人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的制作方法
【專利摘要】本公開涉及用于將肽、多肽和蛋白質(zhì)導(dǎo)向至含質(zhì)體細(xì)胞的質(zhì)體的組合物及方法。在一些實施方案中，本公開涉及可以將多肽引導(dǎo)到質(zhì)體的葉綠體轉(zhuǎn)運肽以及編碼它的核酸分子。在一些實施方案中，本公開涉及包含葉綠體轉(zhuǎn)運肽的轉(zhuǎn)基因植物材料（如轉(zhuǎn)基因植物）的制備方法，以及通過這樣的方法制備的植物材料，以及由此制備的植物產(chǎn)品。
【專利說明】人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽
[0001] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請要求2012年2月1日提交的美國臨時專利申請系列號No. 61/593, 555以 及2012年4月17日提交的美國臨時專利申請系列號No. 61/625, 222的優(yōu)先權(quán)。
[0003] 根據(jù)37C. F. R. § 1. 821 (c)或（e)-以ASCII文本文件提交的序列表的聲明
[0004] 根據(jù)37C. F. R. § 1. 821 (C)或（e)，含ASCII文本版本序列表的文件已經(jīng)隨同本申 請一起提交，其內(nèi)容作為參考在此引入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本公開涉及用于基因編碼和表達(dá)多肽的組合物和方法，該多肽導(dǎo)向至含質(zhì)體細(xì)胞 的質(zhì)體。在某些實施方案中，本公開涉及將多肽導(dǎo)向至（例如高等植物的）葉綠體的氨基 酸序列，和/或編碼該氨基酸序列的核酸分子。在某些實施方案中，本公開涉及包含嵌合多 肽，其包含控制該嵌合多肽至質(zhì)體的轉(zhuǎn)運的氨基酸序列，和/或編碼該嵌合多肽的核酸分 子。

【背景技術(shù)】
[0006] 植物細(xì)胞含有不同的亞細(xì)胞器，一般稱為"質(zhì)體"，其由特征性膜體系界定，并且在 細(xì)胞內(nèi)實施特殊功能。特定的質(zhì)體參與了光合作用以及一些化合物的合成和儲存。所有的 質(zhì)體都衍生自存在于植物分生區(qū)中的前質(zhì)體（Proplasmid)。前質(zhì)體可以發(fā)育成為例如：葉 綠體、黃化體、質(zhì)體、老質(zhì)體（gerontoplast)、白色體、淀粉體、脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)體。質(zhì)體以細(xì) 胞內(nèi)的半自主方式存在，含有它們自己的遺傳體系和蛋白質(zhì)合成機制，但是在它們的發(fā)育 和生物合成活性方面依賴于與核質(zhì)系統(tǒng)的緊密合作。
[0007] 在1?等植物的光合葉細(xì)胞中，最引人注目的質(zhì)體為葉綠體。葉綠體最必要的功能 為實施光合作用的光驅(qū)動反應(yīng)。但是，葉綠體還實施許多其它的對植物細(xì)胞重要的生物合 成過程。例如，所有的細(xì)胞脂肪酸由位于葉綠體基質(zhì)中的酶使用這里可獲得的ATP、NAOPH 和糖類來制造。此外，光活化電子的還原能力驅(qū)使葉綠體中的亞硝酸根（NO2O還原成氨 (NH3);該氨向植物提供氨基酸和核苷酸的合成所必需的的氮。
[0008] 葉綠體也參與了農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)的特別重要的過程中。例如，已知的是許多除草劑 通過在葉綠體內(nèi)進(jìn)行的阻斷功能而起作用。近來的研究已經(jīng)識別出一些除草劑的特異性靶 標(biāo)。例如，三嗪衍生的除草劑通過將質(zhì)體醌分子從其在光合體系的32kD多肽中的結(jié)合位點 置換來抑制光合作用。該32kD多肽在葉綠體基因組中編碼，并且通過細(xì)胞器機構(gòu)進(jìn)行合 成。已經(jīng)獲得了對抗三嗪除草劑的突變植物。這些植物含有突變32kD多肽，由此質(zhì)體醌不 再被三嗪除草劑所置換。磺酰脲類化合物抑制葉綠體中的乙酰乳酸合酶。乙酰乳酸合酶參 與異亮氨酸和纈氨酸的合成。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮酰-3-莽草酸合酶（EPSPS)的功 能，后者為參與芳香族氨基酸合成的酶。所有這些酶均由細(xì)胞核基因組編碼，但是它們易位 進(jìn)入葉綠體中，在這里發(fā)生實際的氨基酸合成。
[0009] 大多數(shù)葉綠體蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞核中編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成為較大的前體，并且 在翻譯后輸入至葉綠體中。穿過外被膜和內(nèi)被膜輸入進(jìn)入基質(zhì)是以基質(zhì)、類囊體膜和類囊 體腔為目的地的蛋白質(zhì)的主要進(jìn)入方式。輸入的前體蛋白質(zhì)定位至類囊體膜和類囊體腔是 通過四種不同的機制完成的，包括與細(xì)菌蛋白質(zhì)運輸體系同源的兩種。因此，蛋白質(zhì)在葉綠 體中定位的機制部分地源自原核內(nèi)共生體。Cline and Henry (1996)Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26。
[0010] 以葉綠體表達(dá)為目標(biāo)的前體蛋白質(zhì)包含被稱作葉綠體轉(zhuǎn)運肽（CTPs)的N-末端延 伸。轉(zhuǎn)運肽對于特異性識別葉綠體表面、以及在介導(dǎo)前蛋白翻譯后遷移穿過葉綠體被膜并 從葉綠體被膜到達(dá)葉綠體內(nèi)的各種亞室（例如，基質(zhì)，類囊體和類囊體膜）中有幫助。這些 N-末端轉(zhuǎn)運肽序列包含將葉綠體蛋白質(zhì)輸入至質(zhì)體中的所有必要信息；轉(zhuǎn)運肽序列對于 質(zhì)體運輸是充分必要的。
[0011] 報道在其N-末端具有天然編碼的轉(zhuǎn)運肽序列的植物基因包括葉綠體小亞單位的 核酮糖_1，5-二憐酸羧化酶（RuBisCo) (de Castro Silva-Filho et al. (1996)Plant Mol. Biol. 30:769-80 ;Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3335-42) ;EPSPS(參見，例如， Archer et al. (1990) J.Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 和美國專利 US6, 867, 293、 7, 045, 684 和 Re. 36, 449);色氨酸合酶（Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6081-7); 質(zhì)體藍(lán)素 （Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:20357-63);分支酸合酶（Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:27447-57);捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白（LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999);和擬南芥（Arabidopsis thaliana)葉綠體蛋 白質(zhì)（Lee et al. (2008)Plant Cell 20:1603-22)。美國專利公開 US2010/0071090 提供了 來自衣藻屬（Chlamydomonas sp.)的一些葉綠體導(dǎo)向肽。
[0012] 然而，盡管可能存在不同亞組的具有獨立結(jié)構(gòu)基序的葉綠體導(dǎo)向肽，由于葉綠體 導(dǎo)向肽的高度序列多樣性且缺乏共同或一致的序列基序，葉綠體導(dǎo)向肽編碼的信息的結(jié)構(gòu) 要求仍然難以把握。Lee et al. (2008)，同上。而且，不是所有這些序列都已經(jīng)用于在高等 植物中異源表達(dá)導(dǎo)向葉綠體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本文描述的是用于植物中多肽的質(zhì)體導(dǎo)向的組合物和方法。在一些實施方案中， 組合物包含如下的核酸分子，該核酸分子包括至少一種編碼可操作地連接于感興趣的核苷 酸序列的人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽（例如，TraP23肽）的核苷酸序列。在具體的實施方案中，這 樣的核酸分子可以用于在單子葉植物和雙子葉植物中表達(dá)并導(dǎo)向由感興趣的核苷酸序列 編碼的多肽。本文進(jìn)一步描述了包含如下核酸分子的載體，該核酸分子包含可操作地連接 于感興趣的核苷酸序列的至少一個編碼人造轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列。
[0014] 在一些實施方案中，編碼人造 CTP的核苷酸序列可以是從參考核苷酸序列衍生 的核苷酸序列，或其功能性變體，其中參考核苷酸序列是從多種5-烯醇式丙酮酰莽草 酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)比對獲得的。在一些實施方案中，編碼人造 CTP的核苷酸序列可 以是包含來自不同生物體的部分CTP編碼核苷酸序列的核苷酸序列，或其功能性變體。在 特定的實施方案中，編碼人造 CTP的核苷酸序列可以含有從每個參考EPSPS CTP、或任一前 述的功能性變體得到的連續(xù)核苷酸序列。在這些和進(jìn)一步的實施方案中，編碼人造 CTP的 核苷酸序列可以是包含多于一個編碼CTP的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0015] 在一些實例中，編碼人造 CTP的核苷酸序列可以是包含來自EPSPS酶的部分CTP 核苷酸序列或其功能性變體的核苷酸序列。在具體的實施方案中，編碼人造 CTP的核苷酸 序列可以含有由EPSPS酶得到的連續(xù)核苷酸序列或其功能性變體。
[0016] 在一些實施方案中，組合物包含如下的核酸分子，該核酸分子包含至少一種自 EPSPS衍生的用于將多肽導(dǎo)向至葉綠體的手段。進(jìn)一步描述了多個核酸分子，它們中包含如 下核酸分子：該核酸分子包含至少一個自EPSPS衍生的用于將多肽導(dǎo)向至葉綠體的手段， 其可操作地連接于感興趣的核苷酸序列。在具體的實施方案中，這種核酸分子可以用于在 單子葉植物和雙子葉植物中表達(dá)并導(dǎo)向由感興趣的核苷酸序列編碼的多肽。為了公開的目 的，自EPSPS衍生的用于將多肽導(dǎo)向至葉綠體的手段是指特定的人造核苷酸序列。在具體 的實施方案中，自EPSPS衍生的用于將多肽導(dǎo)向至葉綠體的手段選自本文稱為TraP23的核 苷酸序列。
[0017] 本文還描述了包含如下核酸分子的植物材料（例如且不限于，植物，植物組織和 植物細(xì)胞），該核酸分子包含至少一個可操作地連接于感興趣的核苷酸序列的編碼人造 CTP的核苷酸序列。在一些實施方案中，植物材料在其基因組中可以具有穩(wěn)定整合的此類核 酸分子。在一些實施方案中，植物材料可以瞬時表達(dá)如下的核酸分子的產(chǎn)物，該核酸分子包 含至少一個可操作地連接于感興趣的核苷酸序列的編碼人造 CTP的核苷酸序列。在一些實 施方案中，所述植物材料為不能再生以生成植物的植物細(xì)胞。
[0018] 還描述了用于在含質(zhì)體細(xì)胞（例如植物）中在所述細(xì)胞的質(zhì)體（例如葉綠體）中 表達(dá)核苷酸序列的方法。在具體的實施方案中，可以用包含至少一個可操作地連接于感興 趣的核苷酸序列的編碼人造 CTP的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，使得在植物細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生前體融合多肽，前體融合多肽包含與該感興趣的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物融 合的人造 CTP，并且然后該融合多肽體內(nèi)被運輸至植物細(xì)胞的葉綠體中。在這種方法的一些 實施方案中，植物細(xì)胞不能再生以生成植物。
[0019] 進(jìn)一步描述了用于制備包含如下核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該核酸分子包含 至少一個可操作地連接于感興趣的核苷酸序列的編碼人造 CTP的核苷酸序列。還描述了由 該轉(zhuǎn)基因植物制備的植物商業(yè)產(chǎn)品（例如，種子）。
[0020] 前述和其他特征將由下文對一些實施方案并參考附圖的詳細(xì)說明變得更加明了。
[0021] 附圖簡要說明
[0022] 圖1顯示的是mRNA分子，它們代表了可操作地連接于感興趣的核苷酸序列的、編 碼人造 CTP的核苷酸序列（例如，TraP23)的特定實例。在一些實施方案中，mRNA分子（如 所顯示的這些）可以從如下的DNA分子轉(zhuǎn)錄，該DNA分子包含開放閱讀框，該閱讀框包括可 操作地連接于感興趣的核苷酸序列的編碼人造 CTP的序列。該感興趣的核苷酸序列在一些 實施方案中可以是編碼感興趣的肽的序列，感興趣的肽例如但不限于，要導(dǎo)向至質(zhì)體的標(biāo) 志物基因產(chǎn)物或肽。
[0023] 圖2顯示了多個EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列的比對。帶陰影的氨基酸殘基表明為 TraP23選擇的氨基酸序列。
[0024] 圖3顯示了 pDAB107640的質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖4顯示了 TraP23_GFP滲透進(jìn)入煙草葉組織的顯微圖片。
[0026] 圖5顯示了 pDAB106598的質(zhì)粒圖譜。
[0027] 圖6顯示了 TraP23_GFP轉(zhuǎn)化進(jìn)入玉米原生質(zhì)體的顯微圖片，顯示轉(zhuǎn)運進(jìn)入玉米原 生質(zhì)體的葉綠體。
[0028] 圖7顯示了 pDAB109808的質(zhì)粒圖譜。
[0029] 圖8顯示了 pDAB107687的質(zhì)粒圖譜。

【具體實施方式】
[0030] I. 一些實施方案的概述
[0031] A葉綠體轉(zhuǎn)運肽（CTP)(或質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽）以共翻譯或翻譯后方式起作用以將包含 CTP的多肽引導(dǎo)到質(zhì)體（例如，葉綠體）。在本發(fā)明的一些實施方案中，內(nèi)源性葉綠體蛋白 質(zhì)或是異源蛋白質(zhì)均可通過將該蛋白表達(dá)為含有CTP的較大前體多肽而被導(dǎo)向到葉綠體 中。在具體的實施方案中，CTP可以衍生自由多種5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 (EPSPS)的比對得到的核苷酸序列，例如但不限于，通過例如，但不限于，納入至少一個來自 從不同生物體獲得的直系同源基因的連續(xù)序列，或其功能性變體衍生而來。
[0032] 在一個示例性實施方案中，自EPSPS蛋白質(zhì)序列的比對分離出各自編碼CTP的核 酸序列（圖2)。編碼CTP的序列通過以ChloroP預(yù)測服務(wù)器（prediction server)分析 EPSPS基因序列來分離。Emanuelsson et al. (1999)Protein Science 8:978-84(可在cbs. dtu. dk/services/ChloroP查閱）。分離的編碼CTP的序列的預(yù)測蛋白質(zhì)產(chǎn)物為約60-70 個氨基酸長的轉(zhuǎn)運肽。在該實例中，將多個EPSPS CTP序列的比對用作參考序列來設(shè)計示 例的人造 CTP，方法是隨機選擇氨基酸來生成新的人造 CTP。該設(shè)計過程顯示了人造 CTP的 衍生物（derivation)的特征。示例性人造 CTP在本公開全文中稱為TraP23。測試示例性 人造 TraP23的質(zhì)體導(dǎo)向功能,發(fā)現(xiàn)它們顯示的質(zhì)體導(dǎo)向至少不遜于對單獨的天然CTP序列 觀察到的質(zhì)體導(dǎo)向。
[0033] 在進(jìn)一步的示例實施方案中，獨立地合成多個核酸序列，每一個均編碼本發(fā)明的 人造 TraP肽，并將它們與編碼黃色熒光蛋白（YFP)的核酸序列可操作地連接，從而產(chǎn)生多 個人造的核酸分子，每一個均編碼嵌合TraP:YFP融合多肽。將這些核酸分子，它們每一個 均編碼嵌合TraP: YFP多肽，分別倒入到雙元載體中，使得每一個TraP: YFP編碼核酸序列與 AtUbi 10啟動子可操作地連接。
[0034] 在更進(jìn)一步的示例實施方案中，將多個包含與AtUbi 10啟動子可操作地連接的 TraP:YFP編碼核酸序列的雙元載體通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化分別獨立地瞬時轉(zhuǎn)化到煙草 (本氏煙草（Nicotiana benthamiana))中。共聚焦顯微術(shù)和Western印跡分析證實，每一 個TraP均成功地將YFP導(dǎo)向到了煙草葉綠體上。
