一種藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒與測試方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒和測試方法，該檢測試劑盒包括測試條單元，所述測試條單元包括條狀的培養(yǎng)基盒和藥物盒，所述培養(yǎng)基盒和藥物盒分別具有徑向排列的培養(yǎng)基容格和藥物容格，所述培養(yǎng)基容格可對應(yīng)插入所述藥物容格內(nèi)，藥物盒、培養(yǎng)基盒穩(wěn)定且易于保存運輸，可以做成試劑盒長期保存；試驗操作簡單方便；采用本發(fā)明的測試方法，試驗結(jié)果易于觀察和判斷；可以用于慢生長細(xì)菌/真菌的藥敏試驗，如真菌、厭氧菌等；實驗操作和廢物處理具有很高的生物安全性。
【專利說明】一種藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒與測試方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒與測試方法，屬于藥物測定設(shè)備和測定方法的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌藥物的敏感試驗常用的方法有紙片法、稀釋法和E-test法，紙片法藥敏試驗屬定性試驗方法，雖然方便但提供的信息較少，不能對各種敏感藥物之間進(jìn)行比較和擇優(yōu)選用。稀釋法有肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，肉湯法又有試管肉湯稀釋法和微量稀釋法之分。試管稀釋法操作繁瑣，不利于大量檢測；微量稀釋法雖然較試管稀釋法的試劑和標(biāo)本用量少，但仍然比較麻煩且結(jié)果閱讀沒有試管稀釋法清晰；瓊脂稀釋法利于大量檢測，但不適用于常規(guī)個別臨床標(biāo)本的檢測，而且只能現(xiàn)做試驗現(xiàn)配含藥培養(yǎng)平板，亦比較麻煩。E-test法結(jié)合了紙片法方便和稀釋法可以給出MIC的優(yōu)點，但價格較貴且MIC結(jié)果不是很準(zhǔn)。綜上所述可知，現(xiàn)有技術(shù)的抗菌藥物敏感試驗的常用方法已經(jīng)不能滿足人們的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒與測試方法，滿足目前臨床上的要求，既利于單個操作也利于批量標(biāo)本操作，且又準(zhǔn)確方便，各種不同的抗生素和瓊脂皆為預(yù)制，用時根據(jù)需要自由組合，既能定性又能定量地給出MIC的藥敏試驗方法和試劑，填補了本領(lǐng)域的空白，滿足了市場的迫切需要，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的缺憾。
[0004]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn):
細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括測試條單元，所述測試條單元包括條狀的培養(yǎng)基盒和藥物盒，所述培養(yǎng)基盒和藥物盒分別具有徑向排列的培養(yǎng)基容格和藥物容格，所述培養(yǎng)基容格可對應(yīng)插入所述藥物容格內(nèi)，所述培養(yǎng)基容格內(nèi)預(yù)制有固態(tài)培養(yǎng)基，所述藥物容格的底部內(nèi)壁具有一個凸面，所述凸面上設(shè)置有抗菌藥物。
[0005]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基容格內(nèi)壁的中部設(shè)置有腰線，所述腰線是向中軸線方向突出的突起。
[0006]進(jìn)一步的，還包括盒狀培養(yǎng)架，所述盒狀培養(yǎng)架上具有鏤空的通槽，所述測試條單元可卡接于所述通槽內(nèi)。
[0007]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基盒的頂部和底部分別設(shè)置有片狀的、可分離的塑料薄膜。
[0008]進(jìn)一步的，所述盒狀培養(yǎng)架上的一側(cè)設(shè)置有對照標(biāo)識板。
