靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)lpo的新型制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的新型制備工藝，構(gòu)建以轉(zhuǎn)硫酶A（TrxA）-組氨酸標(biāo)簽（His6-Tag）-SUMO蛋白酶識別底物為蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的輔助片段，以LHRH-PEA轉(zhuǎn)膜肽-ONC（簡稱為LPO）為目的片段的融合表達(dá)蛋白質(zhì)，并使這兩部分蛋白質(zhì)以正確的閱讀框架與載體正序相連并轉(zhuǎn)化進入表達(dá)菌種，最終構(gòu)建與表達(dá)六種物質(zhì)串聯(lián)的融合蛋白，粗提后，在咪唑存在下進行金屬螯合介質(zhì)純化，SUMO蛋白酶酶切，制備的LPO蛋白質(zhì)比常規(guī)方法制備的LPO蛋白對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、卵巢癌OVCAR3細(xì)胞、子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及肝癌HepG-2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系的抑制作用均有明顯的提高。
【專利說明】靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的新型制備工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的新型制備工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤(癌癥)業(yè)已成為人類生命的最大殺手。世界衛(wèi)生組織最新研究數(shù)據(jù)顯示，到2020年全球癌癥發(fā)病率將增加50%，即每年將新增1500萬癌癥患者。不僅如此，癌癥的死亡人數(shù)也在全球迅猛上升。2007年全球有760萬人死于癌癥，預(yù)計2030年這個數(shù)字將會增加到1320萬，據(jù)國家衛(wèi)生部發(fā)布的權(quán)威報告稱我國新發(fā)癌癥和因癌癥死亡病例數(shù)分別占全球的20%和24%。所以，惡性腫瘤的治療成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)的重要任務(wù)之一。
[0003]核糖核酸酶(RNase)普遍存在于自然環(huán)境和人體內(nèi)，它們可以通過降解細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸而殺死細(xì)胞。肝臟細(xì)胞內(nèi)大約含20余種核酸內(nèi)切酶和外切酶，它們參與RNA代謝、細(xì)胞成熟及凋亡、促進新生血管形成、主動防御RNA病毒等生物學(xué)作用。盡管核糖核酸酶大量存在，但由于核糖核酸酶抑制劑(RI)的抑制作用，體內(nèi)的RNase并未對組織細(xì)胞造成傷害。
[0004]RNase A超家族主要成員有RNase A、人胰臟核糖核酸酶、嗜曙紅細(xì)胞衍生神經(jīng)毒素、嗜曙紅陽離子蛋白、血管生成因子、牛精液核糖核酸酶和兩棲類核糖核酸酶(如豹蛙酶和牛蛙凝集素)等。RNase A超家族通過降解RNA發(fā)揮作用，其家族成員具有相似的氨基酸序列和三級結(jié)構(gòu)，一般含有4對二硫鍵(血管生成因子含有3對二硫鍵)，并且都含有相同的催化三聯(lián)體，包括2個組氨酸和I個賴氨酸。由于該家族的許多成員來源于人或哺乳動物，它們的免疫原性要比來源于植物或微生物的毒素復(fù)合物低。
[0005]在十九世紀(jì)70年代時，Shogen和Yoon最先在北極豹蛙的胚胎內(nèi)分離提出一些帶有抗癌活性的提取物。于1987年，提取物的主要活性成分被Alfacell M分離并且純化出來。那些活性物質(zhì)是一種小的(大約12kDa)母性起源(目前大量存在于未受精的卵母細(xì)胞中)的堿性蛋白。被稱為豹娃酶(ranpimase),后來正式命名為Onconase (簡稱0NC),它由104個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為1183?a，等電點為9.7，其序列與胰臟核糖核酸酶A (RNase A，EC 3.1.27.5)和核糖核酸酶超A家族的其他成員十分的相似，與RNaseA有30%的堿基序列同源，并且三級結(jié)構(gòu)相似，是已知的胰核糖核酸酶超家族成員中最小的單結(jié)構(gòu)域蛋白。單就核糖核酸酶活性而言，RNase A要高于豹蛙酶和牛精液核糖核酸酶(BS-RNase)，但由于受到RI的抑制，RNase A對腫瘤細(xì)胞沒有殺傷效果；兩棲類動物體內(nèi)的RNase A由于可以避開RI，故有殺傷腫瘤細(xì)胞作用。尤其是豹蛙酶，是首個進入III期臨床研究的核糖核酸酶類藥物，主要用于治療惡性間皮瘤，目前治療非小細(xì)胞肺癌的研究也已經(jīng)進入了臨床II期試驗階段。
[0006]ONC與已知的RNase A結(jié)構(gòu)相似，由2個反向平行的β片層和3個α螺旋結(jié)構(gòu)組成了的腎形核結(jié)構(gòu)，其酶活性中心是一個保守的催化三聯(lián)體。RobertF.Gahl等人在試驗中發(fā)現(xiàn)ONC氧化折疊過程中會形成穩(wěn)定的中間體，這樣可以保持它的有效活性形式。Daniel E.Holloway等報告了在IOOK電場和復(fù)雜硫酸根離子中，ONC的晶體結(jié)構(gòu),在一個質(zhì)量足夠大的電子密度圖中明顯的顯示出了幾個非平面的肽鍵，可以非常容易確定其活性中心的大多數(shù)殘基。