[0035] 在進(jìn)一步的示例實施方案中，獨立地合成了多個核酸序列，每一個均編碼本發(fā)明 的人造 TraP肽，并將它們與編碼農(nóng)藝學(xué)上重要的基因序列的核酸序列可操作地連接。將 TraP序列與除草劑耐受性性狀（例如dgt-28)融合，從而產(chǎn)生多個人造的核酸分子，每一 個均編碼嵌合的TraP:DGT-28融合多肽。將這些核酸分子，它們中每一個均編碼嵌合的 TraP: DGT-28多肽，分別引入雙元載體中，從而使每一個TraP: dgt-28編碼核酸序列均與啟 動子或其它基因調(diào)節(jié)元件可操作地連接。用這些含有TraP:dgt-28編碼核酸序列的雙元載 體轉(zhuǎn)化各種植物物種。對轉(zhuǎn)基因植物測定由于DGT-28酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)位到葉綠體導(dǎo)致的除 草劑耐受性。
[0036] 在進(jìn)一步的示例實施方案中，獨立地合成核酸序列，其編碼本發(fā)明的人造 TraP 肽，并與編碼農(nóng)藝學(xué)上重要的基因序列的核酸序列可操作地連接。將TraP序列與昆蟲耐 受性性狀（例如cry2Aa)融合，從而產(chǎn)生人造的核酸分子，其編碼嵌合的TraP:Cry2Aa融 合多肽。將這樣的編碼嵌合的TraP :Cry2Aa多肽的核酸分子引入雙元載體中，使得每一 個TraP:Cry2Aa編碼核酸序列均與啟動子或其它基因調(diào)節(jié)元件可操作地連接。用含有 TraP: cry2Aa編碼核酸序列的雙元載體轉(zhuǎn)化各種植物物種。對轉(zhuǎn)基因植物測定由于Cry2Aa 酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)位到葉綠體導(dǎo)致的除草劑耐受性。
[0037] 鑒于前述的詳細(xì)工作實施例，本發(fā)明的人造 CTP序列和編碼它們的核酸，可用于 在廣大范圍的含質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)將任何多肽引導(dǎo)到質(zhì)體上。例如，通過通過本公開提供給本領(lǐng) 域技術(shù)人員的方法，可以將包含人造的CTP序列、且該序列與任意的第二個肽序列的N端融 合的嵌合多肽引入到含質(zhì)體的宿主細(xì)胞內(nèi)（或在其中表達(dá)），以便將所述第二個肽序列導(dǎo) 向到質(zhì)體上。因此，在特定的實施方案中，本發(fā)明的TraP肽，與天然CTP相比，可以提供期 望在質(zhì)體上表達(dá)的肽的更高的引入和加工效率。
[0038] II.縮寫
[0039] CTP葉綠體轉(zhuǎn)運肽
[0040] EPSPS 3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶
[0041] YFP黃色熒光蛋白質(zhì)
[0042] Ti腫瘤誘導(dǎo)（源自根癌土壤桿菌（A. tumefaciens)的質(zhì)體）
[0043] T-DNA 轉(zhuǎn)移 DNA
[0044] III.術(shù)語
[0045] 為了方便本公開各實施方案的閱讀，提供以下具體術(shù)語的解釋：
[0046] 葉綠體轉(zhuǎn)運肽：如本文所使用的，術(shù)語"葉綠體轉(zhuǎn)運肽"（CTP)(或"質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽"） 可以指如下的氨基酸序列，當(dāng)其存在于多肽的N端時，會指導(dǎo)該多肽進(jìn)入含質(zhì)體細(xì)胞（例如 植物細(xì)胞，例如在全植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中）的質(zhì)體內(nèi)。CTP對于指導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運進(jìn)入 宿主細(xì)胞的質(zhì)體（例如，初級、二級或三級質(zhì)體，例如葉綠體）而言一般是必要而且充分的。 通過多種可用的算法中的任一種（例如PS0RT，和ChloroP (可以在cbs. dtu. dk/services/ ChloroP獲得））可以鑒定推定的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。ChloroP可以提供特別好的CTP預(yù)測。 Emanuelsson et al. (1999) ,Protein Science 8:978-84。然而，任何現(xiàn)有算法均不能以 100%的效率實現(xiàn)功能性CTP的預(yù)測。因此，確認(rèn)所鑒定出的假定CTP是否確實如預(yù)期的那 樣發(fā)揮功能（例如，在體外或體內(nèi)方法中）是重要的。
[0047] 葉綠體轉(zhuǎn)運肽可以位于被轉(zhuǎn)運到質(zhì)體內(nèi)的多肽的N端。CTP可以幫助含有CTP的多 肽的共翻譯或翻譯后的向質(zhì)體中的轉(zhuǎn)運。葉綠體轉(zhuǎn)運肽通常含有大約40-大約100個氨基 酸，這些CTP已經(jīng)被觀察到含有某些共同的特征。例如：CTP所含的帶負(fù)電荷氨基酸（例如 天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺）非常少（即使有的話）；CTP的N端區(qū)缺少帶電氨 基酸、甘氨酸和脯氨酸；CTP的中心區(qū)還很可能含有非常高比例的堿性或羥基化氨基酸（例 如絲氨酸和蘇氨酸）；并且CTP的C端很可能富含精氨酸，并具有構(gòu)成兩親性β折疊片結(jié) 構(gòu)的能力。在包含CTP的多肽被轉(zhuǎn)運到質(zhì)體內(nèi)之后，質(zhì)體蛋白酶可以將CTP與包含CTP的 多肽的其余部分切離。
[0048] 接觸：如本文關(guān)于核酸分子所使用的，術(shù)語與細(xì)胞、組織或生物體（例如植物細(xì) 胞；植物組織；和植物）"接觸"，或被細(xì)胞、組織或生物體"攝取"，包括核酸分子被內(nèi)化到生 物體中，例如但不限于：使生物體與包含該核酸分子的組合物接觸；和用含有該核酸分子 的溶液浸泡生物體。
[0049] 內(nèi)源的：如本文所使用的，術(shù)語"內(nèi)源的"是指源自于特定生物體、組織或細(xì)胞的物 質(zhì)（例如，核酸分子和多肽）。例如，植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的"內(nèi)源"多肽可以指通常在來自相同 物種的非遺傳工程化植物的相同類型的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多肽。在一些實例中，可以利用內(nèi)源 基因（例如EPSPS基因）來獲得參考CTP基因。
[0050] 表達(dá)：如本文所使用的，編碼序列（例如基因或轉(zhuǎn)基因）的"表達(dá)"是指核酸轉(zhuǎn)錄 單元（包括例如基因組DNA或cDNA)的編碼信息轉(zhuǎn)變成細(xì)胞的運作性（operational)、非運 作性或結(jié)構(gòu)性部分的過程，往往包括蛋白質(zhì)的合成。基因表達(dá)可能受到外部信號（例如，細(xì) 胞、組織或生物體暴露于可以增加或降低基因表達(dá)的作用劑）的影響?；虻谋磉_(dá)還可以 在從DNA到RNA到蛋白的通路中的任何地方被調(diào)節(jié)?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)可以通過例如下述方 式發(fā)生：對轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA轉(zhuǎn)運和加工、中間分子如mRNA的降解等的控制，或者通過在特定 蛋白分子產(chǎn)生后使其活化、失活、區(qū)室化（compartmentalization)或降解，或者通過前述 的任何組合?；虮磉_(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的方法在RNA水平或蛋白水平進(jìn)行測量，這些 方法例如但不限于Northern印跡、RT-PCR、Western印跡，和體外、原位和體內(nèi)蛋白活性測 定。
[0051] 遺傳物質(zhì)：如本文所使用的，術(shù)語"遺傳物質(zhì)"包括所有的基因和核酸分子，如DNA 和 RNA。
[0052] 異源的：如本文所使用的，術(shù)語"異源的"是指并非源自于特定生物體、組織或細(xì)胞 的內(nèi)部的物質(zhì)（例如核酸分子和多肽）。例如，在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的"異源"多肽可以指通 常不在來自相同物種的非遺傳工程化植物的相同類型細(xì)胞中表達(dá)的多肽（例如，在相同生 物體的不同細(xì)胞中，或者在不同生物體的細(xì)胞中表達(dá)的多肽）。
[0053] 分離的：如本文所使用的，術(shù)語"分離的"是指如下的分子（例如，核酸分子或多 肽），該分子已與天然存在該分子的生物體細(xì)胞內(nèi)通常與該分子伴隨的其它同類分子（例 如其它核酸分子和其它多肽）實質(zhì)上分離或提純脫離。例如，分離的核酸分子可以與天然 存在該核酸分子的生物體細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA或染色體外DNA實質(zhì)性分離或提純脫離。因 此，該術(shù)語包括經(jīng)過生化純化從而除去其它的核酸分子、多肽和細(xì)胞組分的重組核酸分子 和多肽。該術(shù)語還包括重組核酸分子、化學(xué)合成的核酸分子、和重組產(chǎn)生的多肽。
[0054] 如本文所使用的，術(shù)語"基本上純化的"是指這樣的分子，其與通常在天然狀態(tài)下 與之伴隨的其它分子是分離的?；旧霞兓姆肿涌梢允墙M合物中存在的主導(dǎo)種類?；?上純化的分子可以是，例如，除了天然混合物中存在的溶劑之外，其它分子有至少60%、至 少75%、或至少90%不存在。術(shù)語"基本上純化的"不是指以天然狀態(tài)存在的分子。
[0055] 核酸分子：如本文所使用的，術(shù)語"核酸分子"可以指聚合物形式的核苷酸，其可以 包括RNA、cDNA、基因組DNA、和合成形式的上述混合聚合物的有義和反義鏈。核苷酸可以指 核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸，或兩者任一類型核苷酸的修飾形式。如本文所使用的，"核酸 分子"與"核酸"和"多核苷酸"同義。除非另有說明，核酸分子的長度通常為至少10個堿 基。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。核酸分子包括二聚體（所謂的串聯(lián)）形式，和核酸 分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。核酸分子可包括天然存在的和/或經(jīng)過修飾的核苷酸，其中核苷酸通過 天然存在的和/或非天然存在的核苷酸連接鍵連接在一起。
[0056] 核酸分子可以被化學(xué)或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸 堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所容易理解的。這些修飾包括，例如，標(biāo)記物、甲基化、用類似物取 代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾（例如，不帶電的連接鍵：例如，甲基膦酸 酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電荷的連接鍵：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等；側(cè)基部分：例如，肽；嵌入劑：例如，吖啶、補骨脂素等；螯合劑；烷化劑；和經(jīng)過修 飾的連接鍵：例如，α異頭核酸等）。術(shù)語"核酸分子"也包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙 鏈、部分雙鏈體化（duplexed)、三鏈體化（triplexed)、發(fā)夾（hairpinned)、環(huán)形、和掛鎖構(gòu) 象。
[0057] 如本文關(guān)于DNA所使用的，術(shù)語"編碼序列"、"結(jié)構(gòu)核苷酸序列"或"結(jié)構(gòu)核酸分子" 是指這樣的核苷酸序列，當(dāng)其置于合適調(diào)節(jié)序列的控制之下時，可以通過轉(zhuǎn)錄和mRNA最終 被翻譯成多肽。關(guān)于RNA，術(shù)語"編碼序列"是指被翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。 編碼序列的邊界可以由5'端的翻譯起始密碼子和3'端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列 包括，但不限于：基因組DNA ;cDNA ;EST ;和重組核苷酸序列。
[0058] 在一些實施方案中，本發(fā)明包括可以用分離方法分離、純化或部分純化的核苷酸 序列，分離方法例如離子交換色譜、基于分子量或親和性的排除、基于在不同溶劑中的溶解 性的分級技術(shù)、和遺傳工程化方法如擴增、克隆和亞克隆。
[0059] 序列同一性：術(shù)語"序列同一性"或"同一性"，如本文在兩個核酸或多肽序列的語 境中所使用的，可以指當(dāng)在特定比較窗口上對齊以實現(xiàn)最大對應(yīng)性時，兩個序列中相同的 殘基數(shù)。
[0060] 如本文所使用的，術(shù)語"百分比序列同一性"可以指通過比較兩個在比較窗口上最 佳對齊的序列（例如，核酸序列和氨基酸序列）確定的數(shù)值，其中為了實現(xiàn)兩個序列的最 佳對齊，比較窗口中的序列部分與參考序列（其不含添加或缺失）相比可以包括添加或缺 失（即缺口）。百分比的計算是通過確定在兩個序列中均出現(xiàn)的相同核苷酸或氨基酸的位 置的數(shù)目，從而產(chǎn)生匹配位置數(shù)，并用匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以 100,得到百分比序列同一性。
[0061] 用于對齊序列以供比較的方法在本領(lǐng)域中是公知的。多種程序和比對算 法記載于，例如：Smith and Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2:482 ;Needleman and Wunsch (1970) J. Mol.Biol. 48:443 ； Pear son and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:2444 ；Higgins and Sharp (1988)Gene73:237-44 ；Higgins and Sharp(1989) CABIOS 5:151-3 ；Corpet et al. (1988)Nucleic Acids Res. 16:10881-90 ；Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65 ；Pearson et al. (1994)Methods Mol. Biol. 24:307-31 ;Tatiana et al. (1999)FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50 中。 序 列比對方法和同源性計算的詳細(xì)討論可以參見，例如，Altschul et al. (1990)J.Mol. Biol. 215:403-10。
[0062] 美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information)(NCBI)基礎(chǔ)本地比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool) (BLASTTM;Altschul等（1990))可從幾個來源獲得，包括美國國家生物技術(shù)信息中心 (Bethesda，MD)和在因特網(wǎng)上，與幾個序列分析程序聯(lián)合使用。關(guān)于如何使用該程序來測定 序列同一性的描述可在因特網(wǎng)上BLAST?的"幫助"部分獲得。對于核酸序列的比較，可使 用缺省參數(shù)來采用BLAST?(Blastn)程序的"Blast 2 sequences"函數(shù)。在通過此方法評 估時，與參照序列具有越大的相似性的核酸序列將顯示越高的序列同一性。
[0063] 能夠特異性雜交/能夠特異性互補：如本文所使用的，術(shù)語"能夠特異性雜交"和 "能夠特異性互補"是表明互補性的程度充分，使得在核酸分子和靶核酸分子之間產(chǎn)生穩(wěn)定 而特異的結(jié)合的術(shù)語。兩個核酸分子之間的雜交涉及在兩個核酸分子的核酸序列之間形成 反平行對齊。兩個分子隨后能夠與相對鏈的相應(yīng)堿基形成氫鍵，從而形成一個二聚體分子， 如果它足夠穩(wěn)定，則可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行檢測。核酸分子不需要與靶分子 100%互補才能特異性雜交。然而，發(fā)生特異性雜交必須存在的序列互補性的量因雜交條件 而變化。