[0009]進(jìn)一步的，所述對照標(biāo)識板包括陽性對照標(biāo)識、陰性對照標(biāo)識和數(shù)字刻度標(biāo)識。
[0010]本發(fā)明還提供一種細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟:
⑴藥物盒、藥物盒蓋、培養(yǎng)基 盒主體、培養(yǎng)基盒底部、盒狀培養(yǎng)架和培養(yǎng)基包裝盒的模壓制備；⑵藥物盒、藥物盒蓋、培養(yǎng)基盒主體、培養(yǎng)基盒底部的滅菌；
⑶在相對無菌條件下將一定量的抗菌藥物溶液加入藥物盒小格中，真空干燥；
⑷培養(yǎng)基盒底部粘貼有塑料薄膜；
(5)以液體培養(yǎng)基為溶質(zhì)，無菌配制一定濃度的溶膠注入培養(yǎng)基盒小格中，使其凝固制成固態(tài)培養(yǎng)基；然后在培養(yǎng)基盒上表面封一層塑料薄膜。
[0011](6)將藥物盒、藥物盒蓋無菌包裝于塑料袋或者塑料盒中。
[0012](7)若干支培養(yǎng)基盒一起裝入培養(yǎng)基包裝盒。
[0013](8)大包裝的藥物盒，培養(yǎng)基盒以鈷60輻照方式滅菌。
[0014]本發(fā)明具備的有益技術(shù)效果是:藥物盒、培養(yǎng)基盒穩(wěn)定且易于保存運輸，可以做成試劑盒長期保存；試驗操作簡單方便；試驗結(jié)果易于觀察和判斷；可以用于慢生長細(xì)菌/真菌的藥敏試驗，如真菌、厭氧菌等；實驗操作和廢物處理具有很高的生物安全性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明檢測試劑盒的分解結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖2是培養(yǎng)基盒及塑料薄膜的操作步驟示意圖。
[0017]圖3是培養(yǎng)基盒容格的局部放大圖。
[0018]圖4是藥物盒的局部放大圖。 【具體實施方式】
[0019]通過下面對實施例的描述，將更加有助于公眾理解本發(fā)明，但不能也不應(yīng)當(dāng)將 申請人:所給出的具體的實施例視為對本發(fā)明技術(shù)方案的限制，任何對部件或技術(shù)特征的定義進(jìn)行改變和/或?qū)φw結(jié)構(gòu)作形式的而非實質(zhì)的變換都應(yīng)視為本發(fā)明的技術(shù)方案所限定的保護(hù)范圍。
[0020]附圖標(biāo)記說明:藥物盒蓋1、頂部塑料薄膜2、培養(yǎng)基盒3、底部塑料薄膜4、藥物盒
5、陽性對照標(biāo)識6、數(shù)字刻度標(biāo)識7、陰性對照標(biāo)識8、盒狀培養(yǎng)架9、培養(yǎng)基10、腰線11、抗菌藥物12、凸面13、藥物濃度梯度14。
[0021]細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括測試條單元，測試條單元包括條狀的培養(yǎng)基盒3和藥物盒5，培養(yǎng)基盒3和藥物盒5分別具有徑向排列的培養(yǎng)基容格和藥物容格，培養(yǎng)基容格可對應(yīng)插入藥物容格內(nèi)。檢測試劑盒還包括盒狀培養(yǎng)架9，盒狀培養(yǎng)架9上具有鏤空的通槽，測試條單元可卡接于通槽內(nèi)。檢測試劑盒的上方設(shè)置有藥物盒蓋1，在盒狀培養(yǎng)架9上的一側(cè)設(shè)置有對照標(biāo)識板，對照標(biāo)識板包括陽性對照標(biāo)識6、陰性對照標(biāo)識8和數(shù)字刻度標(biāo)識7。每個測試條單元可以檢測一種藥物的MIC，若干測試條單元可以根據(jù)使用者的需要組成一組并放入盒狀培養(yǎng)架9中，置于特定環(huán)境培養(yǎng)，以測量試驗菌對于一組藥物的MIC。盒狀培養(yǎng)架9為長方形的盒狀物體，藥物盒5與培養(yǎng)基盒3組成的測試條可以橫向放在培養(yǎng)架上，每個培養(yǎng)架可以容納5個測試條，盒狀培養(yǎng)架9上表面橫向的邊緣，標(biāo)有“ + 標(biāo)志和數(shù)字，縱向的邊緣有防呆設(shè)計，盒狀培養(yǎng)架9可以重復(fù)使用。