[0007]為了確定ONC蛋白質(zhì)中負(fù)責(zé)毒性的氨基酸殘基，You-Di Liao等人從染色體組克隆豹娃的rpr基因，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行了多種形式的表達(dá)。表達(dá)方法一:將甲硫氨酸排列在ONC重組體的N-末端，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組蛋白熱穩(wěn)定性減小且催化活性和抗原性降低。他們利用依賴內(nèi)源性大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶和apelB信號肽切割兩種方式生產(chǎn)了沒有甲硫氨酸的0NC，發(fā)現(xiàn)重組蛋白與天然來源的ONC的物理、化學(xué)、生物特性基本相符。同時證明在ONC的N-末端具有尿苷-鳥嘌呤底物偏愛性的焦谷氨酸，完整且外露的N-末端焦谷氨酸對豹蛙酶的細(xì)胞毒性有較大的幫助作用。
[0008]與RNase A相比，ONC特有的結(jié)構(gòu)特征是它N端的內(nèi)酰胺和C端的二硫鍵。豹蛙酶N端Gln反向折疊緊靠N端螺旋，與側(cè)鏈Lys9的氮基和C端β片層上Val96的羰基基團形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)。Didnato等證明將Met加到豹蛙酶N端后，突變體對所有RNA的催化作用和對腫瘤細(xì)胞的毒性都顯著降低，說明該環(huán)化結(jié)構(gòu)對豹蛙酶的核糖核酸酶活性和細(xì)胞毒性至關(guān)重要。整個蛋白分子含有4個二硫鍵，其中Cys87-Cysl04形成的C端二硫鍵只存在于兩棲類的RNase A中。ONC是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很強的蛋白，在pH6.0時變性溫度可以達(dá)到90°C，藥物體內(nèi)半衰期也可長達(dá)3h。除了 N端內(nèi)酰胺和C端二硫鍵外，酶分子內(nèi)部的疏水環(huán)境也起到了穩(wěn)定構(gòu)象的作用，這很有可能是導(dǎo)致它的低RNA酶活性和腎毒性的重要原因。突變體(M23L)-0NC完全保留了抗腫瘤活性，并且穩(wěn)定性有所降低，有可能降低腎毒性。
[0009]YouNeng Wu等人用I125標(biāo)記0NC，并使ONC結(jié)合在人工培養(yǎng)的9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特殊結(jié)合位置。經(jīng)Scatchard方法分析標(biāo)記結(jié)果,證明ONC與9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的結(jié)合位點有兩個，其解離常數(shù)分別為Kd = 6.2 ΧΙΟ—8和Kd = 2.5 ΧΙΟ—7。每細(xì)胞可以結(jié)合3 X IO5個ONC分子，低位結(jié)合位點的解離常數(shù)與IC50相似，ONC結(jié)合在細(xì)胞上擴大培養(yǎng)，溫度從4 °C升高到37°C，可以增加細(xì)胞對ONC毒性的敏感性。代謝抑制劑、疊氮鈉和脫氧葡萄糖可以抑制ONC的細(xì)胞毒性，而莫能菌素可以使細(xì)胞毒性增大十倍。因為對于ONC毒性來說，ONC分子烷基化是核糖核酸酶活性的必要條件，可以增強抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白合成能力，且至少增強100倍。在9L細(xì)胞中ONC抑制蛋白質(zhì)合成恰巧與細(xì)胞內(nèi)的降解相符合，作用靶標(biāo)均為28s和18sRNA亞基。與核糖核酸酶A相比，ONC能抵抗兩種RNA酶的降解，一種是胎盤核糖核酸酶，另一種是ACETM抑制劑。
[0010]Robert F.Gahl等人證明了 ONC是一種特殊的RNA酶，它具有選擇性細(xì)胞毒性。ONC的細(xì)胞毒性依賴于AP-2/網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，通過內(nèi)吞小泡的內(nèi)化作用進入細(xì)胞，降解細(xì)胞的RNA從而殺死細(xì)胞。Intae Lee等在A549人肺癌移植的裸鼠身上研究核糖核酸酶ONC的抗癌作用時發(fā)現(xiàn)ONC是通過分解t-RNA來阻止蛋白質(zhì)合成作用方式來殺死腫瘤細(xì)胞，這也許可以作為一種替代順鉬治療肺癌的新型方式。
[0011]ONC能 夠明顯地抑制A549腫瘤細(xì)胞的生長，且具有顯著的劑量依賴性。在動物實驗中，多次給予小劑量的ONC比一次性大劑量有效，而且副作用少。ONC與順鉬聯(lián)合用藥的方式能更加顯著的減少腫瘤細(xì)胞生長,但對于相對較大的腫瘤體來講,ONC可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，然而順鉬則不能。[0012]Shailendra K.Saxena等的研究表明ONC的細(xì)胞毒性主要是針對tRNA的降解。他們將ONC加入到正在生長的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中能產(chǎn)生諸如細(xì)胞抑制性、細(xì)胞毒性和抗病毒活性作用，ONC進入活的哺乳動物細(xì)胞中可以有選擇性的并且不被察覺的分解tRNA。此外，ONC可以在體外專一性的利用網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液和純凈RNA底物，而在體內(nèi)顯示出對tRNA降解的驚人專一丨生,而rRNA和mRNA卻完好無損。
