一種水溶性抗生素的分離純化制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水溶性抗生素的分離純化制備方法。該方法包括九個步驟：(1)制備培養(yǎng)基；(2)制備發(fā)酵種子菌液；(3)擴大發(fā)酵的條件；(4)抗生素ZwA的第一次純化萃取法；(5)抗生素ZwA的第二次純化大孔樹脂法；(6)抗生素ZwA的第三次純化硅膠層析法；(7)高效液相色譜法純度檢測；(8)質(zhì)譜法分子量定性分析；(9)得到制備出包含分子量為364和382兩種分子結(jié)構(gòu)的水溶性抗生素的結(jié)論。本發(fā)明所制備的水溶性抗生素純度高，與蘇云金芽胞桿菌的CrylA、Cry1B、Cry1C等晶體蛋白協(xié)同作用可以提高對農(nóng)業(yè)害蟲的生物殺蟲效果；另外對大腸桿菌和引起小兒肺炎的金黃色葡萄球菌也有抑制效果。
【專利說明】一種水溶性抗生素的分離純化制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種水溶性抗生素的分離純化制備方法，該方法制備的水溶性抗生素含有364和382兩種分子量的分子結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0002]1994年Manker發(fā)現(xiàn)蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereusM編號UW85的菌株能夠生物合成抗生素，該抗生素水溶性極強，分子景為396,分子構(gòu)成C13H28N6O8,分子結(jié)構(gòu)如下:
【權(quán)利要求】
1.一種水溶性抗生素的分離純化制備方法，其特征在于具體步驟為: (1)制備培養(yǎng)基 1.1斜面培養(yǎng)基:牛肉膏3-6g，蛋白胨5-15g，氯化鈉3-7g，瓊脂粉10_20g，pH7.0-7.2，定容至1L, 121°C滅菌30min備用； 1.2菌株HD-1種子培養(yǎng)基:酵母膏3-7g，蠶蛹蛋白膏5-15 g，氯化鈉5_15 g，ρΗ7.0-7.2，定容至 1L，121°C 滅菌 30min 備用； 1.3初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10-30g，蠶蛹蛋白膏10-30g, CaCL2 0.05-0.10g, K2HPO4l-2g, MgSO4 0.1-0.3g, MnSO4 0.05-0.lg, pH 7.0-7.2，定容至 1L, 121°C滅菌 30min 備用； 1.4擴大生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基:蠶蛹蛋白膏7-1 lg，葡萄糖2-5g，氯化鈉l-4g，MgSO4.7H200.2-0.4g, K2HPO4 0.2-0.4g, MnSO4 0.02-0.07g, pH7.5，定容至 1L, 121°C 滅菌 30min 備用； 1.5供試菌活化培養(yǎng)基:牛肉膏2-8g，蛋白胨5-15g，氯化鈉2-8g，pH 7.0-7.2，定容至1L, 121°C滅菌 30min 備用； 1.6抑菌活性測定固體培養(yǎng)基:牛肉膏2-8 g，蛋白胨5-15 g，氯化鈉5-20 g，瓊脂粉10-20g，pH 7.0-7.2，定容至 1L，121°C 滅菌 30min 備用； (2)制備發(fā)酵種子菌液 首先，將保存于_20°C冰箱的甘油保藏菌種HD-1放到室溫復(fù)蘇，至完全解凍，將其接種到LB斜面培養(yǎng)基上，30°C過夜培養(yǎng)，取出后保存于4°C冰箱備用；然后，從保存好的HD-1斜面培養(yǎng)基上取0.5 cm X 1.0 cm大小的斜面培養(yǎng)物接種于300mL搖瓶中，內(nèi)含有種子培養(yǎng)基IOOmL,置于 220r/min 搖床 30°C培養(yǎng) 10-20 h ； .2.1菌株HD-1發(fā)酵液的制備 將活化好的HD-1種子培養(yǎng)基以2%的接種量接種到滅過菌的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不超過容器體積的2/3，30°C搖瓶培養(yǎng)20-40 h，然后，5000-10000r/min離心5_15min、收集上清，4°C冰箱保存，此過程有抗生素生物合成； . 