[0064] 導(dǎo)致特定程度的嚴(yán)格性的雜交條件會取決于所選雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸 序列的組成及長度而變化。一般而言，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強度（特別是 Na+和/或Mg++濃度）將確定雜交的嚴(yán)格性，盡管清洗次數(shù)也會影響嚴(yán)格性。獲得特定 程度的嚴(yán)格性所要求的雜交條件的計算方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，參見 Sambrook et al. (ed. )Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY，1989,chapters 9and 11; 和 Hames and Higgins(eds. )Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，1985。 關(guān)于核酸雜交的更加詳細(xì)的說明和指導(dǎo)可以參見，例如，Tijssen，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，，'in LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes，Part I，Chapter 2,Elsevier，NY， 1993 ; 和 Ausubel et al., Eds. , Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2, Greene Publishing and Wiley_Interscience，NY， 1995。
[0065] 如本文所使用的，"嚴(yán)格條件"包括在其中只有當(dāng)雜交分子與靶核酸分子內(nèi)的同源 序列之間的錯配小于20%時才發(fā)生雜交的條件。"嚴(yán)格條件"包括進(jìn)一步特定水平的嚴(yán)格 性。因此，如本文所使用的，"中等嚴(yán)格"條件是指在其中序列錯配超過20%的分子將不會 雜交的條件；"高嚴(yán)格"條件是指在其中序列錯配超過10%的分子將不會雜交的條件；"極 高嚴(yán)格"條件是指在其中序列錯配超過5%的分子將不會雜交的條件。
[0066] 下面是代表性的、非限制的雜交條件：
[0067] 高嚴(yán)格條件（檢測具有至少90 %序列同一性的序列）：在65°C的5x SSC緩沖液 中雜交16小時；在室溫下用2x SSC緩沖液清洗2次，每次15分鐘；和在65°C的0. 5x SSC 緩沖液中清洗2次，每次20分鐘。
[0068] 中等嚴(yán)格條件（檢測具有至少80%序列同一性的序列）：在65_70°C的5x_6x SSC緩沖液中雜交16-20小時；在室溫下用2x SSC緩沖液清洗2次，每次5-20分鐘；和在 55-70°C的lx SSC緩沖液中清洗2次，每次30分鐘。
[0069] 非嚴(yán)格對照條件（檢測具有至少50%序列同一性的序列）：在55°C的6xSSC緩沖 液中雜交16-20小時；在室溫至55°C下用2x-3x SSC緩沖液清洗至少2次，每次20-30分 鐘。
[0070] 如本文關(guān)于連續(xù)核酸序列所使用的，術(shù)語"基本上同源的"或"基本上同源"是指 如下的連續(xù)核苷酸序列，其在嚴(yán)格條件下與參考核酸序列雜交。例如，與參考核酸序列（例 如，SEQ ID NO: 12)基本上同源的核酸序列是如下的核酸序列，其在嚴(yán)格條件下（例如，上文 示明的中等嚴(yán)格條件）與參考核酸序列雜交?；旧贤吹男蛄锌删哂兄辽?0%序列同一 性。例如，基本上同源的序列可具有大約80% -100%的序列同一性，例如大約81% ;大約 82% ;大約83% ;大約84% ;大約85% ;大約86% ;大約87% ;大約88% ;大約89% ;大約 90% ;大約91% ;大約92% ;大約93% ;大約94% ;大約95% ;大約96% ;大約97% ;大約 98% ;大約98. 5% ;大約99% ;大約99. 5% ;和大約100%?；旧贤吹男再|(zhì)與特異性雜 交密切相關(guān)。例如，當(dāng)具有充分程度的互補性，從而在期望特異性結(jié)合的條件下（例如嚴(yán)格 雜交條件下）避免核酸與非靶序列的非特異性結(jié)合時，核酸分子是能夠特異性雜交的。
[0071] 如本文所使用的，術(shù)語"直系同源物"（或"直向同源的"）是指兩個或多個物種中 的基因，其從一個共同的祖先核苷酸序列進(jìn)化而來，并可以在兩個或多個物種中保留相同 的功能。
[0072] 如本文所使用的，對于兩個核酸分子而言，當(dāng)沿著5'_3'方向閱讀的序列的每一個 核苷酸均與沿著3' -5'方向閱讀的另一個序列的每一個核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分 子顯示"完全互補性"。與參考核苷酸序列互補的核苷酸序列將顯示與參考核苷酸序列的反 向互補序列相同的序列。這些術(shù)語和描述在本領(lǐng)域中有確切的定義，且本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員容易理解。
[0073] 在確定氨基酸序列之間的百分比序列同一性時，本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，在不 影響包含該對齊序列的多肽的期望性質(zhì)的情況下，某個對齊所提供的給定位置上的氨基酸 的身份可以不同。在這些情況下，可以調(diào)整百分比序列同一性以解釋被保守取代的氨基酸 之間的相似性。這些調(diào)整是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知并且普遍使用的。見，例如Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7。
[0074] 本發(fā)明的實施方案包括示例性的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽氨基酸序列的功能性變體，和編碼它 們的核酸序列。示例性的轉(zhuǎn)運肽序列的功能性變體可以是，例如，示例轉(zhuǎn)運肽氨基酸序列的 片段（例如N端或C端片段），或全長示例性轉(zhuǎn)運肽氨基酸序列或示例性轉(zhuǎn)運肽氨基酸序 列的片段的修飾序列。在一些實施方案中，示例性的轉(zhuǎn)運肽氨基酸序列可以被修飾而引入 一個或多個保守的氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是指如下的氨基酸取代，其中氨基酸殘 基被另一個具有相似功能側(cè)鏈、相似大小、和/或相似疏水性的氨基酸殘基代替?？捎糜诖?替相同家族中的另一個氨基酸以便引入保守取代的氨基酸家族是本領(lǐng)域已知的。例如，這 些氨基酸家族包括：堿性氨基酸（例如，賴氨酸，精氨酸和組氨酸）；酸性氨基酸（例如，天 冬氨酸和谷氨酸）；不帶電的（在生理PH下）的極性氨基酸（例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷 氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，和半胱氨酸）；非極性氨基酸（例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨 酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，和色氨酸）支鏈氨基酸（例如，蘇氨酸，纈 氨酸，和異亮氨酸）；和芳香族氨基酸（例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和組氨酸）。見，例 如，Sambrook et al. (Eds.)，同上；和 Innis et al.，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,1990, Academic Press，NY，USA。
[0075] 可操作地連接：當(dāng)?shù)谝缓塑账嵝蛄信c第二核苷酸序列存在功能關(guān)系時，則該第一 核苷酸序列與第二核苷酸序列"可操作地連接"。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或 表達(dá)，則啟動子與該編碼序列可操作地連接。如果可操作地連接的核苷酸序列是重組產(chǎn)生 的，則這些核苷酸序列通常是連續(xù)的，并且在需要連接兩個蛋白編碼區(qū)時，這些核苷酸序列 將共閱讀框。然而，可操作地連接的核苷酸序列不一定連續(xù)的。
[0076] 術(shù)語"可操作地連接的"，在用來指基因調(diào)節(jié)序列和編碼序列時，其意思是調(diào)節(jié)序 列影響所連接的編碼序列的表達(dá)。"調(diào)節(jié)序列"或"控制元件"是指影響轉(zhuǎn)錄的時機和水平 /量，RNA加工或穩(wěn)定性，或相關(guān)編碼序列的翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子； 翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；增強子；莖環(huán)結(jié)構(gòu)；阻遏物結(jié)合序列；終止序列；多聚腺苷酸化識 別序列；等。特定的調(diào)節(jié)序列可位于與之可操作地連接的編碼序列的上游和/或下游。此 夕卜，與編碼序列可操作地連接的特定調(diào)控序列可位于雙鏈核酸分子的相關(guān)互補鏈上。
[0077] 當(dāng)用于指示兩個或多個氨基酸序列時，術(shù)語"可操作地連接"是指第一個氨基酸序 列與至少一個額外的氨基酸序列存在功能關(guān)系。例如，在包含轉(zhuǎn)運肽和第二氨基酸序列的 多肽內(nèi)，如果該轉(zhuǎn)運肽影響該多肽或該第二氨基酸序列的表達(dá)或運輸，則該轉(zhuǎn)運肽（例如 CTP)與該第二氨基酸序列可操作地連接。
[0078] 啟動子：如本文所使用的，術(shù)語"啟動子"是指一段DNA區(qū)域，其可以位于轉(zhuǎn)錄起點 的上游，并參與RNA聚合酶和其它蛋白的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄。啟動子可以與用于在細(xì) 胞內(nèi)表達(dá)的編碼序列可操作地連接，或者啟動子可以與編碼信號序列的核苷酸序列可操作 地連接，而該信號序列與用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的編碼序列可操作地連接。"植物啟動子"可以 是能夠在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。處于發(fā)育控制之下的啟動子的實例包括：優(yōu)先在 某些組織（例如但不限于，葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織）中起始轉(zhuǎn)錄的 啟動子。這些啟動子被稱為"組織優(yōu)選的"。僅在特定組織中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子被稱為"組 織特異的"。"細(xì)胞類型特異的"啟動子主要在一個或多個器官的特定細(xì)胞類型中的驅(qū)動轉(zhuǎn) 錄，例如根或葉中的導(dǎo)管細(xì)胞。"可誘導(dǎo)的"啟動子可以是可受環(huán)境控制的啟動子。可能通 過可誘導(dǎo)的啟動子觸發(fā)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實施例包括，例如但不限于，缺氧條件和光的存 在。組織特異的、組織優(yōu)選的、細(xì)胞類型特異的、和可誘導(dǎo)的啟動子構(gòu)成了"非組成型"啟動 子類型。"組成型"啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下可以有活性的啟動子。
[0079] 任何可誘導(dǎo)的啟動子均可用于本發(fā)明的一些實施方案。見Ward et al. (1993)，Plant Mol. Biol. 22:361-366。使用可誘導(dǎo)的啟動子，轉(zhuǎn)錄速度可響應(yīng)誘導(dǎo)劑而 增加。可誘導(dǎo)的啟動子的實例包括，但不限于：來自ACEI系統(tǒng)的對銅響應(yīng)的啟動子；來自玉 米的對苯磺酰胺除草劑安全劑響應(yīng)的In2基因；來自TnlO的Tet阻遏物；和來自類固醇激 素基因的可誘導(dǎo)啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性可以被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)（Schena et al.(1991)Pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA88:0421)。
[0080] 組成型啟動子的實例包括，但不限于：來自植物病毒的啟動子，如來自CaMV的35S 啟動子；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pPEMU;MAS ;玉米H3組蛋白啟動 子；和ALS啟動子，歐洲油菜ALS3結(jié)構(gòu)基因5'端的Xbal/Ncol片段（或與所述Xbal/Ncol 片段相似的核苷酸序列）（國際PCT公開No. WO 96/30530)。
[0081] 此外，所有的組織特異性或組織優(yōu)選的啟動子可以用于一些本發(fā)明的實施方案 中。以包含可操作地連接于組織特異性啟動子的編碼序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物可以生成 僅在特定組織或擇優(yōu)在特定組織中的編碼序列的產(chǎn)物。示例性組織特異性或組織優(yōu)選的啟 動子包括但不限于：根優(yōu)選的啟動子，例如，來自菜豆蛋白基因的啟動子；葉特異性和光誘 導(dǎo)的啟動子，例如來自cab或rubisco的啟動子；花藥特異性的啟動子，例如來自LAT52的 啟動子；花粉特異性的啟動子，例如來自Zml3的啟動子；和小孢子優(yōu)選的啟動子，例如來自 apg的啟動子。
[0082] 轉(zhuǎn)化：如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction) "是指將一個或多 個核酸分子轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞中。細(xì)胞在核酸分子通過細(xì)胞復(fù)制變得穩(wěn)定時通過該轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì) 胞的核酸分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或者通過將核酸分子結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或者通過附 加型復(fù)制（episomal replication)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括所有的 可以將核酸分子引入這種細(xì)胞中的技術(shù)。實例包括但不限于：以病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染；以質(zhì) 粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化；電穿孔（Fromm et al. (1986)Nature 319:791-3);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Feigner et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7);顯微注射（Mueller et al. (1978) Cel115:579-85) ; 土壤桿菌（Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移（卩四167 6七31.(1983)卩1'〇(：· Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7);直接 DNA 吸收；和微彈轟擊法（microprojectile bombardment)(Klein et al. (1987)Nature 327:70)〇
[0083] 轉(zhuǎn)基因：一種外源核酸序列。在一些實例中，轉(zhuǎn)基因可以是編碼包含至少一個人造 的CTP的多肽的序列。在特定實例中，轉(zhuǎn)基因可以編碼這樣的多肽，其包含至少一個人造的 CTP和至少一個期望質(zhì)體表達(dá)的額外的肽序列（例如，賦予除草劑抗性的肽序列）。在這些 和其它的實例中，轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因的編碼序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列（例如啟 動子）。為本公開的目的，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因（的）"在用于指示生物體（例如植物）時，是指包 含外源核酸序列的生物體。在一些實例中，包含外源核酸序列的生物體可以是其中通過分 子轉(zhuǎn)化技術(shù)引入了該核酸分子的生物體。在其它實例中，包含外源核酸序列的生物體可以 是通過例如基因滲入或植物異花授粉而引入了該核酸序列的生物體。
[0084] 轉(zhuǎn)運：如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)運"、"導(dǎo)向"和"轉(zhuǎn)移"是指本發(fā)明的某些氨基酸序 列幫助包含該氨基酸序列的多肽從宿主細(xì)胞的細(xì)胞核移動進(jìn)入宿主細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)的性質(zhì)。 在特定的實施方案中，這種氨基酸序列（例如人造的CTP序列）可能能夠?qū)摪被?序列的多肽的大約100 %、至少大約95 %、至少大約90 %、至少大約85 %、至少大約80 %、至 少大約70%、至少大約60%、和/或至少大約50%轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)。