[0013]Mihail S.1ordanov等在研究ONC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子決定簇時，表明其對細(xì)胞的毒性機制不同于蛋白質(zhì)合成抑制作用。ONC作用的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，同時伴隨細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核固縮乃至破裂(核裂解)，核內(nèi)DNA發(fā)生裂解，同時激活半胱-天冬氨酸酶，現(xiàn)有證據(jù)證明ONC存在一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制，該凋亡機制可以獨立抑制蛋白合成，使用半胱-天冬氨酸酶抑制劑節(jié)氧羰基-Val-Ala-Asp (OMe,奧美拉唑)氟酮(zVADfmk),在一定的濃度時可以完全阻止ONC引起的細(xì)胞凋亡。由此可見，ONC對細(xì)胞的毒性作用只要表現(xiàn)在兩方面:首要作用是降解細(xì)胞的tRNA抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，引起細(xì)胞死亡，次要作用啟動細(xì)胞的凋亡機制，引起細(xì)胞凋亡。因此，ONC可以作為強有力的抗癌藥物候選蛋白。由于ONC通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞，對細(xì)胞的選擇性較差，在成藥性研究方面不得不考慮其對人體正常細(xì)胞的殺傷而引起的較大副作用。 [0014]基于上述原因，我們在藥物設(shè)計方面進行了較大改進，為使ONC在體內(nèi)發(fā)揮最大的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，減小副作用，必須使ONC分子有效地選擇腫瘤細(xì)胞，同時增加ONC進入細(xì)胞的效率。
[0015]基于受體-配基的特異性結(jié)合理念，使用LHRH受體的配基LHRH(亦稱為GnRH)或其類似物進行靶向抗腫瘤藥物的導(dǎo)向組分加以利用成為當(dāng)前抗腫瘤藥物設(shè)計的熱門。
[0016]使用LHRH的激動劑和抑制劑進行性腺依賴性前列腺癌已經(jīng)有30余年的歷史，如1982年Schally等撰文說明應(yīng)用合成LHRH激動劑類似物治療前列腺癌獲得了重大成就，一方面減輕了患者物理去勢的精神負(fù)擔(dān)，而且獲得了滿意的腫瘤抑制和治療作用。
[0017]在癌組織表面存在高親和力的LHRH受體是通過一些未知的原因演變而來的。這種假設(shè)已經(jīng)在鼠身上初步得到證實，在正常的倉鼠胰腺細(xì)胞膜上用RLA法測不到LHRH受體，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胰腺腫瘤后，在相應(yīng)的細(xì)胞膜上測到了高親和力的LHRH受體，而且在成瘤初期即可檢測到。通過RT-PCR法、免疫組化定位法和放射性配體分析法(RLA)等多種方法檢測證明了 LHRH受體是癌組織、細(xì)胞的新靶標(biāo)。Kakar (1995)在乳腺癌和前列腺癌組織及子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌組織和細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)了與垂體相似的高親和力LHRH受體，并提出86%的前列腺癌、50%的乳腺癌及80%的卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌有高親和力LHRH受體分布。
[0018]我們通過長期新藥研究工作和國外眾多文獻證明促黃體激素釋放激素受體(LHRHR，亦稱為促性腺激素釋放激素受體，GnRHR)在腫瘤組織細(xì)胞表面呈特異性分布，已確認(rèn)為腫瘤的新靶標(biāo)。
[0019]以LHRH為靶向的抗腫瘤藥物的設(shè)計是基于其受體的分布而決定的。
[0020]人LHRHR是由328個氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，它形成胞外和胞內(nèi)環(huán)形結(jié)構(gòu)相連的7個跨膜區(qū)，具有G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)特點。LHRH受體最早發(fā)現(xiàn)于垂體，承接下丘腦產(chǎn)生的促黃體激素釋放激素(LHRH)，促使垂體分泌促性腺激素LH和FSH，后兩者作用于性腺，從而發(fā)揮對性腺功能的調(diào)節(jié)作用。近年來隨著對LHRH及其受體研究的深入，越來越多的臨床和實驗證據(jù)表明LHRH受體在癌組織中呈現(xiàn)特異性廣泛分布。[0021]Bono等(2002)研究了前列腺癌變及良性標(biāo)本上LHRHR的分布及特征，同時測定并比較了多種組織中LHRH受體mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示86%的癌變標(biāo)本膜蛋白對[DTrp6]LHRH表現(xiàn)特異性高親和力，同時有86%的前列腺癌細(xì)胞表面表達(dá)LHRH受體，在良性前列腺組織中亦可見LHRH受體基因表達(dá)，但其含量和親和力顯著低于癌變組。