[0022]在本實施例中，培養(yǎng)基盒3和藥物盒5的容格為一排，各個容格并列緊鄰形成容格組，當(dāng)然在其他實施例中可以根據(jù)需要設(shè)置成不同的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，以滿足不同場合的需求，并不局限于本實施例中的應(yīng)用。在培養(yǎng)基盒3的頂部和底部分別設(shè)置有片狀的、可分離的塑料薄膜，塑料薄膜包括頂部塑料薄膜2和底部塑料薄膜4，頂部、底部塑料薄膜通過粘貼的方式分別固定在培養(yǎng)基盒3的上、下表面，培養(yǎng)基容格內(nèi)預(yù)制有固態(tài)培養(yǎng)基，藥物容格的底部內(nèi)壁具有一個凸面，凸面上設(shè)置有抗菌藥物，培養(yǎng)基容格內(nèi)壁的中部設(shè)置有腰線11，腰線11是向中軸線方向突出的突起。
[0023]在本實施例中，藥物盒5的技術(shù)關(guān)鍵點在于藥物盒容格的不同濃度的藥物是預(yù)先計算并且配制好的，而且不同濃度的藥物是被物理分隔的。每一個單獨的藥物盒容格的底部設(shè)計為凸面，格內(nèi)底部含有干燥的抗菌藥物，這些抗菌藥物的量由小到大(或由大到小)規(guī)律排列。小格內(nèi)壁有若干排氣槽16，便于培養(yǎng)基盒3插入時排出腔內(nèi)空氣。藥物盒5的一頭有突出的藥物名稱標(biāo)識15，上面用顏色和字母作為標(biāo)志，表明盒內(nèi)裝有的藥物名稱，同時可保證正確識別藥物濃度梯度的方向，不同類型的抗生素以不同的色系標(biāo)志，同類的不同抗生素以同一色系的不同顏色標(biāo)志。
[0024]在本實施例中，培養(yǎng)基盒3的技術(shù)關(guān)鍵點在于，由一系列獨立的培養(yǎng)基容格組成，培養(yǎng)基容格里面裝有預(yù)制的固態(tài)培養(yǎng)基(主要由瓊脂組成)，底部可以揭去，盒壁設(shè)計有特殊的腰線11以防底部揭去時瓊脂滑落；將底部揭去之后，培養(yǎng)基盒上的小格可以一一對應(yīng)地插入藥物盒上的小格，培養(yǎng)基盒的設(shè)計使得盒蓋I的滑入引入的壓力使瓊脂培養(yǎng)基與藥物盒小格底部的抗菌藥物接觸，同時又保持透氣。培養(yǎng)基盒3中預(yù)裝有培養(yǎng)基，培養(yǎng)基盒3的體積預(yù)先設(shè)計成抗生素溶解后可以達(dá)到設(shè)計濃度，成分酷斃適用于不同生長需要的細(xì)菌和/或真菌，并且可以長期貯存。一個培養(yǎng)基盒3可以與一個藥物盒5組成一個藥敏測試條單元，每個測試條單元可以檢測一種藥物的MIC，可根據(jù)實際需要，自由選擇若干測試條單元組成一組。
[0025]預(yù)制抗菌素濃度梯度:在一個條狀的塑料藥物盒上有一系列小格(藥物盒容格)，每一個小格(藥物盒容格)的底部加入一定量的抗菌藥溶液，使各格中的加入量呈遞增(或遞減)變化，在負(fù)壓的情況`下使抗菌藥溶液干燥，加蓋4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026]預(yù)制瓊脂(或其他凝膠)培養(yǎng)基:用培養(yǎng)細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)基配制溶膠液，加入條狀培養(yǎng)基盒上的一系列小孔中，利用物理法(如降低溫度)或化學(xué)法使溶膠凝固，密封包裝4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]預(yù)制抗菌素和預(yù)制培養(yǎng)基組合成一個測試條單元:使用時將培養(yǎng)基盒底部和上表面薄膜揭去，培養(yǎng)基盒上的小格可一一對應(yīng)插入藥物盒上的小格。加蓋壓緊后，致使小格底部的抗菌藥接觸固態(tài)培養(yǎng)基并溶入瓊脂膠塊中使抗菌藥形成一定的藥物濃度。使用時將受試細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于培養(yǎng)基盒每個小格中固態(tài)培養(yǎng)基的上表面，加蓋35°C培養(yǎng)16-20小時后肉眼觀察結(jié)果；當(dāng)藥物濃度高于細(xì)菌的MIC時，凝膠表面無菌生長，當(dāng)藥物濃度低于MIC時，細(xì)菌在培養(yǎng)基的表面將生長出菌苔；無菌生長的最小藥物濃度即受試菌株對于該抗菌藥的MIC值。
[0028]測試條單元的制備方法包括如下步驟:
1)藥物盒5、藥物盒蓋1、培養(yǎng)基盒3主體、培養(yǎng)基盒3底部、盒狀培養(yǎng)架9和培養(yǎng)基包裝盒的模壓制備；
