)于大白菜的安全生產(chǎn)具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為引物的特異性檢測(cè)結(jié)果。
[0037]圖2為引物的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。
[0038]圖3為大白菜人工接種黃萎病病原菌的發(fā)病情況。
[0039]圖4為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)人工接種黃萎病病原菌的材料的鑒定。
[0040]圖5為大白菜黃萎病田間發(fā)病情況及利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的鑒定。
[0041]圖6為擴(kuò)增黃萎病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0042]圖7為擴(kuò)增大白菜基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0043]圖8為引物HWl和GAPDH的擴(kuò)增熔解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0045]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。[0046]大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2 (Verticillium dahliae)在文獻(xiàn)“韓瑞娟，耿麗華，汪維紅，于拴倉(cāng)，朱月林，張鳳蘭，余陽(yáng)俊，趙岫云，張德雙.北京地區(qū)大白菜黃萎病的病原鑒定.《園藝學(xué)報(bào)》2012年第03期”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，該菌屬于大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)。
[0047]UghtGyeler.? 480cSYBR Green I Master試劑盒購(gòu)自羅氏公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為04887352001。
[0048]大白菜霜霉菌(Hyaloperonosporaparasitica Constant.(Pers.ex Fr.))在文獻(xiàn)“李慧，于拴倉(cāng)，張鳳蘭，余陽(yáng)俊，趙岫云，張德雙，趙湘.與大白菜霜霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā).HEREDITAS (2011)，33(11):1271 — 1278”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0049]GAPDH引物在文獻(xiàn)“Qi J N, Yu S C，Zhang F L, et al.Reference Gene Selectionfor Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction of mRNA TranscriptLevels in Chinese Cabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)[J].Plant Mol BiolRep, 2010，28:597 - 604” 中公開(kāi)過(guò)。
[0050]實(shí)施例1、引物設(shè)計(jì)
[0051]一、引物設(shè)計(jì)
[0052]根據(jù)黃萎病病原菌特異的rDNA-1TS序列(NCBI登錄號(hào)為JN564038)設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物如下:
[0053]HWl-F:5，-GTTACAGCTCGCATCGGAGT-3，(SEQ ID N0.1)
[0054]HWl-R:5’ -CAGCGGGTATTCCTACCTGA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0055]擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為IO`Obp。
[0056]二、引物特異性和靈敏度檢測(cè)
[0057](一)引物特異性檢測(cè)
[0058]提取未感染大白菜黃萎病病原菌的大白菜的葉片組織，感染大白菜霜霉菌的大白菜的葉片組織，大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2，感染大白菜黃萎病病原菌的大白菜的病葉、病莖部和病根的DNA，并以ddH20為空白對(duì)照。
[0059]分別以上述提取的DNA為模板，HWl-F和HWl-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，各產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示。
[0060]圖1中，M為DNA marker ； I模板為ddH20 ； 2模板來(lái)自健株(未感染大白菜黃萎病病原菌的大白菜)；3模板來(lái)自感染大白菜霜霉菌的大白菜；4模板來(lái)自BCHW10-2 ;5、6、9模板來(lái)自病葉；7、10模板來(lái)自病莖部；8模板來(lái)自病根。
[0061]圖1表明，HWl-F和HWl-R對(duì)檢測(cè)出大白菜黃萎病病原菌具有特異性。
[0062](二)引物靈敏度檢測(cè)
[0063]采用羅氏LightCycIer? 480CSYBR Green I Master 試劑盒，以 BCHW10-2 標(biāo)準(zhǔn)菌
株的DNA為模板(濃度為50ng.μ L—1)，進(jìn)行十倍稀釋，得到5個(gè)梯度，以其為模板，以HWl-F和HWl-R為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
[0064]PCR 反應(yīng)體系(10yL):SYBR Green I Master (2 X) 5 μ L，HW1-F (濃度為10 μ M) IyL, HWl-R (濃度為 10 μ Μ) I μ L，模板 DNA3 μ L。[0065]PCR 程序:預(yù)變性 95°C，5min ;95°C變性 30s，60°C復(fù)性 30s，72°C延伸 50s，40 個(gè)循環(huán)。
[0066]結(jié)果如圖2所示。
[0067]圖2中，從左到右依次為1、10、100、1000、10000倍稀釋的菌液DNA為模板，進(jìn)行實(shí)
時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線。
[0068]圖2表明，30個(gè)循環(huán)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)的最低濃度為50ng.μ L-1 X 10-4，證明引物的
靈敏度好。
[0069]實(shí)施例2、熒光定量PCR方法檢測(cè)樣品中黃萎病病原菌
[0070]一、樣本準(zhǔn)備
[0071]溫室樣本:將生長(zhǎng)至三葉一心的各品種白菜的幼苗從營(yíng)養(yǎng)缽中拔出(自然傷根)，用大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2孢子懸浮液(濃度為I X IO7個(gè)/mL)浸幼苗根15分鐘，然后將幼苗重新種植于6X6cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，同時(shí)以接種無(wú)菌水為對(duì)照；分別在接種黃萎病病原菌2、3、4和5周后對(duì)接種病原菌的植物進(jìn)行取樣，以接無(wú)菌水的植株作為對(duì)照組。每組材料取5株，將根系、莖和葉片分開(kāi)保存，超低溫真空凍樣儀中凍干后備用。