[0022]S.Dharap等(2005)用定量RT-PCR檢測并分析了編碼LHRH受體的cDNA在多種細(xì)胞、組織勻漿中的基因含量及表達(dá)。測定了人卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌以及多種正常器官組織包括心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺和骨骼肌中(包括同一患者的卵巢癌組織和正常組織)LHRH受體的表達(dá)。結(jié)果表明在腫瘤細(xì)胞內(nèi)LHRH受體的基因是超表達(dá)的，然而在心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺和骨骼肌等正常組織細(xì)胞中卻沒有檢測到LHRH受體表達(dá)。
[0023]Grundker (2002)、Schally (2005)利用合成的 LHRH 類似物[DLys6]作為導(dǎo)向物，以阿霉素或其衍生物為藥物組分，偶聯(lián)成3種LHRH-阿霉素(DOX)或其衍生物AN152、AN201、AN207，這些藥物可以通過LHRH特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞，并通過阿霉素或阿霉素衍生物發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，特異性殺滅腫瘤細(xì)胞，其抑瘤效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單純LHRH類似物和阿霉素或其衍生物，并大大延長了荷瘤裸鼠的生存時間和存活數(shù)量。而且與單純阿霉素使用相t匕，用藥劑量可以提高到阿霉素的5倍以上(摩爾劑量比)。該項目作為德國、美國政府資助項目已經(jīng)完成了一起臨床試驗，單日用藥劑量達(dá)到267mg/m2，在乳腺癌、前列腺癌治療方面獲得了一致認(rèn)可(參見美國專利5843903)。同時他們還進行了特異性RT-PCR和RLA檢測LHRHR的分布表明:LHRH受體主要分布在多種腫瘤組織、細(xì)胞表面，正常的卵巢、子宮內(nèi)膜、輸卵管等生殖系統(tǒng)器官中僅含極痕量的受體，其它正常組織如心臟、肝臟、肺臟、肌肉和骨骼等均無LHRH受體的分布。
[0024]我們在抗癌新藥LHRH-PE40的研發(fā)過程中進行的靶標(biāo)確認(rèn)實驗，確定了口腔癌、鼻咽癌、食管癌、肺癌、腸癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、人黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、上皮癌等多種腫瘤細(xì)胞表面含有高親和力LHRH受體(參見中國專利ZL99122205.9)。
[0025]接下來我們還進行了靶向性抗癌新藥LHRH-PE40的藥效學(xué)研究，并發(fā)現(xiàn)荷瘤裸鼠利用LHRH-PE40尾靜脈給藥治療抑瘤率達(dá)到60%以上，合成的LHRH類似物+LHRH-PE40混合物治療荷瘤裸鼠，抑瘤率下降為40%，單純給與LHRH類似物，荷瘤裸鼠，抑瘤率23%，這個實驗說明LHRH-PE40通過LHRH結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的LHRHR，將藥物特異性作用于腫瘤組織，達(dá)到腫瘤治療作用，LHRH類似物+LHRH-PE40混合物治療荷瘤裸鼠，抑瘤率降低說明LHRH類似物可以競爭性的結(jié)合LHRH受體，阻止LHRH-PE40的抑瘤作用。單純LHRH類似物也具有一定的抑瘤作用，只不過抑瘤效率相對較低。這些實驗充分說明了 LHRH作為腫瘤靶向治療的實用性意義。
[0026]通過我們多年基礎(chǔ)研究和LHRH-PE40新藥研究以及國外同行研究經(jīng)驗，我們認(rèn)為LHRH可以作為抗腫瘤藥物的靶向分子加以利用，在知識產(chǎn)權(quán)不沖突的情況下，我們利用設(shè)計更為合理的LHRH類似物-抗腫瘤藥物組合物，開發(fā)抗腫瘤新藥。
[0027]首先在LHRH類似物的選擇上我們進行了大量的篩選工作，基于天然LHRH為十肽的活性多肽鏈，PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,由于首位氨基酸為焦谷氨酸，基因工程表達(dá)合成有一定難度，世存類似物大多缺省或?qū)⒅蛔優(yōu)楣劝彼幔?jīng)過我們多年基因表達(dá)LHRH-毒素融合蛋白的經(jīng)驗和后續(xù)的藥理藥效活性試驗，證明首位氨基酸突變?yōu)楣劝滨０犯馨l(fā)揮其受體識別、結(jié)合能力，故此，我們設(shè)計合成了首位氨基酸突變?yōu)楣劝滨０?。再由于天然LHRH第六位氨基酸為甘氨酸，其受體親合力較低，體內(nèi)半衰期僅為5min，所以我們將第六位甘氨酸也進行了人為突變，利用色氨酸(Trp)替代甘氨酸，其受體結(jié)合能力提高7-10倍，半衰期達(dá)到2小時，有利于藥物在體內(nèi)的完整性和長效性，參考綠膿桿菌外毒素A和白喉毒素結(jié)構(gòu)特點和入胞機制，在LHRH的C末端加入一個公認(rèn)的轉(zhuǎn)膜肽，使之尾部形成Furin酶切識別位點,一旦藥物組合物結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面,在受體作用下形成內(nèi)吞小泡時，內(nèi)吞小泡中的Furin酶在PH5.2時發(fā)揮酶切作用，將抗腫瘤藥物主動轉(zhuǎn)運至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