[0085] 載體：一種被引入到細(xì)胞內(nèi)，例如為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞而被引入到細(xì)胞內(nèi)的核酸分 子。載體可以包括允許它在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點。載體的實例包括， 但不限于：質(zhì)粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的病毒。載體還可以包括一個或 多個基因、反義分子、和/或選擇標(biāo)志物基因，以及其它本領(lǐng)域已知的遺傳元件。載體可以 轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，借此導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)由該載體編碼的核酸分子和/或蛋白質(zhì)。載體任 選地包括可幫助核酸分子實現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)入的材料（例如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)包殼等）。
[0086] 除非特別說明或暗示，如本文所用的，術(shù)語"一種"、"一個"和"該"意味著"至少一 個"。
[0087] 除非另有具體說明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所 屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義可 見，例如 Lewin B. , Genes V, Oxford University Press, 1994(ISBN0-19-854287-9)； Kendrew et al. (eds. ). The Encyclopedia of Molecular Biology. Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN 0-632-02182-9);和 Meyers R. A. (ed.). Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCHPublishers, Inc. , 1995(ISBN 1-56081-569-8)。所有的百分比均為重量百分比，并且所有的溶劑混合物的比例均基于體 積，除非另有說明。所有的溫度均為攝氏度。
[0088] IV.包含合成編碼CTP的序列的核酸分子
[0089] 在一些實施方案中，本公開提供核酸分子，其包含可操作地連接于感興趣的核苷 酸序列的至少一個編碼人造 CTP的核苷酸序列。在具體的實施方案中，所述感興趣的核苷 酸序列可以是編碼感興趣的多肽的核苷酸序列。在特別的實例中，提供編碼多肽的單個核 酸分子，所述多肽中TraP23序列融合至感興趣的多肽的N端。
[0090] 在一些實施方案中，人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽可以是嵌合CTP。人造 CTP可以由從多個 EPSPS酶的比對中隨機選擇氨基酸而得到。圖2顯示從植物EPSPS酶分離的CTP序列的比 對。因此，編碼氨基酸序列的人造 CTP可以由從天然葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列的比對中隨機選擇 氨基酸而得到。在這些和其他實例中，用來產(chǎn)生比對的參考CTP序列的連續(xù)氨基酸序列可 以包含人造 CTP。
[0091] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解：在人造 CTP序列內(nèi)選擇第一氨基酸序列后，根據(jù) 前述的衍生過程從同源CTP序列的剩余部分鑒定和選擇連續(xù)氨基酸序列是明確且自動的。 在一些實例中，所述第一連續(xù)氨基酸序列的長度可以是約25至約41個氨基酸（例如，24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41 和 42 個氨基酸長）。
[0092] 根據(jù)前述過程的人造 CTP蛋白質(zhì)序列的實例以SEQ ID NO: 11為代表?？紤]遺傳 密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能立即想到編碼這些肽的核苷酸序列的類群。這些特 定的實例從來自不同植物物種的幾種ESPSP直系同源物之一的同源CTP的比對納入了連續(xù) 序列，從而例示了人造 CTP的結(jié)構(gòu)特征。
[0093] 一些實施方案包括人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的功能性變體，和/或編碼該變體的核酸。 這樣的功能性變體包括，例如且不限于：由SEQ ID NO: 11所示的出的編碼人造 CTP的序列， 和/或由其編碼的CTP ;編碼包含SEQ ID NO: 11內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列的人造 CTP的核酸， 和/或由其編碼的CTP ;編碼截短的人造 CTP的序列，其包含SEQ ID NO: 12的連續(xù)核酸序 列；編碼截短的人造 CTP的序列，其包含與SEQ ID NO: 12基本上同源的連續(xù)核酸序列；截 短的人造 CTP，其包含SEQ ID NO: 11的連續(xù)氨基酸序列；編碼人造 CTP的核酸和/或由其 編碼的CTP ;所述人造 CTP包含SEQ ID NO: 11的連續(xù)氨基酸序列；編碼人造 CTP的核酸和 /或由其編碼的CTP，所述CTP包含SEQ ID N0:11內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列，且該序列具有一個 或多個沉默氨基酸取代；和編碼人造 CTP的核酸和/或由其編碼的CTP，所述CTP包含SEQ ID N0:11內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列，且該序列具有一個或多個被證明能將可操作連接的肽引導(dǎo) 至含質(zhì)體細(xì)胞中的質(zhì)體的非沉默氨基酸取代。
[0094] 因此，本發(fā)明的一些實施方案包括含有如下核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序 列編碼人造的CTP，其包含一個或多個保守的氨基酸取代。這種核酸分子可用于，例如，在 分子生物學(xué)技術(shù)中幫助本發(fā)明CTP編碼序列的操作。例如，在一些實施方案中，可將本發(fā)明 的CTP編碼序列引入到合適的用于將序列亞克隆到表達(dá)載體內(nèi)的載體中，或者可以將本發(fā) 明的CTP編碼序列可以引入到這樣的核酸分子中，該核酸分子可以幫助產(chǎn)生其他包含與感 興趣的核苷酸序列可操作地連接的CTP編碼序列的核酸分子。在這些和進(jìn)一步的實施方案 中，人造的CTP序列中的一個或多個氨基酸位置可以被刪除。例如，人造的CTP的序列可以 被修飾，使得該序列中的 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 或 20 個位 置上的氨基酸被刪除。對同源CTP序列的比對可以提供哪些氨基酸可以被刪除而不會影響 人造 CTP的功能的指導(dǎo)。
[0095] 在特定的實施例中，人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽長度小于80個氨基酸。例如，人造 CTP的 長度可以是 79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60 個氨基 酸或更少。在一些實例中，人造 CTP的長度可以是約65、約68、約72、或約74個氨基酸。在 這些和進(jìn)一步的實例中，人造 CTP可以包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列或前述的功 能性變體。因此，人造 CTP可以包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或其功能性變體，其中人 造 CTP的長度小于80個氨基酸長度。在一些實例中，人造 CTP可以包含，例如，與SEQ ID NO: 11至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97 %、至少98 %、至少99 %或100 %相同的氨基酸序列。
[0096] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本公開能識別編碼某一具體的人造 CTP的所有核苷酸序 列，例如SEQ ID NO: 11的TraP23肽，或任意前述者的功能性變體，包括任何特定缺失和/ 或保守氨基酸取代。遺傳密碼的簡并性為特定氨基酸序列提供了有限數(shù)目的編碼序列。選 擇特定的序列編碼人造的CTP屬于從業(yè)者的自由裁量。在不同的應(yīng)用中可能期望使用不同 的編碼序列。例如，為了提高人造 CTP在特定宿主內(nèi)的表達(dá)，可以選擇反映宿主密碼子使用 偏好的編碼序列。作為舉例，人造的CTP可以由如SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列編碼。
[0097] 本發(fā)明的一些實施方案中提供的核酸分子中，編碼人造的CTP的核苷酸序列的最 后一個密碼子和感興趣的核苷酸序列的第一個密碼子可以由任意數(shù)量的核苷酸三聯(lián)體所 分隔，例如不編碼內(nèi)含子或"終止（STOP)"。在一些實例中，編碼在天然前體多肽中通常與 葉綠體轉(zhuǎn)運肽相伴隨的成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸的序列可以存在于編碼人造 CTP的核 苷酸序列的最后一個密碼子與感興趣的核苷酸序列的第一個密碼子之間。將編碼人造 CTP 的核苷酸序列和感興趣的核苷酸序列第一個密碼子隔開的序列可以例如由任何序列構(gòu)成， 使得所編碼的氨基酸序列很可能不會顯著改變嵌合多肽的翻譯及其向質(zhì)體的轉(zhuǎn)位。在這些 和進(jìn)一步的實施方案中，編碼人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列的最后一個密碼子可以與直 接與該序列毗鄰、或者僅以短肽序列與之相隔的感興趣的核苷酸序列的第一個密碼子相位 對準(zhǔn)（phase register)地融合，所述短肽序列例如是由人造核苷酸接頭（例如，可能已經(jīng) 被用于實現(xiàn)該融合的核苷酸接頭）編碼的短肽序列。
[0098] 在一些實施方案中，可能期望修飾感興趣的核苷酸序列的核苷酸和/或與之融合 在一個編碼序列中的、人造的CTP編碼序列的核苷酸，以便例如增強該編碼序列在特定宿 主中的表達(dá)。遺傳密碼是冗余的，具有64個可能的密碼子，但是大多數(shù)生物優(yōu)先使用這些 密碼子中的一個子集。在某個物種中最經(jīng)常使用的密碼子被稱為最優(yōu)密碼子，而那些不經(jīng) 常使用的被歸類為稀有或低使用率密碼子。Zhang et al. (1991)Gene 105:61-72。可更換 密碼子以反映特定宿主的優(yōu)先密碼子使用率，這個過程有時被稱作"密碼子優(yōu)化"?？梢灾?備含有特定原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子的優(yōu)化密碼子序列，以便，例如，增加翻譯速度或 者產(chǎn)生具有期望性質(zhì)（例如，與從非優(yōu)化序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本相比具有更長的半衰期）的重 組RNA轉(zhuǎn)錄本。
[0099] 任何多肽均可以通過納入人造的CTP序列而被導(dǎo)向到含質(zhì)體細(xì)胞的質(zhì)體上。例 如，在一些實施方案中，可以將多肽與人造的CTP序列連接，從而將多肽引導(dǎo)到的細(xì)胞的質(zhì) 體上，在質(zhì)體中該多肽-CTP連接分子被表達(dá)。在特定的實施方案中，通過納入人造的CTP序 列而被導(dǎo)向到質(zhì)體上的多肽可以是在天然表達(dá)該多肽的細(xì)胞內(nèi)通常在質(zhì)體中表達(dá)的多肽。 例如但不限于，通過納入人造的CTP序列被導(dǎo)向到質(zhì)體上的多肽可以是參與除草劑抗性， 病毒抗性，細(xì)菌性病原體抗性，昆蟲抗性，線蟲抗性，或抗真菌多肽的多肽。參見，例如，美國 專利 5, 569, 823 ;5, 304, 730 ;5, 495, 071 ;6, 329, 504 和 6, 337, 431。通過納入人造的 CTP 序 列被導(dǎo)向到質(zhì)體上的多肽抑或可以是，例如但不限于，參與植物活力和產(chǎn)量的多肽（包括 參與對極端溫度、土壤條件、光照水平、水的水平、和化學(xué)環(huán)境的耐受性的多肽），或者可以 用作鑒定含有感興趣的性狀的植物的標(biāo)志物的多肽（例如，選擇標(biāo)志物基因產(chǎn)物、參與種 子顏色的多肽，等）。
[0100] 在本發(fā)明的一些實施方案中，可以和人造 CTP序列連接的、參與除草劑抗性的多 肽的非限制性實例包括：乙酰乳酸合酶（ALS)、突變的ALS和ALS的前體（例如，見美國專利 5, 013, 659) ;EPSPS (見，例如，美國專利 4, 971，908 和 6, 225, 114)，例如 CP4EPSPS 或 III 類 EPSPS ;可修飾質(zhì)體中發(fā)生的生理過程的酶，這些生理過程包括但不限于，光合作用和脂肪 酸、氨基酸、油、類胡蘿卜素（carotenoids)、萜類和淀粉的合成。在特定實施方案中，可以和 人造的葉綠體轉(zhuǎn)運肽連接的多肽的其它非限制性實例包括：玉米黃素環(huán)氧酶，膽堿單加氧 酶，亞鐵螯合酶，ω -3脂肪酸去飽和酶，谷氨酰胺合成酶，淀粉修飾酶，參與必需氨基酸、維 生素 Α、激素、Bt毒素蛋白的人造的多肽，等等。編碼上述多肽的核苷酸序列在本領(lǐng)域中是 已知的，可以將這些核苷酸序列和編碼人造的CTP的核苷酸序列可操作地連接，其中該CTP 將被表達(dá)進(jìn)入如下的多肽，其包含與該人造的CTP連接的感興趣的多肽。此外，編碼任何上 述多肽的額外核苷酸序列可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒定（例如，通過克隆與編碼該特定多 肽的其它基因高度同源的基因）。一旦鑒定了這樣的核苷酸序列，設(shè)計包括與所鑒定核苷酸 序列可操作地連接的人造的CTP編碼序列，或編碼等價多肽的序列，都會是直截了當(dāng)?shù)倪^ 程。
[0101] V.包含人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的多肽的表達(dá)
[0102] 在一些實施方案中，可以將至少一種核酸分子引入細(xì)胞、組織或生物體中，這些核 酸分子包含編碼包含至少一種人造的CTP或其功能等價物的多肽的核苷酸序列，以在所述 細(xì)胞、組織或生物體中中表達(dá)該多肽。在特定的實施方案中，核酸分子可以包含與所述編碼 人造的CTP的核苷酸序列可操作地連接的感興趣的核苷酸序列。例如，核酸分子可以包括 編碼如下多肽的編碼序列，該多肽包含至少一個人造的CTP和至少一個由感興趣的核苷酸 序列編碼的其他肽序列。在一些實施方案中，可以將本發(fā)明的核酸分子引入含質(zhì)體的細(xì)胞、 組織或生物體（例如，植物細(xì)胞，植物組織和植物）中，使得在該含質(zhì)體宿主細(xì)胞、組織或生 物體中從所述核酸分子表達(dá)多肽，其中該表達(dá)的多肽包含至少一個人造的CTP和至少一個 由感興趣的核苷酸序列編碼的其他肽序列。在某些實例中，被表達(dá)的多肽的人造的CTP可 以幫助將該多肽的至少含有所述其他肽序列的一部分導(dǎo)向到宿主細(xì)胞、組織或生物體的質(zhì) 體上。
[0103] 在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 引入到含質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)。在特定的實施方案中，可以使宿主細(xì)胞、組織或生物體和本發(fā)明的 核酸分子接觸，以便將該核酸分子引入到細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)。在特定的實施方案中，可 用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而將該核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并且將核酸分子穩(wěn)定整合 到細(xì)胞的基因組中。在一些實施方案中，可以使用包含至少一個與感興趣的核苷酸序列可 操作地連接的人造 CTP的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞，例如含質(zhì)體的細(xì)胞（例如植物 細(xì)胞）。為了引發(fā)或增強表達(dá)，核酸分子可以包含一個或多個調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列可以和 編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列可操作地連接。
[0104] 核酸分子可以是，例如，載體系統(tǒng)，其包括例如線性質(zhì)粒和閉合環(huán)狀質(zhì)粒。在特定 的實施方案中，該載體可以是表達(dá)載體。本發(fā)明的核酸序列可以，例如，插入到載體中，使 該核酸序列與一個或多個調(diào)節(jié)序列可操作地連接。有許多載體可用于該目的，并且特定載 體的選擇可以取決于，例如，待插入到載體內(nèi)的核酸的大小，和要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì) 胞。載體通常含有多種組分，這些組分的身份取決于載體的功能（例如，DNA擴增和DNA表 達(dá)），以及與載體相容的特定宿主細(xì)胞。