[0072]田間樣本:在田間定植10周的各品種的白菜取其葉片作為樣品。
[0073]圖3為大白菜人工接種黃萎病病原菌BCHW10-2的發(fā)病情況，其中A1為V2_l品種接種無(wú)菌水2周后的植株;A2-A5分別為V2-1品種接種病原菌2、3、4、5周的植株辦為V2-2品種接種無(wú)菌水2周后的植株；B2-B5為V2-2品種接種病原菌2、3、4、5周的植株K1為V2-8品種接種無(wú)菌水2周后的植株；C2-C5為V2-8品種接種病原菌2、3、4、5周的植株辦為V2-9品種接種無(wú)菌水2周后的植株；D2-D5為V2-9品種接種病原菌2、3、4、5周的植株。
[0074]二、提取步驟一所得各樣本的DNA，并將濃度調(diào)整為200ng/ μ L。
[0075]三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
[0076]采用羅氏丨_ig|lt(;yelCT⑩480cSYBR Green I Master試劑盒，以步驟二提取的溫
室樣本各組織的DNA為模板，以HWl-F和HWl-R為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。
[0077]PCR 反應(yīng)體系(10yL):SYBR Green I Master (2 X) 5 μ L，HW1-F (濃度為10 μ M) IyL, HWl-R (濃度為 10 μ Μ) I μ L,模板 DNA (濃度為 200ng/ μ L) 3 μ L。
[0078]PCR 程序:預(yù)變性 95°C，5min ;95°C變性 30s，60°C復(fù)性 30s，72°C延伸 50s，40 個(gè)循環(huán)；
[0079]熔解曲線制作程序:95°C 5s, 65°C 60s，每IOs溫度遞升0.5°C到97°C結(jié)束，連續(xù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0080]溫室樣本的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。
[0081]圖4A-4D分別為人工接種黃萎病病原菌BCHW10-22、3、4、5周的植株。
[0082]圖4表明，采用熒光定量PCR技術(shù)，利用弓丨物HWl-F和HW1-R，檢測(cè)了四種大白菜自交系植株(V2-l、V2-2、V2-8和V2-9)體內(nèi)的大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2的含量，發(fā)現(xiàn)各植株中根和莖中的病菌含量明顯高于葉。
[0083]接病后第3周和第4周，葉片中大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2相對(duì)含量在抗感材料中表現(xiàn)出明顯差異，感病自交系V2-8和V2-9中的黃萎病病原菌含量明顯高于抗病自交系V2-1和V2-2，病菌含量由高到低的順序?yàn)閂2-8 > V2-9 > V2-1 > V2-2，這與黃萎病病癥觀察(圖3)所反映的病害嚴(yán)重程度一致，可見(jiàn)葉部病原菌的相對(duì)含量能夠準(zhǔn)確反映不同材料的抗性差異。
[0084]大白菜黃萎病田間發(fā)病情況及利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的鑒定結(jié)果分別如圖5所
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[0085]圖5中各數(shù)字代表發(fā)病情況不同的18個(gè)大白菜自交系。
[0086]圖5表明，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)得到的大白菜黃萎病田間發(fā)病各自交系大白菜黃萎病病菌BCHW10-2的含量結(jié)果與各大白菜田間發(fā)病情況基本一致。
[0087]四、定量檢測(cè)樣品中黃萎病病原菌的含量
[0088](一)擴(kuò)增黃萎病病原菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0089]以黃萎病病原菌BCHW10-2的DNA為模板，母液濃度為50ng.μ L—1，用CTAB/NaCl溶液(50g/L CTAB, 0.5mol/L NaCl，余量為水)按10倍梯度進(jìn)行稀釋(1,10-1，10_2，10_3和10_4倍)，得到各稀釋度的黃萎病病原菌BCHW10-2的DNA，以其為模板，按照步驟三的方法得到黃萎病病原菌BCHW10-2的熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以模板濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)管中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作黃萎病病原菌擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式I:Y=-3.553Χ+10.04。
[0090](二)擴(kuò)增大白菜基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0091]以大白菜葉片組織的基因組DNA為模板(濃度為200ng.μ L—1)，用CTAB/NaCl溶液(50g/L CTAB, 0.5mol/L NaCl，余量為水)按兩倍進(jìn)行稀釋(分別稀釋為原始濃度的1，
0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125)，以各稀釋度的DNA樣品為模板，按照步驟三的方法，將引物替換為GAPDH引物，得到大白菜基因組DNA的熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以模板濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)管中熒光`信號(hào)達(dá)到所設(shè)閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2:Y=-3.193Χ+23.22。
[0092]制作此曲線的目的是以三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)作為內(nèi)參基因，對(duì)樣品DNA濃度進(jìn)行均一化，
[0093](三)以大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2的DNA為模板，以HWl(HW1-F和HW1-R)為引物，以未感病的大白菜葉片的基因組DNA為模板，以GAPDH引物為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熔解曲線如圖8所示。
[0094]圖8表明，利用黃萎病病原菌特異引物HWl對(duì)大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，利用GAPDH引物對(duì)大白菜的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2和大白菜DNA的擴(kuò)增熔解曲線均具有銳利的單一峰，無(wú)引物二聚體的出現(xiàn)，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)合理，特異性較高；HW1和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值分別為80°C和86°C，二者具有明顯差異。
[0095](四)樣品中黃萎病病原菌含量的檢測(cè)
[0096]以待檢樣品的DNA為模板，分別以HWl引物對(duì)和GAPDH引物為引物，按照步驟三的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式I和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2分別得到樣品中的黃萎病病原菌和內(nèi)參基因(GAPDH)的絕對(duì)含量。