[0028]在申報的中國專利“靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的制備和應(yīng)用”中我們成功構(gòu)建表達(dá)了以LHRH為導(dǎo)向的、以綠膿桿菌外毒素A中Furin酶切短肽為轉(zhuǎn)膜作用的、以豹蛙酶為細(xì)胞毒性劑的靶向抗腫瘤融合蛋白質(zhì)，但該目的蛋白是以包涵體形式表達(dá)純化的，總所周知，包涵體形式的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能夠進行純化和恢復(fù)其生物活性，該工藝涉及的純化步驟比較復(fù)雜，同時由于復(fù)性率較低的緣故，其產(chǎn)品收率低，即生產(chǎn)成本將增加。為了更加方便的進行該目的蛋白的純化，降低生產(chǎn)成本，我們在原來LPO的制備的基礎(chǔ)上進行了基因重構(gòu)和優(yōu)化其表達(dá)方式，使目的蛋白以可溶性形式融合表達(dá)，并簡化了其純化工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]本發(fā)明的目的為了解決靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO以包涵體形式表達(dá)純化，復(fù)性率較低的問題，而提供一種靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的新型制備工藝。
[0030]一種融合基因片段，其大堿基序如序列表SEQ ID NO:3所示。
[0031]一種表達(dá)載 體，它是帶有T7啟動子的表達(dá)載體，并在T7啟動子后插入了如序列表SEQ ID NO:3所示的基因；
所述的表達(dá)載體為PET28a，即'WmTHS-LPO0
[0032]靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的新型制備方法，它包括:
a.人工體外合成如序列表SEQID N0:3所示的基因；
b.用Nde1、EcoRI 雙酶切，插入 PET28a 中，獲得 WmTHS-LPO ；
c.將Wm-THS-LPO轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌中，表達(dá)；提取純化融合蛋白；
d.在咪唑存在下進行金屬螯合介質(zhì)純化,用SUMO蛋白酶對所純化的融合蛋白質(zhì)進行酶切，純化。
[0033]一種靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LP0，它是用上述方法制備的。
[0034]本文中所使用術(shù)語“LP0”，是指能夠在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤活性功能的基因工程產(chǎn)品，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，為忠實于天然LPO氨基酸序列，合成基因時特意設(shè)計將天然LPO首位氨基酸Gln的密碼子CAG置于SUMO蛋白酶識別底物氨基酸序列Gly-Gly之后，所說的LPO是以不含Met為首位密碼子的基因工程重組LP0。
[0035]本文所使用的術(shù)語“LP0”是指能夠在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤作用的基因工程產(chǎn)品，其生物活性由于表達(dá)形式的轉(zhuǎn)變應(yīng)等同于或高于原工藝制備的產(chǎn)品。
[0036]其中為了基因連接方便在基因合成時于融合蛋白基因的5'末端添加了 NdeI限制性內(nèi)切酶識別位點，并利用NdeI限制性內(nèi)切酶識別位點中的ATG作為首位啟動密碼子，翻譯表達(dá)融合蛋白首位氨基酸Met。同時在融合的蛋白基因的3'端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列GAATTC，以便使基因片段和載體連接時均形成粘性末端，利于基因連接。為使表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到高效表達(dá)，將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使表達(dá)產(chǎn)物適合在大腸桿菌中表達(dá)。
[0037]利用本發(fā)明方法制備的LPO與原工藝產(chǎn)物進行了活性對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明專利制備的樣品活性顯著優(yōu)于原工藝產(chǎn)品。
[0038]本文中所使用術(shù)語“IC50”是指利用中國生物制品規(guī)程所描述的生物制品對腫瘤細(xì)胞活性檢定標(biāo)準(zhǔn)方法測定的半數(shù)細(xì)胞致死濃度，即利用體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞達(dá)到半數(shù)抑制時藥品的濃度(參考中國藥典附錄，抗腫瘤藥物生物活性測定法，其濃度以μ g/ml表示)。
