專利名稱：檢測葉綠體dna鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項發(fā)明涉及一種檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法。
背景技術(shù)：
1966年，日本學(xué)者新城長友育成了由細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核共同控制的BT型(以印度秈稻品種Chinsuran Boro II為細(xì)胞質(zhì)供體，以粳稻品種作核供體選育而成)三系不育系。1970年，袁隆平、李必湖等在海南野生稻中發(fā)現(xiàn)一株雄性不育株，通過核置換培育成了 “野敗”型三系不育系。隨后以海南紅芒野生稻與秈稻品種蓮塘早雜交選育成了紅蓮型三系不育系。再后育成了 K型、網(wǎng)型、印水型等。由于這些細(xì)胞質(zhì)除與雄性不育有關(guān)外，沒有細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記性狀，無法通過普通生物學(xué)性狀對其細(xì)胞質(zhì)進行區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法，通過簡單的對三系不育水稻葉綠體DNA的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序即可鑒定三系不育水稻的細(xì)胞質(zhì)類型。本發(fā)明所述的檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法，包括以下步驟
(I)提取三系不育水稻葉片中的葉綠體DNA ；
(2 )用葉綠體弓丨物cp I、cp2、cp3、cp9對步驟(I)提取的葉綠體DNA進行PCR擴增；
(3)對所得PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序；
(4)將所得堿基序列與三系不育水稻葉綠體DNA分子指紋對比，確定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型。本發(fā)明所述的檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法，在鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型時只需對葉綠體引物cpl、cp2、cp3、cp9的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，再與葉綠體DNA分子指紋進行比較即可簡單、高效的鑒定出三系不育水稻的細(xì)胞質(zhì)類型。
具體實施例方式本發(fā)明以32份典型秈稻和典型粳稻細(xì)胞質(zhì)為對照，對不同來源的17個三系不育系葉綠體DNA序列進行分析，發(fā)現(xiàn)不同類型不育細(xì)胞質(zhì)具有特征性堿基或堿基序列，以葉綠體引物cpl、cp2、cp3、cp9的擴增序列差異建立了野敗型、紅蓮型及BT型三種葉綠體DNA 分子指紋。以常規(guī)水稻日本晴為對照，對V20A等三系不育系的葉綠體DNA的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，其序列結(jié)果見表I。表I
權(quán)利要求
1.一種檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法，其特征在于包括以下步驟提取三系不育水稻葉片中的葉綠體DNA ；用葉綠體弓I物cpI、cp2、cp3、cp9對步驟(I)提取的葉綠體DNA進行PCR擴增；對所得PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序；將所得堿基序列與三系不育水稻葉綠體DNA分子指紋對比，確定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法， 其特征在于所述葉綠體引物cpl :正向序列5-gtggacctgactccttgaa_3,反向序列 5-agccgaggtcgtggtaa-3 ;所述葉綠體引物 cp2 :正向序列 5-gcagcccaagcgagact_3, 反向序列 5-aaggctcggcgatactg-3 ；cp3 :正向序列 5_ttttctcctcatacggct_3,反向序列 5_tagtctgttctattcgtccc_3 ；cp9 :正向序列 5_tcaagcatctcggttcg_3，反向序列 5-cgcctcattagcccatac_30
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法，其特征在于所述三系不育水稻葉綠體DNA分子指紋野敗型細(xì)胞質(zhì)cpl擴增序列第248-316位缺失、cp2擴增序列第163-194位為1-32片段、cp3擴增序列第220-225位為gttgag、第595位為t、cp9段擴增序列第540-543位為 gctt ；紅蓮型細(xì)胞質(zhì)cpl擴增序列第248-316位缺失、cp2擴增序列第163-194位為1-32片段、cp3擴增序列第220-225位缺失、第595位為g、cp9擴增序列第540-543位為gctt ；BT型細(xì)胞質(zhì)cpl擴增序列第248-316位為1_69基因片段、cp2擴增序列第163-194位缺失、cp3擴增序列第220-225位缺失、第595位為t、cp9擴增序列第540-543位為gctt ；所述 1-32 片段表不插入片段序列ttaacaaatt、cttagagtat、ttctggtaga、at ;所述 1-69 片段表不插入片段序列ttactttttt、tcagaatcct、atttttgttc、ttatacccat、 gcaatagaga、gcgagtggga、aaagggagg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測葉綠體DNA鑒定三系不育水稻細(xì)胞質(zhì)類型的方法，以水稻葉片為材料，提取葉片中的葉綠體DNA，用葉綠體引物cp1、cp2、cp3、cp9進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行克隆測序，再與三系不育水稻葉綠體DNA分子指紋進行比較即可簡單、高效的鑒定出三系不育水稻的細(xì)胞質(zhì)類型。
文檔編號C12Q1/68GK102605054SQ20121003454
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者戴小軍, 李文嘉, 梁滿中, 陳良碧 申請人:湖南師范大學(xué)