2)藥物盒5、藥物盒蓋1、培養(yǎng)基盒3主體、培養(yǎng)基盒3底部的滅菌；
3)在相對無菌條件下將一定量的抗菌藥物溶液加入藥物盒的藥物盒容格中，真空干燥；
4)培養(yǎng)基盒3底部粘貼有塑料薄膜；
5)以液體培養(yǎng)基為溶質(zhì)，無菌配制一定濃度的溶膠注入培養(yǎng)基盒3的培養(yǎng)基盒容格中，使其凝固制成固態(tài)培養(yǎng)基；然后在培養(yǎng)基盒3上表面封一層塑料薄膜。
[0029]6)將藥物盒5、藥物盒蓋I無菌包裝于塑料袋或者塑料盒中。
[0030]7 )若干支培養(yǎng)基盒3 —起裝入培養(yǎng)基包裝盒。
[0031]8)大包裝的藥物盒5、培養(yǎng)基盒以鈷60輻照方式滅菌，室溫或4°C儲存。
[0032]細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測方法的實施例:
實施例1:
細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測方法，該方法包括如下步驟:
1)模壓制備的藥物盒、培養(yǎng)基盒模具，輔照滅菌；
2)將頭孢噻月虧配成3.75、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0、240.0、480.0、960.0、
1920.0 μ g/ml的濃度，分別加入到藥物盒的小格，只放到第二格至第十一格，第一格和第十二格不加藥液，每格13 μ 1，負(fù)壓干燥備用；
3)MH肉湯中加入1.2%的瓊脂，隔水煮沸使瓊脂溶`解，高壓滅菌，121°C 15分鐘；
4)吸取適量1.2%的熱瓊脂溶液無菌注入培養(yǎng)基盒中，培養(yǎng)基盒采用內(nèi)部尺寸為底面半徑3.25mmX高6_的圓形小格，凝膠條的厚度約為6mm,待其冷卻凝固后,裝入培養(yǎng)基包裝盒中備用；
5)將各種實驗菌株(見表1)接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，35°C過夜培養(yǎng)，翌日取純培養(yǎng)平板上的4-5個相同形態(tài)的菌落用生理鹽水制成均勻菌懸液，并調(diào)節(jié)其濁度至0.5McFarland濁度；
6)將瓊脂培養(yǎng)基盒底部薄膜揭去，插入藥物盒中，使藥物盒中的抗生素擴散至瓊脂，含藥小格中瓊脂的藥物最終濃度依次為0.25,0.5、1.0,2.0,4.0,8.0、16.0,32.0,64.0和128.0 μ g/ml ；
7)以棉拭蘸取0.5McFarland濁度的菌液涂布于各小格瓊脂塊的表面，菌液涂布方向為自左至右，即藥物濃度自低至高，自右至左滑上盒蓋，置濕盒中37°C孵育16-20小時后觀察結(jié)果，以不長菌之方格的最小藥物濃度為MIC值，無藥對照瓊脂塊上的菌苔應(yīng)生長良好；
8)同時采用試管肉湯稀釋法對上述實驗菌進(jìn)行MIC測定。
[0033]實施例2:
本實例仍采用圓形小格內(nèi)部尺寸為4_X6_ (底面半徑X高)的藥物盒，分成十二個小格。但實驗菌采用肺炎鏈球菌，有關(guān)制備和試驗過程如下:
1)模壓制備的藥物盒、培養(yǎng)基盒模具，輔照滅菌；
2)阿莫西林配成0.9、1.8,3.75,7.5、15、30、60、120、240、480 μ g/ml 的濃度，分別加入到藥物盒，第二格至第十一格，第一格和第十二格不加藥液，每格13 μ 1，負(fù)壓干燥備用；
3)CAMHB肉湯中加入1.2%的瓊脂，隔水煮沸使瓊脂溶解，高壓滅菌121°C 15分鐘，待瓊脂溫度降至50°C時無菌加入2.5%的LHB混勻，所述CAMHB肉湯為調(diào)節(jié)過陽離子濃度的MH肉湯；
4)吸取適量熱瓊脂溶液無菌注入培養(yǎng)基盒中，培養(yǎng)基盒小圓格內(nèi)部的尺寸為底面半徑
3.25mmX高6mm，凝膠條的厚度約為6mm，待其冷卻凝固后，裝入培養(yǎng)基包裝盒中備用；5)各種實驗菌株(見表2)接種于羊血瓊脂平板上，35°C 5%0)2過夜培養(yǎng)，翌日取純培養(yǎng)平板上的4-5個相同形態(tài)的菌落用生理鹽水制成均勻菌懸液，并調(diào)節(jié)其濁度至
0.5McFarland 池度；
6)將瓊脂培養(yǎng)基盒底部薄膜揭去，插入藥物盒中，使藥物盒中的抗生素擴散至瓊脂，含藥小格中的藥物最終濃度依次為0.06,0.12,0.25,0.5、1.0,2.0,4.0,8.0、16和32 μ g/ml ；