[0097]利用Lightcycler version2.0 (Roche Diagnostics)軟件的絕對(duì)定量模式分別分析樣品中黃萎病病原菌和內(nèi)參基因的含量，樣品內(nèi)黃萎病病原菌的相對(duì)含量=黃萎病病原菌DNA絕對(duì)含量/內(nèi)參基因DNA絕對(duì)含量。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS18.0, Sigmaplotl2.0和Excel2010軟件進(jìn)行。
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)引物，由SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子組成。
2.一種定量檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的試劑盒,該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述大白菜黃萎病病原菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae),具體為大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2。
4.一種定量檢測(cè)大白菜黃萎病病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法包括如下步驟: (1)將提取的黃萎病病原菌標(biāo)準(zhǔn)品的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的黃萎病病原菌的DNA，以其為模板，以SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以模板濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以每個(gè)反應(yīng)孔的熒光值達(dá)到所設(shè)閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式I ; (2)將提取的未染任何病菌的大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA進(jìn)行兩倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的樣品的DNA，以其為模板，以擴(kuò)增GAPDH的引物為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以模板濃度的Log值為橫坐標(biāo)，以每個(gè)反應(yīng)孔的熒光值達(dá)到所設(shè)閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2 ； (3)以待檢大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA為模板，以SEQID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N 0.2所示的DNA分子為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到循環(huán)數(shù)CP1，將CPl值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式1，得到待檢大白菜中大白菜黃萎病病原菌的絕對(duì)含量；以待檢大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA為模板，以GAPDH引物為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到循環(huán)數(shù)CP2，將CP2值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2，得到待檢樣品的GAPDH絕對(duì)含量；待檢大白菜內(nèi)黃萎病病原菌的相對(duì)含量=待檢大白菜中大白菜黃萎病病原菌的絕對(duì)含量/GAPDH絕對(duì)含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的PCR反應(yīng)體系如下:實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增緩沖液(2X)5yL，濃度為10 μ M的引物各I μ L，模板3 μ L ; 所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增緩沖液(2Χ)的商品名稱為SYBR Green I Master (2Χ),來(lái)SLightCycler?48()cSYBR Green I Master試劑盒，該試劑盒購(gòu)自羅氏公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 04887352001 ； PCR程序如下:預(yù)變性95°C，5min ;95°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸50s，40個(gè)循環(huán)； 熔解曲線制作程序:95°C 5s, 65°C 60s，每IOs溫度遞升0.5°C到97°C結(jié)束，連續(xù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中提取的黃萎病病原菌BCHW10-2 的 DNA 濃度為 50ng.μ 1 ; 所述步驟(2)中提取的大白菜的根、莖或葉組織的基因組DNA濃度為200ng.μ L—1 ; 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式I為Υ=_3.553Χ+10.04 ； 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式2為Υ=-3.193Χ+23.22。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法,其特征在于:所述黃萎病病原菌為大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2。
8.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在檢測(cè)大白菜中的大白菜黃萎病病原菌中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在檢測(cè)大白菜是否感染大白菜黃萎病病原菌中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測(cè)大白菜中的大白菜黃萎病病原菌的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測(cè)大白菜是否感染大白菜黃萎病病原菌中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述大白菜黃萎病病原菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahli ae),具體為大白菜黃萎病病原菌BCHW10-2。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882125SQ201410089841
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】于拴倉(cāng), 蘇同兵, 陳娟, 張鳳蘭, 汪維紅, 余陽(yáng)俊, 張德雙, 趙岫云 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院