[0105] 一些實施方案可以包括植物轉(zhuǎn)化載體，其包括含有至少一個上述的調(diào)節(jié)序列的核 苷酸序列，其中該調(diào)節(jié)序列與一個或多個編碼含有至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列 可操作地連接。該一個或多個核苷酸序列可以在該調(diào)節(jié)序列的控制下在植物細(xì)胞、組織或 生物體中表達(dá)，從而產(chǎn)生包含人造的CTP的多肽，該CTP將多肽的至少一部分導(dǎo)向到植物細(xì) 胞、組織或生物體的質(zhì)體上。
[0106] 在一些實施方案中，與編碼含有至少一個人造的CTP的多肽的核苷酸序列可操作 地連接的調(diào)節(jié)序列可以是啟動子序列，其可以在宿主細(xì)胞中，例如要在其中擴增該核酸分 子的細(xì)菌細(xì)胞，或者要在其中表達(dá)該核酸分子的植物細(xì)胞中發(fā)揮功能。適用于根據(jù)本發(fā)明 的核酸分子的啟動子，包括誘導(dǎo)型啟動子、病毒啟動子、人造啟動子、或組成型啟動子，所有 這些都是本領(lǐng)域中眾所周知的?？捎糜诒景l(fā)明實施方案的啟動子的非限制性實例在下列 文獻(xiàn)中提供：美國專利Nos. 6, 437, 217 (玉米RS81啟動子）；5, 641，876 (水稻肌動蛋白啟 動子）；6, 426, 446 (玉米 RS324 啟動子）；6, 429, 362 (玉米 PR-I 啟動子）；6, 232, 526 (玉 米 A3 啟動子）；6, 177, 611 (組成型玉米啟動子）；5, 322, 938, 5, 352, 605, 5, 359, 142 和 5, 530, 196 (35S啟動子）；6, 433, 252 (玉米L3的油質(zhì)蛋白啟動子）；6, 429,357(水稻肌 動蛋白2啟動子和稻肌動蛋白內(nèi)含子2) ;6,294,714(光誘導(dǎo)型啟動子）；6，140,078(鹽 誘導(dǎo)型啟動子）；6,252，138(病原體誘導(dǎo)型啟動子）；6，175,060(磷缺乏誘導(dǎo)的啟動 子）；6, 388, 170(雙向啟動子）；6, 635, 806U-coixin啟動子）；和美國專利申請序列 No. 09/757, 089 (玉米葉綠體醛縮酶啟動子）。
[0107] 其它示例性啟動子包括,胭脂堿合酶（NOS)啟動子（Ebert et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9);章魚堿合酶（OCS)啟動子（其被攜帶于根瘤土壤 桿菌的腫瘤誘導(dǎo)型質(zhì)粒上）；花椰菜花葉病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒（CaMV) 19S啟 動子（Lawton et al. (1987)Plant Mol. Biol. 9:315-24) ;CaMV 35S 啟動子（Odell et al.(1985)Nature 313:810-2);玄參花葉病毒 35S啟動子（^11?^6七31.(1987)?1'〇?！?Natl. Acad. Sci. USA 84(19) :6624_8)，鹿糖合酶啟動子（Yang and Russell (1990)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:4144-8) ;R 基因復(fù)合體啟動子（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83);葉綠素 a/b結(jié)合蛋白基因啟動子；CaMV35S(美國專利Nos. 5,322,938,5 ，352, 605, 5, 359, 142,和 5, 530, 196) ;FMV35S(美國專利 Nos. 6, 051，753,和 5, 378, 619); PClSV啟動子（美國專利No. 5, 850, 019) ;SCP1啟動子（美國專利No. 6, 677, 503)，以 及 AGRtu. nos 啟動子（GenBank 登錄號 V00087 ;Depicker et al. (1982)J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73 ;Bevan et al. (1983)Nature 304:184-7)。
[0108] 在特定的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含組織特異性啟動子。組織特異 性啟動子是一種核苷酸序列，其在該啟動子特異針對的組織中導(dǎo)致可操作地連接的核苷酸 序列發(fā)生與該生物體的其它組織相比更高水平的轉(zhuǎn)錄。組織特異性啟動子的實例包括但不 限于：絨氈層特異性啟動子；花藥特異性啟動子；花粉特異性啟動子（參見，例如，美國專利 No. 7, 141，424,和國際PCT公開No. WO 99/042587);胚珠特異性啟動子；（參見，例如，美國 專利申請Να 2001/047525A1);果實特異性啟動子（參見，例如，美國專利Nos. 4, 943, 674， 和5, 753, 475);和種子特異性啟動子（參見，例如，美國專利Nos. 5, 420, 034,和 5, 608, 152)。在一些實施方案中，發(fā)育階段特異性啟動子（例如，在發(fā)育晚期活躍的啟動 子）可以在本發(fā)明的組合物或方法中使用。
[0109] 其他可在一些實施方案中與核酸分子可操作地連接的調(diào)節(jié)序列包括位于啟動子 序列和充當(dāng)翻譯前導(dǎo)序列的編碼序列之間的5'UTR。翻譯前導(dǎo)序列存在于完全加工的mRNA 中，并且它可能影響初級轉(zhuǎn)錄物的加工，和/或RNA穩(wěn)定性。翻譯前導(dǎo)序列的實例包括玉米 和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)序列（美國專利No. 5, 362, 865)，植物病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列，植 物rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）前導(dǎo)序列，及其他。參見，例如，Turner and Foster(1995)Molecular Biotech. 3(3) :225_36。下列文獻(xiàn)中提供了 5'UTR 的非限 制性實例：GmHsp (美國專利 No. 5, 659, 122) ;PhDnaK(美國專利 No. 5, 362, 865) ;AtAntl ; TEV(Carrington and Freed(1990)J. Virol. 64:1590-7);和 AGRtunos (GenBank 登錄號 V00087;和 Bevan et al. (1983) ,Nature 304:184-7)。
[0110] 其他可在一些實施方案中與核酸分子可操作地連接的調(diào)節(jié)序列還包括3'非翻譯 序列、3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或多聚腺苷酸區(qū)。這些都是位于核苷酸序列下游的遺傳元件，并包括提 供多聚腺苷酸化信號，和/或其它能夠影響轉(zhuǎn)錄或mRNA加工的調(diào)控信號的多核苷酸。多聚 腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能，導(dǎo)致在mRNA前體的3'端添加多聚腺苷酸核苷酸。多聚 腺苷酸序列可以來自于各種植物基因，或T-DNA基因。3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的一個非限制性實例 是胭脂喊合酶 3' 區(qū)（nos 3'；Fraley et al. (1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803_7)。 在 Ingelbrecht et al. (1989)Plant Cell 1:671-80 中提供了一個使用不同 3' 非翻譯 區(qū)的實例。多聚腺苷酸信號的非限制性實例包括來自豌豆RBCS2基因的多聚腺苷酸信號 (Ps. RbcS2-E9 ;Coruzzi et al. (1984)EMBO J. 3:1671-9)和 AGRtu. nos (GenBank 登錄號 No. E01312)。
[0111] 本發(fā)明的重組核酸分子或載體可包含選擇標(biāo)志物，其賦予被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（例如植 物細(xì)胞）可選擇的表型。選擇標(biāo)志物也可以用于選擇包含本發(fā)明核酸分子的植物或植物細(xì) 胞。該標(biāo)記可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性（例如，卡那霉素、遺傳霉素（G418)、博來 霉素，和潮霉素）或除草劑抗性（例如草甘膦）。選擇標(biāo)志物的實例包括，但不限于：neo基 因，其賦予卡那霉素抗性并可用例如卡那霉素和G418進(jìn)行篩選；bar基因，其賦予雙丙氨磷 抗性；突變的EPSP合酶基因，其賦予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予溴苯腈抗性；突變 的乙酰乳酸合酶基因（ALS)，其賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性；和氨甲喋呤抗性DHFR基因。存 在多種可賦予對氣節(jié)青霉素；博來霉素；氣霉素；慶大霉素；潮霉素；卡那霉素；林可霉素； 甲氨蝶呤；草銨膦；嘌呤霉素；大觀霉素；利福平；鏈霉素；和四環(huán)素等抗性的選擇標(biāo)志物。 這些選擇標(biāo)志物的實例在，例如，美國專利5, 550, 318 ;5, 633, 435 ;5, 780, 708和6, 118, 047 中有舉例。
[0112] 本發(fā)明的核酸分子或載體可額外地/作為替代地包含篩選標(biāo)志物。篩選標(biāo)志物 可用于監(jiān)視表達(dá)。篩選標(biāo)志物的實例包括β-葡糖醛酸糖苷酶或UidA基因（GUS)，其編碼 已知有多種發(fā)色底物的酶（Jefferson et al.(1987)Plant Mol. Biol. R印.5:387-405); R-座位基因，其編碼的產(chǎn)物可調(diào)節(jié)植物組織中花青素色素（紅色）的產(chǎn)生（Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. " 見 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels,編 輯，Plenum, NY(第 263-82 頁）；β-內(nèi)酰胺酶基因 （Sutcliffe et al. (1978) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41);編碼其各種發(fā)色底物已知的酶的基因（例如，PADAC，一種發(fā) 色頭孢菌素）；熒光素酶基因（〇w et al. (1986) Science 234:856-9) ;xylE基因，其編碼一 種兒茶酚雙加氧酶，轉(zhuǎn)換發(fā)色的兒茶酚（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 淀粉酶基因 （Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2);酪氨酸酶基因，其編碼的 酶能夠氧化酪氨酸為DOPA多巴醌，進(jìn)一步縮合成黑色素 （Katz et al. (1983)J.Gen. Microbiol. 129:2703-14);和 α-半乳糖苷酶。
[0113] 適用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法包括任何能夠?qū)NA引入到細(xì)胞內(nèi)的方法，例如但 不限于：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見，例如，美國專利5, 508, 184);干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取 (desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)(參見，例如 Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8);電穿孔（參見，例如，美國專利5, 384, 253);用碳化硅纖維攪 拌（參見，例如，美國專利5, 302, 523和5, 464, 765) ;土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（參見，例如，美 國專利 5, 563, 055, 5, 591，616, 5, 693, 512, 5, 824, 877, 5, 981，840,和 6, 384, 301);和 DNA 涂覆顆粒的加速（acceleration of DNA-coated particles)(參見，例如，美國專利5,015， 580, 5, 550, 318, 5, 538, 880, 6, 160, 208, 6, 399, 861，和 6, 403, 865)等。通過諸如這些技術(shù) 的應(yīng)用，幾乎任何物種的細(xì)胞均可以被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化DNA被整合到 宿主細(xì)胞的基因組中。在多細(xì)胞物種的情況下，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以再生為轉(zhuǎn)基因生物。任何 這些技術(shù)均可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，例如，在轉(zhuǎn)基因植物的基因組中包含一個或多個本發(fā) 明的核酸序列。
[0114] 最廣泛使用的用于將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物中的方法是基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化 系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是可遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物致病性土壤細(xì)菌。根癌 土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因 。Ti (腫瘤誘 導(dǎo)）質(zhì)粒含有一個大區(qū)段，稱為T-DNA，其可以轉(zhuǎn)移到被轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一個片 段，vir區(qū)，負(fù)責(zé)T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域的邊界由重復(fù)序列構(gòu)成。在某些經(jīng)修飾的雙元載 體中，腫瘤誘導(dǎo)的基因已被刪除，并且vir區(qū)的功能被利用來轉(zhuǎn)移被T-DNA邊界序列包圍的 外源DNA。T-區(qū)還可以包括，例如，選擇標(biāo)志物，其用于高效回收轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞，和多克 隆位點，其用于插入供轉(zhuǎn)移的序列，例如人造的CTP編碼核酸。
[0115] 因此，在一些實施方案中，植物轉(zhuǎn)化載體可衍生自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒（參 見，例如，美國專利 Nos. 4, 536, 475, 4, 693, 977, 4, 886, 937 和 5, 501，967,以及歐洲專利 EP 0 122 791)或發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒。其他的植物轉(zhuǎn)化載體包括，例如但不限于，在 下列文獻(xiàn)中描述的那些：Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303:209-13 ;Bevan et al. (1983)，同上；Klee et al. (1985)Bio/Technol. 3:637-42;和歐洲專利 EP 0 120 516， 以及從前述任一種衍生的那些。其它天然與植物互作的細(xì)菌，例如中華根瘤菌、根瘤菌屬、 和慢生根瘤菌屬，也可以被修飾從而介導(dǎo)將基因轉(zhuǎn)移到多種不同的植物中。這些植物相關(guān) 的共生菌可以通過獲取卸甲（disarmed)的Ti質(zhì)粒和合適的雙元載體而擁有基因轉(zhuǎn)移能 力。
[0116] 在向受體細(xì)胞提供外源DNA之后，一般對被轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以用于進(jìn)一步的 培養(yǎng)和植株再生。為了提高鑒定被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力，可能期望采用與用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的 載體相伴的選擇或篩選標(biāo)志物基因，如先前所述。在使用選擇標(biāo)志物的情況下，通過使細(xì)胞 暴露于選擇試劑，在潛在的被轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體中鑒定被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在使用篩選標(biāo)志物的情 況下，可以通過期望的標(biāo)記基因性狀對細(xì)胞進(jìn)行篩選。
