豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方法、鑒定親緣關系的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方法、鑒定親緣關系的方法，屬于作物分子生物學【技術領域】。所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。所述鑒定豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記引物多態(tài)性的方法包括：提取不同品種豇豆的基因組DNA；將設計的引物和基因組DNA混合并進行PCR擴增、電泳分離；獲得豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。所述鑒定豇豆親緣關系的方法包括：提取豇豆的基因組DNA；采用豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物進行PCR擴增、電泳分離，統(tǒng)計結(jié)果；對結(jié)果進行親緣關系分析。所述多態(tài)性引物能夠反映豇豆細胞質(zhì)基因組的遺傳信息，可用于豇豆的種質(zhì)資源分類、親緣關系鑒定、遺傳多樣性分析等研究。
【專利說明】豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方法、鑒定親緣關系的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及作物分子生物學【技術領域】，特別涉及一種豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方法、鑒定親緣關系的方法。
【背景技術】
[0002]種質(zhì)資源又稱遺傳資源，種質(zhì)資源的準確區(qū)分與鑒定是進行良種選育和遺傳改良的基礎。
[0003] 在St豆種質(zhì)資源的鑒定過程中，均采用St豆的細胞核DNA的SSR(Simple SequenceRepeat，簡單重復序列)分子標記法鑒定不同品種之間在分子水平上的差異，SSR又叫微衛(wèi)星DNA，指的是基因組中由1-6個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，長度一般在200bp以下。研究表明，微衛(wèi)星DNA在真核生物的基因組中的含量非常豐富，而且常常是隨機分布于核DNA中。
[0004]在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術至少存在以下問題:
[0005]對于現(xiàn)有技術中基因型的鑒定方法僅針對于豇豆的細胞核DNA，由于植物細胞中除細胞核遺傳外，還具有細胞質(zhì)遺傳，而現(xiàn)有技術中并未記載有針對豇豆的細胞核DNA外的其他物質(zhì)用于鑒定豇豆的種質(zhì)資源，因此，僅采用細胞核DNA鑒定豇豆的種質(zhì)資源并不全面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術中鑒定豇豆的種質(zhì)資源不全面的問題，本發(fā)明實施例提供了一種豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物及其篩選方法、鑒定親緣關系的方法。所述技術方案如下:
[0007]一方面，本發(fā)明提供了一種豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物，包括:
[0008]cpSSR3正向引物如序列表中SEQ ID N0.1所示；
[0009]cpSSR3反向引物如序列表中SEQ ID N0.2所示；
[0010]cpSSR9正向引物如序列表中SEQ ID N0.3所示；
[0011]cpSSR9反向引物如序列表中SEQ ID N0.4所示；
[0012]cpSSRIO正向引物如序列表中SEQ ID N0.5所示；
[0013]cpSSRIO反向引物如序列表中SEQ ID N0.6所示；
[0014]cpSSR12正向引物如序列表中SEQ ID N0.7所示；
[0015]cpSSR12反向引物如序列表中SEQ ID N0.8所示；
[0016]cpSSR14正向引物如序列表中SEQ ID N0.9所示；
[0017]cpSSR14反向引物如序列表中SEQ ID N0.10所示。
[0018]另一方面，本發(fā)明提供了一種上述多態(tài)性引物的篩選方法，所述方法包括:
[0019]提取不同品種SXii的基因組DNA ;[0020]將設計的如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.30所示的引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；
[0021]將所述擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液等體積混合，并將混合液在95°C，變性5min后，冰浴3min，得到變性的混合液，再將所述變性的混合液采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離后的擴增產(chǎn)物經(jīng)過固定、銀染、顯色處理后記錄結(jié)果；
[0022]根據(jù)所述擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個所述品種豇豆的基因型，獲得如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.10所示的所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。
[0023]進一步地，所述PCR擴增體系包括:I XPCR buffer, 20ng作為DNA模板的所述基因組DNA，4nmol dNTP,30nmol MgCl2,0.5U Taq DNA聚合酶，IOpmol所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物，所述PCR擴增體系的總體積為20 μ L0