[0039]本發(fā)明進一步涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)多種類蛋白質(zhì)或多肽串聯(lián)融合表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括:⑴提供攜帶T7強啟動子且含有多克隆位點的表達(dá)載體；⑵人工合成基因串聯(lián)連接的編碼基因序列，以正確的閱讀框架將其克隆到線性化的步驟(1)的表達(dá)載體中用步驟(2)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；⑷在適于表達(dá)融合蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所說的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(5)從細(xì)胞培養(yǎng)物中利用適當(dāng)?shù)募兓に嚮厥詹⒓兓f的融合蛋白質(zhì)。
[0040]用于構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的THS-LPO分子是以N端Met為起始的蛋白質(zhì)分子，依次添加利于蛋白質(zhì)二硫鍵形成的轉(zhuǎn)硫酶A的基因序列、便于純化的HIS6的基因序列和SUMO酶切識別底物基因序列，其后是LHRH的基因序列，為了增加LHRH與其受體的結(jié)合能力和延長其半衰期，將LHRH序列中第六位氨基酸由Gly替換為Trp。完整的LHRH十肽序列之后緊接著連接截短的且能夠被furin酶識別的PEA轉(zhuǎn)膜十肽序列，最后連接ONC的104個氨基酸，并以終止 密碼子TAA結(jié)束。
[0041]由于暫時缺乏作為本發(fā)明融合LPO分子的現(xiàn)成序列，所以在本發(fā)明中使用通用的DNA合成儀在1000A固相載體上合成編碼這些融合蛋白的核苷酸序列。為了便于與特定重組載體進行連接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶(如NdeI和EcoRI)酶切位點，并造成適于連接的粘性末端?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)，克隆編碼這些合成的閱讀框架通暢的基因(或以其cDNA或基因組DNA形式)，DNA重組操作中，一般使用標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆和亞克隆技術(shù)進行基因片段的轉(zhuǎn)移和連接。使用限制性酶切法鑒定序列連接方向的正確性和可能的突變，最后以DNA測序進行序列確認(rèn)。
[0042]通過技術(shù)人員計算機分析和園二色譜檢測證明LPO蛋白質(zhì)分子是以正確的二硫鍵形式進行折疊的。
[0043]重組蛋白質(zhì)基因?qū)⒈豢刹倏v地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列上，如連接到適于在大腸桿菌中使用的T7、trp或λ啟動子、核糖體結(jié)合位點及轉(zhuǎn)錄終止信號上。可使用已知的轉(zhuǎn)化方法，如適于原核細(xì)胞的氯化鈣處理法或適于哺乳動物細(xì)胞的電穿孔法將本發(fā)明的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到選擇的宿主細(xì)胞中?？苫谫|(zhì)粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞。一旦表達(dá)了所需的融合蛋白質(zhì)，即可按照本領(lǐng)域已知的方法分離并純化該融合蛋白質(zhì)。例如，可從發(fā)酵培養(yǎng)物中離心收集菌體細(xì)胞并用溶菌酶和超聲波裂解之，然后超速離心并在低濃度磷酸鹽(約20mM)溶液中加入飽和硫酸銨進行分步沉淀。依次經(jīng)離子交換層析(IEC)和IMAC層析純化所需的LPO重組蛋白質(zhì)。[0044]—般說來，使用聚丙烯酰胺凝膠以SDS-PAGE電泳法分析各柱層析洗脫部分，并以免疫印跡法監(jiān)測之。對重組融合蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物進行腫瘤細(xì)胞抑制試驗以檢測重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(具體操作見中國生物制品規(guī)程2010版)。
[0045]可將本發(fā)明的LPO蛋白質(zhì)作為基本活性成分，并加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床應(yīng)用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據(jù)所治療的疾病的不同，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種與本發(fā)明的蛋白質(zhì)有輔助或協(xié)同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽離子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白質(zhì)保護劑，以及聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑。