2.2初次抑菌活性檢測 采用管碟法，以草生歐文氏桿菌為指示菌，檢測濃縮10倍后的HD-1發(fā)酵液上清液的抑菌活性，空白培養(yǎng)基作對照，將甘油保存的草生歐文氏桿菌菌種接種到活化培養(yǎng)基中，30°C搖瓶培養(yǎng)10-15h，然后2%的接種量將菌液加入到冷卻至45°C的抑菌活性測定固體培養(yǎng)基中，輕搖混勻，先在滅菌的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)加注無菌固體培養(yǎng)基作為底層，冷卻后擺放牛津環(huán)，再將混勻的加菌液的固體培養(yǎng)基輕輕加入到底層培養(yǎng)基上，雙層培養(yǎng)基都要薄而均勻，靜置冷卻后，用滅過菌的鑷子輕輕取下牛津環(huán)，在孔中加入待測液，液面和上層培養(yǎng)基面齊平，然后，在28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-15h，測其抑菌圈直徑大小，抑菌直徑為抑菌圈外徑減去牛津環(huán)外徑，在做抑菌試驗時，將上清液95°C水浴15min后，用lmol/L的NaOH調(diào)至中性或偏堿性，驗證抗生素的存在，由于ZwA的濃度與抑菌圈直徑存在線性關(guān)系，因此，將以抑菌圈的直徑來間接表示ZwA濃度； (3)擴大發(fā)酵的條件 .3.1發(fā)酵培養(yǎng)基:采用18L發(fā)酵罐培養(yǎng)，罐內(nèi)裝培養(yǎng)基不能超過體積的2/3，以5-15L為且； . 3.2發(fā)酵時間:將活化好的搖瓶種子培養(yǎng)基接種到擴大生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-40h ；.3.3培養(yǎng)溫度:將活化好的搖瓶種子培養(yǎng)基接種到擴大生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在200C -40°C恒溫下培養(yǎng)； .3.4培養(yǎng)基初始pH:將已接種的擴大生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，用lmol/L的HCl或lmol/L的NaOH 調(diào) pH 值 5.0-10.0 ； (4)抗生素ZwA的第一次純化萃取法 取IOL發(fā)酵液分批次5000-10000r/min離心，5_20min，回收上清液，用lmol/L的HCl調(diào)至PH4.0，在50°C下真空濃縮，真空度-0.095—0.088Mpa,濃縮至200mL，加入IOOmL無水乙醇，輕輕搖勻，靜置I小時后再次5000-10000r/min離心5_20min，取上清，上清液用等體積的石油醚萃取后，收集水相，至無醇味和石油醚味，加水補至原體積，即得ZwA粗提液，做抑囷試驗驗證ZwA的存在，之后保存于4 C冰箱備用； (5)抗生素ZwA的第二次純化大孔樹脂法 根據(jù)ZwA的水溶性強、弱極性等特點，選用非極性大孔樹脂LX-68M、LX-22、LX-762及LXA-8對ZwA進(jìn)行初步純化； . 5.1大孔樹脂預(yù)處理:稱取一定量的濕重樹脂，使用前均做預(yù)處理，流程如下，首先，將稱好的樹脂裝入玻璃層析柱中(60cmX2cm)，用2倍柱床體積的lmol/L的HCl溶液以ImL/min的流速對樹脂層進(jìn)行洗脫，并浸泡樹脂4h，然后用去離子水以同樣流速沖洗樹脂，至流出水pH呈中性；然后用2倍柱床體積的lmol/L的NaOH溶液以lmL/min的流速對樹脂層進(jìn)行洗脫，并浸泡樹脂4 h，用去離子水以同樣流速沖洗樹脂，至流出水pH呈中性；再用I倍柱床體積的乙醇浸泡樹脂6h ;用2倍柱床體積的乙醇以lmL/min的流速通過樹脂柱，再浸泡樹脂4h ;再用去離子水以同樣流速洗至無乙醇味為止； .5.2 ZwA的純化:按樹脂量與粗提液1:2(W/V)的比例，分別上樣10mL，濕法裝柱，室溫靜態(tài)吸附3h后，先用去離子水動態(tài)洗脫，洗脫體積初定4倍柱床體積，洗脫液為未吸附相，再用50%的乙醇洗脫4倍柱床體積，洗脫組分為A，再用無水乙醇洗脫4倍柱床體積，洗脫組分為B，洗脫時流速約0.5mL/min，分別收集洗脫液，減壓濃縮后去離子水定容至IOmLJiA和B分別做抑囷試驗驗證ZwA的存在，之后保存于4 