[0117] 對于暴露于選擇試劑時存活的細(xì)胞，或在篩選測定中具有陽性得分的細(xì)胞，可以 在支持植株再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實施方案中，對任何合適的植物組織培養(yǎng)基（例 如，MS和N6培養(yǎng)基）均可加以修飾使其包含更多的物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)劑。組織可以保持在 含有生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基中，直到獲得足夠的組織用于開始植物再生，或者進(jìn)行多輪 重復(fù)的人工選擇，直到組織的形態(tài)適合于再生（例如，至少2周），然后轉(zhuǎn)移到有利于芽形成 的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)被周期性轉(zhuǎn)移，直到形成足夠的芽。一旦芽形成，即將它們轉(zhuǎn)移到有利于 根形成的培養(yǎng)基中。一旦有足夠的根部形成，可以將植物轉(zhuǎn)移到土壤中進(jìn)一步生長和成熟。
[0118] 為了確認(rèn)再生植物中感興趣的核酸分子（例如編碼含有至少一個人造的CTP的多 肽的核苷酸序列）的存在，可以實施的測定有很多種。這些測定包括，例如：分子生物學(xué)測 定，如Southern和Northern雜交、PCR和核酸測序；生物化學(xué)測定，例如通過如免疫學(xué)方法 (ELISA和/或Western印跡）或通過酶促作用檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在；植物部分測定，如 葉或根測定；和全再生植物的表型分析。
[0119] 作為舉例，整合事件可以通過PCR擴增進(jìn)行分析，其使用，例如，特異針對感興趣 的核苷酸序列的寡核苷酸引物。PCR基因分型理解為包括，但不限于，來自預(yù)測含有被整合 到基因組中的感興趣的核酸分子的分離宿主植物組織的基因組DNA的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 擴增，隨后是標(biāo)準(zhǔn)克隆和PCR擴增產(chǎn)物的序列分析。PCR基因分型的方法已經(jīng)有詳細(xì)的描述 (參見，例如，Rios, G.et al. (2002)Plant J. 32:243-53)，并可應(yīng)用于衍生自任何植物物種 (例如玉米或大豆）或組織類型（包括細(xì)胞培養(yǎng)物）的基因組DNA。
[0120] 使用土壤桿菌依賴的轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通常含有被插入到一個染色體 上的單一重組DNA序列。該單一重組DNA序列被稱作"轉(zhuǎn)基因事件"或"整合事件"。這樣 的轉(zhuǎn)基因植物對于所插入的DNA序列而言是雜合的。在一些實施方案中，可以獲得對轉(zhuǎn)基 因而言為純合的轉(zhuǎn)基因植物，這是通過使含有單個外源基因序列的獨立分離的轉(zhuǎn)基因植物 與自身（例如F tl植物）有性交配（自交）產(chǎn)生F1種子。所產(chǎn)生的F1種子中四分之一對轉(zhuǎn) 基因而言是純合的。萌發(fā)F 1種子產(chǎn)生能夠用于雜合性測試的植物，其中雜合性測定通常使 用允許區(qū)分雜合子和純合子的SNP測定或熱擴增測定法（即，合子型測定）。
[0121] 在特定的實施方案中，在其中已經(jīng)引入了至少一個包含編碼至少一個含有至少一 個人造 CTP的多肽的核酸分子的含有質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生了至少一個人造 CTP的多肽的多 個拷貝。每個含有至少一個人造 CTP的多肽可以由被引入到不同轉(zhuǎn)化事件中的多個核酸序 列表達(dá)，或者由被引入到單個轉(zhuǎn)化事件中的單個核酸序列表達(dá)。在一些實施方案中，多個這 樣的多肽可以在單個啟動子的控制下表達(dá)。在其它實施方案中，多個這樣的多肽可以在多 個啟動子的控制下表達(dá)。可以表達(dá)含有多個肽序列的單一多肽，其中每一個肽序列均將被 導(dǎo)向到質(zhì)體。
[0122] 除了用重組核酸分子直接轉(zhuǎn)化植物之外，還可以通過將具有至少一個轉(zhuǎn)基因事件 的第一植物與缺少這種事件的第二植物雜交，來制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以將含有編碼包 含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列的重組核酸分子引入到適于轉(zhuǎn)化的第一植物品 系內(nèi)，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，可以將轉(zhuǎn)基因植物和第二植物品系雜交，從而將編碼該多肽的 核苷酸序列引入到該第二植物品系內(nèi)。
[0123] VI.包含被人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽引導(dǎo)的多肽的植物材料
[0124] 在一些實施方案中，提供了一種植物，其中該植物包含這樣的植物細(xì)胞：該植物細(xì) 胞中含有編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列。在特定的實施方案中，這樣的 植物可以通過轉(zhuǎn)化植物組織或植物細(xì)胞，并再生整株植物來產(chǎn)生。在進(jìn)一步的實施方案中， 這樣的植物可以從商業(yè)來源獲得，或者通過將含有編碼含有至少一個人造 CTP的多肽的核 苷酸序列的核酸滲入到種質(zhì)中而獲得。還提供了這樣的植物材料，其包含植物細(xì)胞，該植物 細(xì)胞中含有編碼含有至少一種人造 CTP的多肽的核苷酸序列。這樣的植物材料可以從包含 該植物細(xì)胞的植物中獲得。
[0125] 包含編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物材料 在一些實施方案中可表現(xiàn)出一個或多個以下的特征：在植物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該多肽；在植物 細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)表達(dá)該多肽的一部分；將多肽從植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入到細(xì)胞的質(zhì)體內(nèi)；在 植物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體特異性地表達(dá)該多肽；和/或?qū)⒍嚯亩ㄎ辉谥参锏募?xì)胞內(nèi)。除了表達(dá)編碼 的多肽之外，這樣的植物可以額外具有一個或多個期望的性狀。這些性狀可以包括例如：抗 昆蟲等害蟲以及致病劑；耐除草劑；增強穩(wěn)定性、產(chǎn)量或保質(zhì)期；環(huán)境抗性；藥物生產(chǎn)；工業(yè) 產(chǎn)品生產(chǎn)；和營養(yǎng)強化。
[0126] 根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是任何能夠被本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化的植物。因 此，該植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。本發(fā)明方法中可以使用的雙子葉植物的非 限制性實例包括：擬南芥屬，苜蓿，豆類，西蘭花，卷心菜，胡蘿卜，花椰菜，芹菜，大白菜， 棉花，黃瓜，茄子，萵苣，甜瓜，豌豆，胡椒，花生，馬鈴薯，南瓜，蘿卜，油菜，菠菜，大豆，倭瓜 (squash)，甜菜，向日葵，煙草，番茄，和西瓜。本發(fā)明方法中可以使用的單子葉植物的非 限制性實例包括：玉米，蕓苔屬植物（Brassica)，洋蔥，水稻，高粱，小麥，黑麥，黍，甘蔗，燕 麥，黑小麥，柳枝稷，以及草坪草。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以按照任何方式使用或栽培。
[0127] 一些實施方案還提供了含有一個或多個編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核 苷酸序列的商業(yè)產(chǎn)品，例如從含有一個或多個這樣的核苷酸序列的重組植物或種子中產(chǎn)生 的商業(yè)產(chǎn)品。含有一個或多個編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列的商業(yè)產(chǎn)品 包括，例如但不限于：含有一個或多個編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列的 植物的食品、柏、油、壓碎的或完整的顆?；蚍N子。在一個或多個商品或商業(yè)產(chǎn)品中檢測到 一個或多個編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列，是事實上的證據(jù)，表明該商 品或商業(yè)產(chǎn)品至少部分地是由包含一個或多個編碼包含至少一個人造 CTP的多肽的核苷 酸序列的植物產(chǎn)生的。在特定的實施方案中，本發(fā)明的商品產(chǎn)品包括可檢測量的、編碼包含 至少一個人造 CTP的多肽的核酸序列。在一些實施方案中，這種商品產(chǎn)品可以通過，例如， 獲得轉(zhuǎn)基因植物并從它們制備食物或飼料來生產(chǎn)。
[0128] 在一些實施方案中，含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物或種子（該轉(zhuǎn)基因包含編碼包含至 少一個人造 CTP的多肽的核苷酸序列）在其基因組中還可以包含至少一個其它的轉(zhuǎn)基因事 件，包括但不限于：轉(zhuǎn)錄RNAi分子的轉(zhuǎn)基因事件；編碼殺蟲蛋白的基因（例如，蘇云金芽孢 桿菌殺蟲蛋白）；除草劑耐受性基因（例如，提供對草甘膦耐受性的基因）；和有助于在轉(zhuǎn) 基因植物中產(chǎn)生期望表型的基因（例如，增加產(chǎn)量，改變脂肪酸代謝，或恢復(fù)細(xì)胞質(zhì)雄性不 育性）。
[0129] VII.人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽介導(dǎo)的基因產(chǎn)物至質(zhì)體的定位
[0130] 本發(fā)明的一些實施方案提供了一種用于將基因產(chǎn)物表達(dá)和/或定位于質(zhì)體（例如 葉綠體）上的方法。在特定的實施方案中，基因產(chǎn)物可以是標(biāo)志物基因產(chǎn)物，例如，熒光分 子。基因產(chǎn)物作為還包含人造 CTP的多肽的一部分的表達(dá)，可以提供一種用來評估特定的 人造 CTP序列的質(zhì)體定位能力的系統(tǒng)。在一些實施方案中，標(biāo)記基因廣物的表達(dá)，其中該標(biāo) 記基因產(chǎn)物作為包含人造 CTP的多肽的一部分，可用于將標(biāo)記基因產(chǎn)物的表達(dá)導(dǎo)向到表達(dá) 該多肽的細(xì)胞的質(zhì)體上。在某些實施方案中，這樣的標(biāo)記基因產(chǎn)物被定位在宿主細(xì)胞的質(zhì) 體上。例如，標(biāo)志物基因產(chǎn)物在質(zhì)體中的表達(dá)水平可能比在宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或其他細(xì)胞器 中更商；標(biāo)志物基因廣物可能在質(zhì)體中的表達(dá)水平商得多；標(biāo)記基因廣物可能基本上只在 質(zhì)體中表達(dá)；或者標(biāo)記基因產(chǎn)物可能完全在質(zhì)體中表達(dá)，從而不能檢測到其在細(xì)胞質(zhì)或非 質(zhì)體細(xì)胞器中的表達(dá)。
[0131] 在一些實施方案中，包括人造 CTP的功能性變體的多肽，其中該多肽與標(biāo)志物基 因產(chǎn)物可操作地連接，用于評估功能性變體肽的特性。例如，可以改變?nèi)嗽?CTP序列，例如 在人造 CTP中引入至少一個保守突變，并且可將所得的變體肽和標(biāo)志物基因產(chǎn)物可操作地 連接。在合適的宿主細(xì)胞（例如，其中表達(dá)構(gòu)建體中的一個或多個調(diào)節(jié)元件可運作的細(xì)胞） 中表達(dá)后，可以確定標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)。通過在參考人造 CTP-標(biāo)記物構(gòu)建體和變體 肽-標(biāo)記物構(gòu)建體之間比較標(biāo)志物基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，可以確定變體肽是否提供，例 如,更大的（greater)質(zhì)體定位，或基本上相同的質(zhì)體定位。這樣的變體可認(rèn)為是功能性變 體。通過鑒定人造 CTP的能提供更大質(zhì)體定位的功能性變體，可以將這樣的變體中的突變 納入到進(jìn)一步的人造 CTP的變體中。執(zhí)行多輪該評估過程，并隨后將被鑒定的有利突變納 入到人造 CTP序列內(nèi)，可以產(chǎn)生一個迭代的過程，用于優(yōu)化人造 CTP序列。這種優(yōu)化的人造 CTP序列，和編碼它們的核苷酸序列，被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分，無論此類優(yōu)化的人造 CTP 序列是否能夠通過添加額外的突變而進(jìn)一步被優(yōu)化。
[0132] 本文通過援引并入在本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括公開、專利和專利申請，以它 們不與本公開的明確記載矛盾為限，并且并入的程度相當(dāng)于將各參考文獻(xiàn)明確地一一援引 并入，如同這些文獻(xiàn)全文記載在本文中一樣。本文所討論的參考文獻(xiàn)僅是為了提供它們在 本申請申請日之前的公開內(nèi)容。本發(fā)明中任何內(nèi)容均不應(yīng)視為發(fā)明人承認(rèn)無權(quán)基于發(fā)明在 先而要求將本申請視為早于這些公開。
[0133] 提供下面實施例以解釋一些特定的特征和/或方面。這些實施例不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為限 制所述特定特征或方面的公開。
[0134] 實施例
[0135] 實施例1 :人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽（TraP)序列的設(shè)計和制備
[0136] 質(zhì)體是在高等植物物種中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器，并存在于所有植物組織中。葉綠體是在 綠色光合組織中發(fā)現(xiàn)的一種特化型質(zhì)體，負(fù)責(zé)至關(guān)重要的生理功能。例如，其中一種這樣的 主要生理功能是合成植物所需的芳香族氨基酸。細(xì)胞核編碼的酶是此生物合成途徑必需 的，這些酶從細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運到葉綠體的內(nèi)部。這些細(xì)胞核編碼的酶通常具有N端轉(zhuǎn)運肽， 其與葉綠體膜相互作用，從而促進(jìn)肽轉(zhuǎn)運到葉綠體的基質(zhì)。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides:structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447。 在輸入時，基質(zhì)肽酶切掉該轉(zhuǎn)運肽，而使成熟的功能蛋白被輸入到葉綠體內(nèi)。Richter S, Lamppa GK. (1999)Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147:33 -43。葉綠體轉(zhuǎn)運肽是可變的序列，其在長度、組成和組織上有高度多樣性。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides:structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447。葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列相似性在來自不同植物物種的同源蛋白之間有顯 著差異。葉綠體轉(zhuǎn)運肽之間的差異大小出乎人們的預(yù)料，因為比較加工成熟的功能蛋白時， 從不同植物物種獲得的同源蛋白通常具有相對高水平的序列相似度。