[0046]可以通過常規(guī)給藥途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物，例如通過靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或粘膜內(nèi)途徑給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾毫微克至幾十毫克/公斤體重/天，但針對每個特定病人的具體用藥劑量將根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、對藥物的反應(yīng)能力及給藥方式等因素而定。
[0047]我們的實驗室已證明本發(fā)明方法制備的LPO蛋白質(zhì)比原工藝制備的LPO蛋白對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、卵巢癌0VCAR3細(xì)胞、子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及肝癌H印G-2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系的抑制作用均有明顯的提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1顯示用于表達(dá)LPO融合蛋白的LPO重組質(zhì)粒構(gòu)建圖；
圖2顯示用于表達(dá)LPO融合蛋白的THS-LPO重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。
【具體實施方式】
[0049]以下借助實施例進一步闡明本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識到，這些實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍的限制。
[0050]實施例1:LP0表達(dá)載體和工程菌的制備 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
a.基因合成:本發(fā)明中按照前文所述的設(shè)計理念進行酶切位點和LPO全基因序列的設(shè)計并人工體外合成如下序列:
NcoI內(nèi)切酶識別序列(CCATGG)+GC+LHRH多肽基因+PEA轉(zhuǎn)膜肽+ONC序列+終止密碼子(TAA)+EcoRI內(nèi)切酶識別序列(GAATTC)，基因序列見SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)菌，經(jīng)PCR鑒定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴大培養(yǎng)，常規(guī)分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒DNA，利用NC01、EC0RI雙酶切本質(zhì)粒和PET28a質(zhì)粒，回收目的片段和PET28a質(zhì)粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的PET28a質(zhì)粒載體中，構(gòu)建融合蛋白雙鏈表達(dá)基因并轉(zhuǎn)化JM10 9工程菌。
[0051]b.經(jīng)PCR鑒定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴大培養(yǎng)，常規(guī)分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒DNA，利用Nco1、EcoRI雙酶切PET28a_LP0質(zhì)粒進行鑒定，正確者進行DNA測序，然后陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，并將被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，以擴增質(zhì)粒DNA。培養(yǎng)完成后，破碎細(xì)胞，離心收集質(zhì)粒并純化質(zhì)粒DNA測序，測序正確的質(zhì)粒將被轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，用酶切鑒定法和瓊脂糖凝膠(2%)電泳法進行鑒定，然后陽性重組質(zhì)粒進行DNA序列分析。
[0052]圖1:顯示了重組質(zhì)粒pET28a_LP0的構(gòu)建。
[0053]實施例2 =LPO融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及產(chǎn)物的純化:
將攜帶重組基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培養(yǎng)在含有卡那霉素(50μ g/ml)的LB瓊脂平皿上。培養(yǎng)后挑選卡那霉素抗性菌落，于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)，當(dāng)A_達(dá)到約0.4~0.6時加入ImM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度lmM)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時，以誘導(dǎo)目的產(chǎn)物的表達(dá)。然后離心分離細(xì)胞和培養(yǎng)基，并將含有目的蛋白質(zhì)的菌體中加入緩沖液成分，終濃度達(dá) 50mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA,超聲破碎，4°C離心(20，OOOg, 30 分鐘)，取沉淀(不可溶性部分)即為融合蛋白粗提物。