[0024]進一步地，所述PCR擴增程序為:[0025]94°C,預變性 5min ；
[0026]94°C，變性 30s, 50 ~59°C，退火 30s, 72°C，延伸 40s, 35 個循環(huán)；
[0027]72 °C,延伸 5min。
[0028]進一步地，所述變性聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量分數(shù)為8%。
[0029]進一步地，所述上樣緩沖液包括:質(zhì)量分數(shù)為98%的甲酰胺、濃度為10mmol .L-1的EDTA、質(zhì)量分數(shù)為0.025%的溴酚藍和質(zhì)量分數(shù)為0.025%的二甲苯青藍。
[0030]進一步地，在采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離時，取所述變性的混合液2.5 μ L進行點樣。
[0031]進一步地，所述電泳條件為:恒功率55W預電泳40min，然后恒功率50W電泳1.5h。
[0032]又一方面，本發(fā)明實施例提供一種利用上述的多態(tài)性引物鑒定豇豆親緣關系的方法，所述方法包括:
[0033]提取所述不同品種豇豆的基因組DNA;
[0034]將所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；
[0035]將所述擴增產(chǎn)物經(jīng)采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在同一電泳遷移位置上，若有DNA擴增條帶記為“ I ”，若無DNA擴增條帶記為“0”，統(tǒng)計結(jié)果；
[0036]對所述結(jié)果進行親緣關系分析。
[0037]進一步地,所述親緣關系分析的方法為:利用ntsys2.2軟件中的SimQual程序,計算DICE遺傳相似性系數(shù)矩陣，然后通過非加權組平均法，構建遺傳關系聚類樹圖。
[0038]本發(fā)明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是:由于葉綠體是植物細胞質(zhì)中特有的細胞器，故而葉綠體基因組的序列變異有助于植物細胞質(zhì)基因型的區(qū)分開，針對豇豆葉綠體基因組上的DNA序列篩選出來的葉綠體微衛(wèi)星分子標記，該葉綠體微衛(wèi)星分子標記具有細胞核基因組微衛(wèi)星分子標記的共顯性、高度變異和多態(tài)性等特點，此外，豇豆的葉綠體為母性遺傳，母性遺傳使葉綠體的DNA具有單親遺傳模式、且不易發(fā)生重組的特點，同時使得葉綠體微衛(wèi)星分子標記具有結(jié)構簡單、多拷貝以及分子量小等特點，同時，葉綠體微衛(wèi)星分子標記主要位于葉綠體基因組的非編碼區(qū)，而葉綠體DNA的非編碼區(qū)序列在種內(nèi)或種群間也存在遺傳變異，使得該豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物能夠全面地反映豇豆的遺傳信息，使得本發(fā)明提供的鑒定豇豆遺傳多樣性的方法能夠準確、全面地反應豇豆的遺傳多樣性，同時，也能夠使得發(fā)明提供的鑒定豇豆親緣關系的方法能夠更全面。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0040]圖1是本發(fā)明實施例一提供的5對豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物在10份豇豆和3份菜豆樣品中擴增產(chǎn)物的遺傳多樣性電泳圖譜；
[0041] 圖2是圖1的局部放大圖；
[0042]圖3是圖1的局部放大圖；
[0043]圖4是圖1的局部放大圖；
[0044]圖5是圖1的局部放大圖；
[0045]圖6是圖1的局部放大圖；
[0046]圖7是本發(fā)明實施例二提供的聚類樹圖。
【具體實施方式】
[0047]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。
[0048]實施例一
[0049]本發(fā)明實施例提供一種豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。
[0050]1、葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物篩選
[0051]從GenBank 公共數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下載紅豆(V.unguiculata)葉綠體基因組全序列(NC_018051),對5[豆葉綠體基因組全序列進行分析，篩選葉綠體微衛(wèi)星分子序列。單堿基微衛(wèi)星采用軟件Tandem Repeats Finder4.04查找(Benson G.Tandem repeats finder:a program to analyze DNA sequences[J].NucleicAcids Research, 1999，27(2):573-580.);多堿基微衛(wèi)星分子采用 SSRhunter1.3 軟件進行分析(李強，萬建民.SSRHunter，一個本地化的SSR位點搜索軟件的開發(fā)[J].遺傳，2005，27(5):808-810.)，搜索條件設置為:單堿基微衛(wèi)星分子的最小重復次數(shù)為10，二堿基和三堿基的完全重復微衛(wèi)星分子最小重復數(shù)分別為5和4，四堿基及四堿基以上微衛(wèi)星分子的最小重復次數(shù)均為3，在每個微衛(wèi)星分子位點的上下游側(cè)翼序列各為150bp。
[0052]2、葉綠體的微衛(wèi)星分子標記的引物設計