[0137] 設(shè)計、產(chǎn)生并在植物內(nèi)測試了新的人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列。新的人造葉綠體轉(zhuǎn)運 肽顯示具有高效的轉(zhuǎn)位和加工性能，用于將農(nóng)藝學(xué)上重要的蛋白轉(zhuǎn)運到葉綠體中。首先，通 過ChloroP?計算機程序分析來自不同植物物種的天然5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸 合酶（EPSPS)蛋白序列，以鑒定推定的葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列（Emanuelsson 0, Nielsen H, von Heijne G, (1999)ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science 8 ;978_984),該程序可 以在http://www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/獲得。利用葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列比對，通 過隨機選擇氨基酸設(shè)計新的人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽來生成新的合成推定的葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列。 新設(shè)計的人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的示例性序列為TraP23 (SEQ ID NO: 11)。對該嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運 肽通過多種包括瞬時植物內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)的測定法進(jìn)行測試，還通過轉(zhuǎn)基因手段，將其作為包 含與農(nóng)藝學(xué)上重要的轉(zhuǎn)基因序列融合的基因表達(dá)元件的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化事件加以測試。
[0138] 實施例2 :人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽（TraP)序列的瞬時植物內(nèi)測試（Transient In Planta Testing)
[0139] 煙草瞬時測定：
[0140] 首先通過瞬時植物內(nèi)測定對Trap23人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列進(jìn)行了測試。合成 了編碼Trap23v2(SEQ ID N0:12)人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列的多核苷酸序列。所得的構(gòu)建 體含有兩個植物轉(zhuǎn)錄單元（PTU)。第一個PTU包括擬南芥泛素10啟動子（AtUbilO啟 動子；Callis, et al.，（1990) J. Biol. Chem.，265:12486-12493)、TraP-綠色熒光蛋白 融合基因（TraP-GFP ;美國專利號7, 678, 893)、和根癌土壤桿菌ORF 23的3'非翻譯區(qū) (Atu0RF23 3' UTR ;美國專利號5, 428, 147)。第二個PTU包括木薯葉脈花葉病毒啟動子 (CsVMV promoter ；Verdaguer et al., (1996)Plant Molecular Biology, 31:1129-1139)> dsm-2(DSM2;美國專利申請?zhí)?011/0107455)和根癌土壤桿菌ORF I 3'非翻譯區(qū) 域（AtuORFl 3' UTR ;Huang et al·，（1990) J. Bacteriol. ,172:1814-1822)。構(gòu)建體 PDAB107640包含TraP23v2葉綠體轉(zhuǎn)運肽（圖3)。通過限制酶消化和測序驗證了該構(gòu)建體。 最后，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌中，并作為甘油儲液存儲。
[0141] 從土壤桿菌甘油儲液將一滿接種環(huán)的冷凍培養(yǎng)物接種到含有2ml YPD (100 μ g/ml 壯觀霉素）的14ml無菌管中。將接種后的培養(yǎng)基在28°C溫育過夜，同時以200rpm震蕩。 翌日，將大約100 μ 1培養(yǎng)物接種在含有25mlYPD (100 μ g/ml壯觀霉素）的125ml無菌三隔 擋板燒瓶（tri-baffled flask)中，并在28?下溫育過夜，同時以200rpm振蕩。第二天， 用無菌的ddH20(pH 8. 0)將培養(yǎng)物稀釋至OD_為0. 5。將稀釋的土壤桿菌菌株以1:1的比 例與含有P19輔助蛋白的第二土壤桿菌菌株混合。使用該培養(yǎng)物通過下列文獻(xiàn)中所述的方 法浸潤煙草葉片：Voinnet 0, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D·，（2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9protein of tomato bushy stunt virus,The Plant Journal, 33:949-956。將 經(jīng)過浸潤的煙草植株置于Conviron?組件中，在16小時光照、24°C下放置至少三天，直到測 定。
[0142] 顯微觀察結(jié)果
[0143] 從植物切下經(jīng)土壤桿菌浸潤的煙草葉片，并置于含有水的培養(yǎng)皿（petri-dish) 中防止脫水。通過藍(lán)光激發(fā)，使用裝配好長通濾光片（long-pass filter glasses)的Dark Reader Hand Lamp?(Clare Chemical Research Co. ;Dolores, CO)并使用對經(jīng)過浸潤的 煙草葉片進(jìn)行觀察，以鑒定成功表達(dá)GFP報告蛋白的葉片的未損傷區(qū)域。將具體鑒定的 葉片區(qū)域從葉片切下，并置于水中，通過共聚焦顯微鏡（Leica TCS-SP5A0BS? Buffalo Grove，IL)成像。YFP報告蛋白使用多譜線氬離子激光器用514nm激光譜線激發(fā)。使用一 個無表達(dá)的（暗）對照葉片樣品調(diào)節(jié)檢測狹縫（slit)的寬度，以排除背景葉自發(fā)熒光。同 時在另一個通道內(nèi)收集葉綠素自發(fā)熒光，用于與確定葉綠體定位用的熒光報告蛋白的信號 進(jìn)行直接比較。
[0144] 顯微成像結(jié)果表明包含TraP23葉綠體轉(zhuǎn)運肽的GFP熒光蛋白質(zhì)沒有在位于煙草 細(xì)胞的葉綠體中積累可檢測量的GFP蛋白質(zhì)（圖4)。
[0145] 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果:
[0146] 通過Western印跡對經(jīng)過浸潤的煙草植物樣品進(jìn)行測定。收集葉沖孔（leaf punches)樣品并進(jìn)行球珠研磨。將大約100-200mg葉材料與2BBs(Daisy ;Rogers，AR)和 500ml PBST在Kleco?珠磨機中混合3分鐘。然后將樣品在離心機中4°C下以14, OOOx g離 心沉降。移出上清液，直接通過Western印跡進(jìn)行分析，或者進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀使用 Pierce Direct IP Kit?(Thermo Scientific ;Rockford, IL)并按照制造商的方案進(jìn)行。大 約50yg抗-GFP被結(jié)合在樹脂上。樣品與樹脂在4°C溫育過夜。接著，次日早晨對樣品進(jìn) 行清洗和洗脫，并通過與等體積的2X 8M尿素樣品緩沖液混合后煮沸樣品5分鐘準(zhǔn)備用于 分析的樣品。將煮沸過的樣品在MOPS緩沖液中的4-12% SDS-Bis Tris凝膠上運行40分 鐘。然后，使用 Invitrogen iBlot?(Life Technologies ;Carlsbad, CA)按照制造商的方案 對凝膠進(jìn)行印跡。印跡過的膜用PBS-吐溫溶液中的5%脫脂奶粉封閉10分鐘。用PBS-吐 溫溶液中5%的脫脂奶粉以1:1000稀釋第一抗體（兔單克隆抗-GFP)，并用該第一抗體探 測膜1小時。接著，用PBS-吐溫將膜漂洗三次，每次5分鐘，以除去所有未結(jié)合的第一抗體。 用1:1000稀釋的第二單克隆山羊抗兔抗體（Life Technologies)探測膜60分鐘。如前所 述地清洗膜，并通過添加 Themo BCIP/NBT底物進(jìn)行顯影。讓比色底物顯影5-10分鐘，然后 用水漂洗印跡，再令印跡干燥。
[0147] Western印跡結(jié)果表明GFP蛋白質(zhì)在經(jīng)浸潤的煙草細(xì)胞中表達(dá)。pDAB107640浸潤 的煙草植物葉組織表達(dá)GFP蛋白，表現(xiàn)在存在一個與GFP抗體反應(yīng)的條帶，且其大小與由不 含葉綠體轉(zhuǎn)運肽的GFP對照所得到的GFP蛋白條帶相當(dāng)。此外，這些結(jié)果表明TraP人造葉 綠體轉(zhuǎn)運肽被加工且從GFP蛋白質(zhì)被切割下來。TraP23-GFP構(gòu)建體表達(dá)一個被預(yù)加工的蛋 白條帶，其分子量大于對照GFP蛋白。Western印跡上存在大小與對照GFP等同的條帶表 明TraP23葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列被加工，從而將GFP的大小減少至與GFP對照等同的分子量大 小。
[0148] 玉米原牛質(zhì)體瞬時測定：
[0149] 將Trap23v2葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼多核苷酸序列（SEQ ID NO :12)克隆在綠色熒光 蛋白基因的上游，并且納入到PDAB106598構(gòu)建體中（圖5)，用于通過玉米原生質(zhì)體瞬時 植物內(nèi)測定法進(jìn)行測試。所得的構(gòu)建體含有下列植物轉(zhuǎn)錄單元（PTU)。第一個PTU包括 玉米泛素 1 啟動子（ZmUbil 啟動子；Christensen, A.，Sharrock R.，and Quail P.，（1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), TraP-綠色突光蛋白融合基因 (TraP23-GFP ;美國專利7, 678, 893)，和玉米過氧化物酶53'非翻譯區(qū)（ZmPer53' UTR ;美國 專利No. 6384207)。該構(gòu)建體通過限制酶消化和測序得到了確認(rèn)。
[0150] 對玉米栽培種B104的種子在含有2?3滴吐溫20的50% Clorox (3 %次氯酸鈉） 中劇烈震蕩大約20分鐘進(jìn)行表面滅菌。將種子用無菌蒸餾水徹底漂洗。將無菌的種子點 種在放有1/2MS培養(yǎng)基的Phytatrays或相似類型的盒子中，并讓它們在黑暗中（28°C )中 生長12至20天。使用玉米原生質(zhì)體瞬時測定法獲得并轉(zhuǎn)染來自B104-玉米葉片的原生質(zhì) 體。這種玉米原生質(zhì)體測定法是下列文獻(xiàn)所述系統(tǒng)的修改版本：Yoo, S. -D.，Cho, Υ. -H.，and Sheen,J.，（2007)，Arabidopsis Mesophyll Protoplasts:A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2:1565-1572。溶液的制備如 Yoo et.al. (2007)所述，只是用于下述實驗的甘露醇濃度改為0.6M。
[0151] 100-500 μ 1原生質(zhì)體（1-5χ105)的轉(zhuǎn)染通過在室溫下將原生質(zhì)體加入到含有約 40 μ g質(zhì)粒DNA(pDAB106598)的2ml微量離心管中來完成。DNA的體積優(yōu)選地保持為原生 質(zhì)體體積的約10%。在5分鐘的溫育期間偶爾對原生質(zhì)體和DNA進(jìn)行混合。將等體積的 PEG溶液緩慢加入到原生質(zhì)體和DNA中，每次加2滴，在各次加 PEG溶液之間的間隔進(jìn)行混 合。將試管再溫育約10分鐘，并偶爾輕輕混合。接著，加入Iml W5+溶液，并顛倒試管數(shù)次 混勻。將管在4°C下75x g離心5分鐘。最后除去上清液，并將沉淀物重懸浮于Iml WI溶 液中，并將原生質(zhì)體放置在小培養(yǎng)皿（35x IOmm)中或放置于6孔多孔平板中，并在室溫下 黑暗溫育過夜。溫育12小時后，通過顯微鏡觀察GFP熒光。使用前述的顯微鏡條件進(jìn)行成 像。
[0152] 顯微鏡成像的結(jié)果表明，包含TraP23人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的GFP熒光蛋白積累在玉 米細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體內(nèi)，相比之下，對照GFP突光蛋白不轉(zhuǎn)位到玉米細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)葉綠 體內(nèi)（圖6)。這些顯微鏡成像結(jié)果提示，GFP蛋白轉(zhuǎn)位到葉綠體內(nèi)是由于TraP23人造葉綠 體轉(zhuǎn)運肽造成的。
[0153] 實施例3:用于在擬南芥（Arabidopsis)中表達(dá)農(nóng)藝上重要的轉(zhuǎn)基因的人造葉綠 體轉(zhuǎn)運肽（TraP)序列
[0154] 大腸桿菌5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）中的一個單氨基酸突 變（G96A)會導(dǎo)致草甘勝不敏感性（Padgette et al.，（1991) ;Eschenburg et al.，（2002); Priestman et al·，（2005) ;Haghani et al·，（2008))。盡管該突變會賦予對草甘膦的耐受 性，但是它已知也會不利地影響EPSP合酶與其天然底物--磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的結(jié) 合。由此造成的底物結(jié)合效率的改變可能會使得突變酶不適合于在植物內(nèi)提供對草甘膦的 耐受性。
[0155] 在計算機上對NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫篩選在EPSP合酶的與該酶的大腸桿菌版 本中引入的G96A突變類似的位置上天然含有丙氨酸的EPSP合酶蛋白和多核苷酸序列 (Padgette et al. , (1991) ；Eschenburg et al. , (2002) ；Priestman et al. , (2005)； Haghani et al. , (2008) )〇
[0156] -種被鑒定為在該位置含有天然丙氨酸的酶是來自斯維鏈霉菌（Streptomyces sviceus)ATCC29083 的 DGT-28 (GENBANK 登錄號 N0:ZP_06917240. 1)。進(jìn)一步的計算機數(shù)據(jù) 挖掘顯示了 3個另外的與DGT-28具有更大同源性的獨特鏈霉菌酶：DGT-31 (GENBANK ACC N0:YP_004922608.1) ;DGT-32(GENBANK ACC N0:ZP_04696613);和 DGT-33(GENBANK ACC N0:NC_010572)。這些酶中的每一個都在EPSP合酶的與該酶的大腸桿菌形式中引入的G96A 突變類似的位置上含有一個天然的丙氨酸。
[0157] 因為來自不同生物體的EPSP合酶蛋白具有不同的長度，所以對大腸桿菌版本的 EPSP合酶的突變編號不一定與對來自其它生物體的EPSP合酶的突變編號相對應(yīng)。這些鑒 定的EPSP合酶先前并未就其草甘膦耐受性或PEP底物親和力接受過表征。而且，這些EPSP 合酶代表了一類新的EPSP合酶，且它們不含有任何已經(jīng)被用于表征先前描述的I類（在美 國專利No. RE39247中進(jìn)一步描述的植物來源序列）、II類（在美國專利No. RE39247中進(jìn) 一步描述的細(xì)菌來源序列）、和ΠΙ類（在國際專利申請WO 2006/110586中進(jìn)一步描述的 細(xì)菌來源序列）EPSP合酶的序列基序。
[0158] 對新型DGT-28, DGT-31，DGT-32和DGT-33酶的草甘膦耐受性和PEP底物親和性進(jìn) 行了表征，并與I類EPSP合酶進(jìn)行了比較。使用如下的I類酶進(jìn)行比較：來自大豆的DGT-1， 來自歐洲油菜的DGT-3 (GENBANK登錄號NO:P17688)，和來自普通小麥的DGT-7 (GENBANK登 錄號N0:EU977181)。合成并評估了 I類EPSP合酶及其突變變體。在植物EPSP合酶中導(dǎo)入 的一個突變是與該酶的大腸桿菌版本中的G96A突變的相似位置處導(dǎo)入的甘氨酸向丙氨酸 的突變。此外，在如Funke et al.，（2009)所述的大腸桿菌EPSP合酶的氨基酸97 (T變?yōu)?I)和氨基酸101 (P變?yōu)镾)的相似位置處，在這些I類EPSP合酶中引入了蘇氨酸向異亮氨 酸和脯氨酸向絲氨酸的突變。
[0159] DGT-28、DGT-31、DGT-32 和 DGT-33 ：
[0160] 新設(shè)計的、雙子葉植物優(yōu)化的dgt_28v5多核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。新 設(shè)計的、單子葉植物優(yōu)化的dgt-28v6多核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示；該序列被稍作修 飾，在第二位氨基酸處包括丙氨酸，以便引入限制性酶切位點。所得的DNA序列具有更高度 的密碼子多樣性、理想的堿基組成，包含有策略地布置的限制性酶識別位點，且缺少可能干 擾基因轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)物mRNA翻譯的序列。