C冰箱備用； (6)抗生素ZwA的第三次純化硅膠層析法 稱取100-140目硅膠150g，用無離子水浸泡3h，沖洗，抽干，再用濃鹽酸洗滌以除去殘留的雜質(zhì)，然后用去離子水洗至中性，抽干，再用無水乙醇浸泡過夜，抽干，臨用前120°C烘干至恒重，再用無離子水浸泡過夜即可裝60cmX 2cm層析柱； .6.1裝柱與ZwA的上樣:采用濕法裝柱，干法上柱；用無離子水將浸泡過夜的硅膠攪拌成勻漿，緩慢加入玻璃層析柱中，60cmX2cm層析柱，多余無離子水洗脫劑流出，上層加入4cm的石油醚，然后取5mL大孔樹脂第二次純化后的樣品ZwA，加入適量干硅膠攪拌至干粉狀，緩慢加入層析柱的上層石油醚液中，目的是使樣品暫時與洗脫劑分開，避免洗脫劑夾帶樣品快速流下，裝柱要確保層析柱均勻，實在、無氣泡、無斷層；柱床總高度約30-50cm ； .6.2 ZwA的純化:洗脫劑為乙酸乙酯:甲醇=70:30(V:V)，洗脫速度為0.5mL/min，用部分收集器分段收集，每管10mL，以紫外吸收法在線監(jiān)測ZwA樣品的紫外吸收出現(xiàn)，以2%茚三酮比色法在565nm波長下檢測ZwA樣品的顏色出現(xiàn)，直到無ZwA樣品的紫外吸收出現(xiàn)、無ZwA樣品的顏色出現(xiàn)時，終止洗脫，共收集30管，根據(jù)顏色一致性合并為10管，對各管溶液做抑囷試驗驗證ZwA的存在，之后保存于4 C冰箱備用；.6.3 ZwA樣品的冷凍干燥處理:使用冷凍干燥機對上述各管液體進(jìn)行冷凍干燥處理，冷凍干燥至無水成為干粉，之后保存于4°C冰箱備用； .6.4茚三酮比色反應(yīng) .6.4.1配置pH6.7的磷酸鹽緩沖溶液:分別稱取磷酸二氫鉀4.5350g和磷酸氫二鈉.11.9380g于小燒杯中，用少量去離子水溶解后，移入500ml容量瓶中，再用去離子水定容至刻度，搖勻備用，取55.0ml磷酸二氫鉀溶液與45.0ml磷酸氫二鈉溶液混合搖勻，即得到PH6.7的磷酸鹽緩沖溶液； . 6.4.2配置2%茚三酮顯色液:分別稱取2.0OOOg茚三酮和1.0OOOg氯化鉻，加入乙二醇緩慢加熱至完全溶解，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，再用磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度，搖勻，放置過夜，次日用，若有沉淀，過濾后使用； . 6.4.3顯色反應(yīng):取各管洗脫液分別0.5mL, 2%茚三酮0.5mL,磷酸鹽緩沖溶液lmL，于1OmL帶刻度試管中，搖勻后沸水浴15min,冷卻IOmin,用去離子水定容至IOmL,搖勻，穩(wěn)定15min后測量，以洗脫劑作空白對照，用紫外分光光度計先進(jìn)行全190-800nm波長掃描，確定其最大紫外吸收波長，然后測定各樣品在最大吸收波長下的吸光度A，繪制洗脫曲線； (7)高效液相色譜法純度檢測: .7.1檢測樣品制備:分別取6.3的干粉樣品，分別用I毫升無離子水溶解，備用； . 7.2高效液相色譜法檢測:將7.1的10個組分別做HPLC檢測，用面積歸一法分析其純度； 色譜條件:反相C18分析柱，流動相為水:甲醇=85:15(V/V)，紫外檢測器，檢測波長210nm,流度 0.5mL/min,進(jìn)樣量 10 μ L,柱溫 35°C ； .7.3再次用抑菌活性法檢測:采用管碟法，對7.1的10個組分進(jìn)行抑菌活性檢測，進(jìn)一步確定純化后ZwA的富集區(qū)段； (8)質(zhì)譜法分子量定性: 質(zhì)譜檢測:稱取0.01OOg，用質(zhì)譜檢測儀鑒定其分子量； 質(zhì)譜檢測條件:電噴霧離子源即ESI，毛細(xì)管電壓為3.5kV，錐孔電壓為150V，離子源溫度為100°C，干燥氣溫度為300°C，脫溶劑氣體流速500L/h，錐孔氣體流速為50L/h，水作溶劑； (9)結(jié)論: 由(8)質(zhì)譜分析圖確定，所制得的水溶性抗生素中含有364和382兩種分子量的分子結(jié)構(gòu)； 所述分子量為364的水溶性抗生素的分子結(jié)構(gòu)為:
【文檔編號】C12R1/18GK103805645SQ201410082586
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月9日
【發(fā)明者】郝再彬, 李霞, 嚴(yán)麗, 張 杰, 宋福平 申請人:桂林理工大學(xué)