[0053]基于上述所獲得的葉綠體微衛(wèi)星分子序列，利用在線引物設計軟件Primerf.0(http://frod0.w1.mit.edu/)分析微衛(wèi)星分子的側(cè)翼序列并進行引物設計。其主要參數(shù)設置為:引物長度18~22bp，以20bp為最佳；引物退火溫度在50~60°C之間，以55°C為最佳，上游和下游的引物退火溫度之差在5°C以內(nèi)；鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率(GC含量)為40%~70%，最適含量為50% ;預期PCR產(chǎn)物長度為100~400bp。該引物由上海生工生物工程有限公司合成，設計出如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.30所示的引物，在這30條引物中篩選出豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。[0054]本發(fā)明提供的豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物具體參見表1:
[0055]表1為豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物信息
[0056]
【權利要求】
1.一種豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物，其特征在于，包括: cpSSR3正向引物如序列表中SEQ ID N0.1所示； cpSSR3反向引物如序列表中SEQ ID N0.2所示； cpSSR9正向引物如序列表中SEQ ID N0.3所示； cpSSR9反向引物如序列表中SEQ ID N0.4所示； cpSSRIO正向引物如序列表中SEQ ID N0.5所示； cpSSRIO反向引物如序列表中SEQ ID N0.6所示； cpSSR12正向引物如序列表中SEQ ID N0.7所示； cpSSR12反向引物如序列表中SEQ ID N0.8所示； cpSSR14正向引物如序列表中SEQ ID N0.9所示； cpSSR14反向引物如序列表中SEQ ID N0.10所示。
2.一種如權利要求1所述的多態(tài)性引物的篩選方法，其特征在于，所述方法包括: 提取不同品種Slii的基因組DNA ； 將設計的如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.30所示的引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； 將所述擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液等體積混合，并將混合液在95°C，變性5min后，冰浴3min,得到變性的混合液，再將所述變性的混合液采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離后的擴增產(chǎn)物經(jīng)過固定、銀染、顯色處理后記錄結(jié)果； 根據(jù)所述擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個所述品種豇豆的基因型，獲得如序列表中SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.10所示的所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增體系包括:1XPCRbuffer,20ng 作為 DNA 模板的所述基因組 DNA，4nmol dNTP, 30nmol MgCl2,0.5U Taq DNA 聚合酶，IOpmol所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物，所述PCR擴增體系的總體積為20 μ L0
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為: 94°C，預變性 5min ； 94°C，變性 30s, 50 ~59°C，退火 30s, 72°C，延伸 40s, 35 個循環(huán)； 72°C，延伸 5min。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述變性聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量分數(shù)為8% ο
6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述上樣緩沖液包括:質(zhì)量分數(shù)為98%的甲酰胺、濃度為IOmmol.L—1的EDTA、質(zhì)量分數(shù)為0.025%的溴酚藍和質(zhì)量分數(shù)為0.025%的二甲苯青藍。
7.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，在采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離時，取所述變性的混合液2.5 μ L進行點樣。
8.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特 征在于，所述電泳條件為:恒功率55W預電泳40min，然后恒功率50W電泳1.5h。
9.一種利用如權利要求1所述的多態(tài)性引物鑒定豇豆親緣關系的方法，其特征在于，所述方法包括:提取所述不同品種虹?的基因組DNA ； 將所述豇豆葉綠體微衛(wèi)星分子標記的多態(tài)性引物和所述基因組DNA混合并進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； 將所述擴增產(chǎn)物經(jīng)采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在同一電泳遷移位置上，若有DNA擴增條帶記為“ I ”，若無DNA擴增條帶記為“O”，統(tǒng)計結(jié)果； 對所述結(jié)果進行親緣關系分析。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述親緣關系的分析方法為:利用ntsys2.2軟件中的SimQual程序，計算DICE遺傳相似性系數(shù)矩陣，然后通SAHN程序中的非加權組平均法，構建遺傳關系聚類樹圖。
【文檔編號】C12N15/11GK103911372SQ201410074030
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權日:2014年3月3日
【發(fā)明者】潘磊, 陳禪友, 李依 申請人:江漢大學