[0161] 包含SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15且含有額外的序列如6-框終止（添加至編 碼序列3'端的、位于所有六個閱讀框中的終止密碼子）和克隆用5'限制性位點的DNA片 段的合成由供應(yīng)商（DNA2.0, Menlo Park，CA)進(jìn)行。然后將該合成核酸分子克隆進(jìn)入表達(dá) 載體，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物或細(xì)菌中，如下文實施例所述。
[0162] 用類似的密碼子優(yōu)化策略來設(shè)計dgt-1、dgt-3v2(G173A)、dgt-3v3(G173A ; P178S)、dgt-3v4(T174I ;P178S)、dgt-7v4(T168I ;P172S)、dgt-32v3、dgt-33v3 和 dgt-31v3。這些基因的密碼子優(yōu)化的版本分別如SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID N0:18、SEQIDN0:19、SEQIDN0:20、SEQIDN0:21、SEQIDN0:22和SEQIDN0:23所示。
[0163] 棺物雙元載體構(gòu)建。用標(biāo)準(zhǔn)克降方法構(gòu)建入門載體（entry vector)，其含有葉 綠體轉(zhuǎn)運肽多核苷酸序列與dgt-28連接在一起而形成的合框融合物。將與dgt-28融合 的轉(zhuǎn)運膚（TraP)的入門載體用 In-Fusion? Advantage Technology (Clontech, Mountain View，CA)進(jìn)行裝配。作為融合的結(jié)果，第一個氨基酸，甲硫氨酸，被從dgt-28去除。分別 通過DNA2. 0 (Menlo Park, CA)合成編碼轉(zhuǎn)運肽的多核苷酸序列TraP4v2 (SEQ ID NO: 24)、 TraP5v2(SEQ ID NO:25),TraP8v2(SEQ ID NO:26),TraP9v2(SEQ ID NO:27),TraP12v2(SEQ ID N0:28)和TraP13v2(SEQ ID N0:29)，并融合于dgt-28的到唯一的AccI限制性核酸內(nèi) 切酶識別位點為止（含）的5'端片段。
[0164] 含有各種TraP和dgt-28表達(dá)盒的雙元質(zhì)粒由擬南芥泛素10啟動子（AtUbi 10v2 ; Callis, et al·，（1990) J. Biol. Chem. ,265:12486-12493)驅(qū)動，并且側(cè)翼是根癌土壤桿菌 開放閱讀框 23 的 3' 非翻譯區(qū)（Atu0RF233' UTR vl ;U. S. Pat. No. 5, 428, 147)。
[0165] 使用 Gateway?技術(shù)（Invitrogen, Carlsbad, CA)構(gòu)建組裝的 TraP和 dgt-28 表達(dá) 盒，并通過土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中。限制性核酸內(nèi)切酶從New England BioLabs (NEB ;Ipswich, MA)獲得，并使用 T4DNA 連接酶（Invitrogen)進(jìn)行 DNA 連接。使 用GatewayK LR Clonaseli酶混合物（InvitroSen)實施Gateway反應(yīng)，以將一個入門載 體組裝到單一目標(biāo)載體中，該目標(biāo)載體含有一個選擇標(biāo)志物盒：木薯葉脈花葉病毒啟動子 (CsVMV v2;Verdaguer et al.，（1996)Plant Mol.Biol.，31:1129-1139)-DSM-2(美國專 利申請No. 2007/086813)-根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3'非翻譯區(qū)（AtuORFl 3' UTR v6;Huang et al·，（1990)J.Bacteriol. 172:1814-1822)。使用 NucleoSpin'(質(zhì)粒試劑盒 (Macherey-Nagel Inc. ,Bethlehem, PA)或質(zhì)粒 Midi 試劑盒（Qiagen)按照供應(yīng)商的指導(dǎo) 進(jìn)行質(zhì)粒制備。瓊脂糖Tris-乙酸凝膠電泳后，使用QIAquick?凝膠提取試劑盒（Qiagen) 分離DNA片段。
[0166] 所有組裝質(zhì)粒的集落首先通過微量制備DNA的限制性消化進(jìn)行篩選。將選定的集 落的質(zhì)粒DNA由商業(yè)測序公司（Eurofins? MWG Operon, Huntsville, AL)進(jìn)行測序。使用 Sequencher?軟件（Gene Codes Corp. ,Ann Arbor, MI)對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝和分析。
[0167] 下列雙元構(gòu)建體表達(dá)多種TraP:dgt-28融合基因序列：pDAB107527含 有 TraP4v2:dgt-28v5(SEQ ID N0:30) ;pDAB105530 含有 TraP5v2:dgt-28v5(SEQ ID N0:31) ;pDAB105531 含有 TraP8v2:dgt-28v5(SEQ ID N0:32) ;pDAB105532 含有 TraP9v2:dgt-28v5(SEQIDN0:33);pDAB105533含有TraP12v2:dgt-28v5(SEQIDN0:34) ; 和 PDAB105534 含有 TraP13v2:dgt-28v5(SEQ ID N0:35)。pDAB105534 的 dgt-28v5 序列經(jīng) 過修飾，其中將第一密碼子（GCA)變成（GCT)。
[0168] 額外的棺物雙元載體構(gòu)律。類似于hf所沭的克降策略用來構(gòu)律含有dgt-31、 dgt-32、dgt-33、dgt-1、dgt-3 和 dgt-7 的雙元質(zhì)粒。
[0169] 微生物衍生的基因：將dgt-31、dgt-32和dgt-33與不同于之前所述的葉綠體轉(zhuǎn) 運肽融合。使用下列葉綠體轉(zhuǎn)運肽：TraP14v2(SEQ ID N0:36)、TraP23v2(SEQ ID N0:37)、 TraP24v2(SEQ ID 勵：38)邛0六8107532 含有融合于 TraP14 v2(SEQ ID N0:39)的 dgt-32v， PDAB107534 含有融合于 TraP24 v2(SEQ ID N0:40)的 dgt-33 v3，pDAB107533 含有融合于 TraP23 v2(SEQ ID N0:41)的dgt-31 vSodgt表達(dá)盒由擬南芥泛素10啟動子（AtUbilO啟動 子v2)驅(qū)動并且其側(cè)翼為根癌土壤桿菌開放閱讀框23的3'未翻譯區(qū)域（Atu0RF233' UTR vl)。該雙元載體中還存在一個含有木薯脈花葉病毒啟動子（CsVMVv2) -DSM-2-根癌土壤 桿菌開放閱讀框1的：V未翻譯區(qū)域（AtuORFl 3' UTRv6)的DSM-2選擇標(biāo)志物盒。
[0170] 構(gòu)建額外的雙元載體，其中dgt-31 v3、dgt-32 v3和dgt-33 v3融合于前文所述 的葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列。例如，TraP8 v2序列融合于dgt-31 v3、dgt-32 v3和dgt-33 v3,并 克隆進(jìn)入上述的雙元載體中。
[0171] 構(gòu)建含有I類基因（dgt-l、dgt-3和dgt-7)的雙元載體。構(gòu)建下列雙元載體并轉(zhuǎn) 化至植物中：PDAB4104,其含有美國專利申請公開No. 2011/0124503中描述的dgt-1 v4序 列，側(cè)翼為美國專利申請公開No. 2009/0064376中描述的Nicotiana tabacum Osmotin序 列；PDAB102715 ;pDAB102716 ;pDAB102717 ;和 pDAB102785。未將用來與 dgt-28、dgt-31、 dgt-32和dgt-33融合的各種TraP葉綠體轉(zhuǎn)運肽添加至I類基因，因為這些植物衍生的序 列具有天然的植物葉綠體轉(zhuǎn)運肽。這些載體詳細(xì)描述于表1中。
[0172] 表1含I類EPSP合酶基因（即dgt-1、dgt-3或dgt-7)的雙元載體的描述。

【權(quán)利要求】
1. 分尚的核酸分子，其包含： 編碼人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列，該核苷酸序列衍生自從5-烯醇式丙酮酰莽草 酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)的比對得到的參考核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，還包含可操作地連接于所述編碼人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽 的核苷酸序列的感興趣的核苷酸序列。
3. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述參考核苷酸序列是從分離自選自下組的種 的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)的比對得到的：蕓苔屬的種（Brassica sp·)、大豆屬的種（Glycine max sp·)、擬南芥屬的種（Arabidopsis sp.)和 Duneila sp.。
4. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述參考核苷酸序列是從選自SEQ ID N0:l-10 的多肽的比對得到的。
5. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽與SEQ ID N0:11的葉綠 體轉(zhuǎn)運肽至少80 %相同。
6. 權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽與SEQ ID N0:11的葉綠 體轉(zhuǎn)運肽至少85 %相同。
7. 權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其中所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽與SEQ ID N0:11的葉綠 體轉(zhuǎn)運肽至少90 %相同。
8. 權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽與SEQ ID N0:11的葉綠 體轉(zhuǎn)運肽至少95 %相同。
9. 權(quán)利要求8的分離的核酸分子，其中所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽與SEQ ID N0:11的葉綠 體轉(zhuǎn)運肽至少98 %相同。
10. 權(quán)利要求9的分離的核酸分子，其中所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽包含SEQ ID NO: 11。
11. 權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述編碼人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列能 夠與SEQ ID NO: 12的核酸特異性雜交。
12. 權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其還包含至少一個額外的核苷酸序列，每個核苷 酸序列編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽，其中所述額外的核苷酸序列可操作地連接于感興趣的核苷酸序 列。
13. 權(quán)利要求12的分離的核酸分子，其中所述至少一個額外的核苷酸序列來自選自下 組的生物：原核生物、低級光合真核生物和綠藻。
14. 權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所述編碼人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列和感興趣 的核苷酸序列可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列。
15. 權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼包含由所述感興趣的核苷 酸序列編碼的肽和所述人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽的嵌合多肽。
16. 由權(quán)利要求15的核酸分子編碼的嵌合多肽。
17. 權(quán)利要求16的嵌合多肽，其中由所述感興趣的核苷酸序列編碼的肽被導(dǎo)向含質(zhì)體 細(xì)胞中的質(zhì)體。
18. 權(quán)利要求17的嵌合多肽，其中所述多肽包含人造葉綠體轉(zhuǎn)運肽，該人造葉綠體轉(zhuǎn) 運肽在所述由感興趣的核苷酸序列編碼的肽被導(dǎo)向到所述質(zhì)體時被移除。
19. 權(quán)利要求16的嵌合多肽，其中所述由感興趣的核苷酸序列編碼的肽為生物活性 肽。
20. 權(quán)利要求16的嵌合多肽，其中所述由感興趣的核苷酸序列編碼的肽是熒光肽。
21. 權(quán)利要求19的嵌合多肽，其中所述生物活性肽選自下組：乙酰乳酸合酶（ALS)、突 變的ALS、ALS的前體、3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶（EPSPS)、CP4EPSPS和III 類 EPSPS。
22. 權(quán)利要求19的嵌合多肽，其中所述生物活性肽為DGT-28或Cry2Aa。
23. 權(quán)利要求19的嵌合多肽，其中所述生物活性肽參與選自下組的過程：除草劑抗性， 病毒抗性，細(xì)菌病原體抗性，昆蟲抗性，線蟲抗性，真菌抗性，植物活力，植物產(chǎn)量，溫度耐受 性，土壤條件耐受性，低光照水平耐受性，低水位耐受性，高水位耐受性，化學(xué)環(huán)境耐受性， 種子顏色，淀粉改性，氨基酸合成，光合作用，脂肪酸合成，油合成，類胡蘿卜素合成，萜類合 成，淀粉合成，和除草劑抗性。
24. 權(quán)利要求19的嵌合多肽，其中所述生物活性肽參與除草劑抗性。
25. -種植物材料，其包含權(quán)利要求2的核酸分子。
26. 權(quán)利要求35的植物材料，其中所述植物材料選自植物細(xì)胞、植物組織、植物組織培 養(yǎng)物、愈傷組織培養(yǎng)物、植物部分、和全植物。
27. 權(quán)利要求25的植物材料，其中所述核酸分子穩(wěn)定地整合在來自該植物材料的細(xì)胞 的基因組中。
28. -種制備轉(zhuǎn)基因植物材料的方法，該方法包括： 獲得權(quán)利要求2的分離的核酸分子；和 用所述核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料。
29. 通過根據(jù)權(quán)利要求28的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物材料。
30. 分離的核酸分子，其包含用于將多肽導(dǎo)向至葉綠體的EPSPS衍生的手段。
31. 權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其還包含可操作地連接于所述用于將多肽導(dǎo)向至 葉綠體的EPSPS衍生的手段的感興趣的核苷酸序列。
32. 權(quán)利要求31的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼嵌合多肽，所述嵌合多肽 包含由所述感興趣的核苷酸序列編碼的肽。
33. -種植物表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求31的核酸分子。
34. -種植物材料，其包含權(quán)利要求33的核酸分子。
35. -種制備轉(zhuǎn)基因植物材料的方法，所述方法包括： 獲得權(quán)利要求31的分離的核酸分子；和 用所述核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述植物材料選自下組：植物細(xì)胞、植物組織、植物 組織培養(yǎng)物、愈傷組織培養(yǎng)物、植物部分、和全植物。
37. 通過根據(jù)權(quán)利要求35的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物材料。
38. 由權(quán)利要求37的轉(zhuǎn)基因植物材料再生的轉(zhuǎn)基因植物。
39. 權(quán)利要求26的植物材料，其中所述植物材料是不能被再生以生成植物的植物細(xì) 胞。
40. 權(quán)利要求28的方法，其中所述植物材料是不能被再生以生成植物的植物細(xì)胞。
【文檔編號】A01H5/00GK104219949SQ201380017054
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】J·M·里拉, R·M·西奇洛, C·耶基斯, A·E·魯賓遜 申請人:陶氏益農(nóng)公司