7)以棉拭蘸取0.5McFarland濁度的菌液涂布于各小格瓊脂塊的表面。菌液涂布方向為自左至右即藥物濃度自低至高，自右至左滑上盒蓋，置濕盒中37°C孵育16-20小時后觀察結(jié)果，以不長菌之方格的最小藥物濃度為MIC值，無藥對照瓊脂塊上的菌苔應(yīng)生長良好；
8)同時采用試管肉湯稀釋法對上述實驗菌進(jìn)行MIC測定。
[0034]兩種方法的檢測結(jié)果見表2。
[0035]表1:頭孢噻I虧用本法和試管肉湯稀釋法對于30株致病菌的MIC測定結(jié)果(mg/L)比較
【權(quán)利要求】
1.細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒包括測試條單元，所述測試條單元包括條狀的培養(yǎng)基盒和藥物盒，所述培養(yǎng)基盒和藥物盒分別具有徑向排列的培養(yǎng)基容格和藥物容格，所述培養(yǎng)基容格可對應(yīng)插入所述藥物容格內(nèi)，所述培養(yǎng)基容格內(nèi)預(yù)制有固態(tài)培養(yǎng)基，所述藥物容格的底部內(nèi)壁具有一個凸面，所述凸面上設(shè)置有抗菌藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，所述培養(yǎng)基容格內(nèi)壁的中部設(shè)置有腰線，所述腰線是向中軸線方向突出的突起。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，還包括盒狀培養(yǎng)架，所述盒狀培養(yǎng)架上具有鏤空的通槽，所述測試條單元可卡接于所述通槽內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，所述培養(yǎng)基盒的頂部和底部分別設(shè)置有片狀的、可分離的塑料薄膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，所述藥物容格內(nèi)設(shè)置有排氣槽，所述排氣槽縱向設(shè)置在藥物容格的內(nèi)壁上。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，所述盒狀培養(yǎng)架上的一側(cè)設(shè)置有對照標(biāo)識板。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒，其特征在于，所述對照標(biāo)識板包括陽性對照標(biāo)識、陰性對照標(biāo)識和數(shù)字刻度標(biāo)識。
8.細(xì)菌/真菌藥物敏感試驗用濃度梯度檢測試劑盒方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 1)模壓制備的藥物盒、培`養(yǎng)基盒模具，輔照滅菌； 2)將頭孢噻肟配成濃度成倍遞增的十份，分別加入到藥物盒的小格，只放到第二格至第H 格，第一格和第十二格不加藥液，負(fù)壓干燥備用； 3)MH肉湯中加入瓊脂，隔水煮沸使瓊脂溶解，高壓滅菌； 4)吸取適量熱瓊脂溶液無菌注入培養(yǎng)基盒中，待其冷卻凝固后，裝入培養(yǎng)基包裝盒中備用; 5)將各種實驗菌株接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)，翌日取純培養(yǎng)平板上的4-5個相同形態(tài)的菌落用生理鹽水制成均勻菌懸液，并調(diào)節(jié)其濁度至0.3~IMcFarland濁度； 6)將瓊脂培養(yǎng)基盒底部薄膜揭去，插入藥物盒中，使藥物盒中的抗生素擴散至瓊脂； 7)以棉拭蘸取經(jīng)步驟(5)得到的菌液涂布于各小格瓊脂塊的表面，菌液涂布方向為自左至右，即藥物濃度自低至高，自右至左滑上盒蓋，置濕盒中孵育16-20小時后觀察結(jié)果，以不長菌之方格的最小藥物濃度為MIC值，無藥對照瓊脂塊上的菌苔應(yīng)生長良好； 8)同時采用試管肉湯稀釋法對上述實驗菌進(jìn)行MIC測定。
【文檔編號】C12M1/34GK103820310SQ201410051738
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月15日
【發(fā)明者】童明慶, 金棟, 張怡 申請人:江蘇中新醫(yī)藥有限公司