[0054]粗提物經(jīng)過洗滌、變性-復(fù)性處理，獲得的復(fù)性蛋白質(zhì)進行離子交換層析純化:緩沖液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱(Pharmacia),用含有 O~0.5M NaCl 的 TE 緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0, ImM EDTA)連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分。目的組分峰部分經(jīng)小型中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘超濾濃縮換液加鹽后，使?jié)饪s物含終濃度 1.15M NaCl，用 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0, 1.15Μ NaCl 緩沖液平衡 XK 1.6X20cmPhenyl-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),然后上樣、緩沖液洗漆流川峰,最后利用含有 1.15M -0.05M NaCl 的緩沖液(20mM Tris *HC1, pH8.0)進行 100%_0% 梯度洗脫。收集目的蛋白峰部分，利用小型中空纖維超濾器(Milipore)濃縮目的蛋白至2mg/ml。利用20mMPB, pH7.0,0.15M NaCl 緩沖液平衡 XK 1.6X 100cm Superdex75 凝膠過濾柱(Pharmacia),利用上樣環(huán)注入樣品5ml,流速lml/min進行凝膠過濾分離純化,收集蛋白質(zhì)峰值(A28tl)部分于-20°C下儲存?zhèn)溆谩Ｈ绱思兓牡鞍踪|(zhì)純度>97%。
[0055]實施例3:利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞抑制法測定融合蛋白的生物學(xué)活性作用，(具體操作參考中國藥典2010版第三部附錄XC)。
[0056]細(xì)胞病變抑制試驗:
將培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，吹打收集細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計數(shù)板記數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為60000個/ml，按照80 μ I/孔加入到96孔培養(yǎng)板中(每孔5000細(xì)胞)，5% 0)2，371:條件下培養(yǎng)411。調(diào)整制備的LPO蛋白質(zhì)樣品濃度為lmg/ml，定量的樣品經(jīng)過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細(xì)胞孔中，然后補足培養(yǎng)基，使之總體積為100 μ 1，5% 0)2，371:條件下培養(yǎng)2411。然后棄去細(xì)胞板中上清液，每孔加入50 μ I染色液，室溫放置30min后，用流水沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100 μ 1，室溫放置5min，混勻后，用酶標(biāo)儀以630nm為參比波長，在波長570nm出測定吸光度，記錄測定結(jié)果。
[0057]實驗數(shù)據(jù)采用計算機程序進行參數(shù)回歸計算:對各實驗樣品的各實驗點OD值、預(yù)稀釋倍數(shù)、樣本梯度等數(shù)據(jù)采用計算機程序進行處理。分別計算各實驗樣品的半效稀釋倍數(shù)并計算50%效應(yīng)點的濃度(結(jié)果下表)。
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種融合基因片段TF^-Z/幻，其大堿基序如序列表SEQ ID NO:3所示。
2.一種表達(dá)載體，它是帶有T7啟動子的表達(dá)載體，并在T7啟動子后插入了如序列表SEQ ID NO:3所示的基因。
3.權(quán)利要求2所述的一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體為PET28a，即TETZSa-TFS-LPO。
4.靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LPO的新型制備方法，它包括: a.人工體外合成如序列表SEQID N0:3所示的基因； b.用Nde1、EcoRI 雙酶切，插入 PET28a 中，獲得 WmTHS-LPO ； c.將Wm-THS-LPO轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌中，表達(dá)；提取純化融合蛋白； d.在咪唑存在下進行金屬螯合介質(zhì)純化,用SUMO蛋白酶對所純化的融合蛋白質(zhì)進行酶切，純化。
5.一種靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)LP0，它是用權(quán)利要求4所述的方法制備的。
【文檔編號】C12N15/62GK103805621SQ201410082515
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月21日
【發(fā)明者】張國利, 史飛, 于佳, 何苗, 田園, 于新海, 劉雨玲, 吳廣謀, 岳玉環(huán) 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所