一種制備頭孢氨芐的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備頭孢氨芐的方法，該方法是將左旋苯甘氨酸酯類衍生物與7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.6:1的比例投料，再按照7-ADCA1~2倍的投料量加入催化劑青霉素?；高M(jìn)行?；磻?yīng)；其中所述的青霉素?；钙渚幋a的基因序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明有效克服了酶縮合反應(yīng)過程中的逆反應(yīng)，由此大大降低了側(cè)鏈的使用量、避免了側(cè)鏈過高消耗所導(dǎo)致的產(chǎn)品雜質(zhì)多的問題，由此也避免了目的產(chǎn)物難以純化的問題。與此同時，本發(fā)明方法還大大提高了7-ADCA的轉(zhuǎn)化率（采用本發(fā)明方法可使7-ADCA平均轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上），由此也進(jìn)一步提高了產(chǎn)品品質(zhì)，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種制備頭孢氨芐的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗生素合成技術(shù)，具體的說是一種制備頭孢氨芐的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]頭孢氨節(jié),英文名稱Cephalexin,是一種半合成β -內(nèi)酰胺類抗生素,具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌作用，其作用機(jī)理是通過抑制細(xì)胞壁的合成，使細(xì)胞內(nèi)容物膨脹至破裂溶解，從而達(dá)到殺菌作用。
[0003]頭孢氨芐的合成工藝主要有化學(xué)方法合成和酶法合成兩種，化學(xué)合成法是在二氯甲烷溶劑中從左旋苯甘氨酸乙基鄧鉀鹽混酐后，與經(jīng)過羧基保護(hù)的7ADCA進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)化學(xué)方法縮合而得到頭孢氨芐。最終每生產(chǎn)Ikg頭孢氨芐會產(chǎn)生IOkg以上的三廢。在這種情況下，酶法合成工藝逐漸受到更多的關(guān)注和研究。酶法合成技術(shù)是在青霉素?；傅拇呋?，通過用側(cè)鏈(即左旋苯甘氨酸衍生物，如苯甘氨酸甲(乙)酯及其鹽、苯甘氨酰胺及其鹽等)對7-ADCA進(jìn)行?；磻?yīng)來生產(chǎn)頭孢氨芐，使側(cè)鏈與7-ADCA縮合制得頭孢氨芐。這一工藝已被專利文獻(xiàn)廣泛描述，如CN100368554C、CN1063491C及CN02826109.7等。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比較，酶法合成無論從降低成本、簡化工藝，還是從環(huán)境友好等方面考慮，都具有明顯優(yōu)勢。但其仍有許多不盡人意之處。如:現(xiàn)有酶法合成頭孢氨芐的工藝其酶縮合反應(yīng)過程中存在較嚴(yán)重的酶解反應(yīng)，即反應(yīng)產(chǎn)物在酶的作用下再度逆分解成原料，由此大大影響了正反應(yīng)產(chǎn)率。為提高酶縮合反應(yīng)的產(chǎn)率，生產(chǎn)者通常是加大側(cè)鏈對母核的投料量，有的甚至過量4~6倍(摩爾比)，由此又造成側(cè)鏈過高消耗，并在產(chǎn)品中引入了不需要的雜質(zhì)，最終導(dǎo)致產(chǎn)物純度低以及產(chǎn)品分離、純化困難等諸多問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備頭孢氨芐的新方法，以解決現(xiàn)有工藝存在側(cè)鏈投料量大、酶解反應(yīng)嚴(yán)重、產(chǎn)品純度低、制備成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]一種制備頭孢氨芐的方法，該方法是將左旋苯甘氨酸酯類衍生物與7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.6:1的比例投料，再按照I~2倍于7-ADCA的投料量加入催化劑青霉素?；高M(jìn)行酰化反應(yīng)；其中所述的青霉素?；钙渚幋a的基因序列如SEQ ID Ν0:3所示。
[0007]具體的，本發(fā)明的方法包括以下步驟:
[0008]a)將左旋苯甘氨酸酯類衍生物在30~120min內(nèi)緩慢加入到7-ADCA水溶液中，然后加入所述的青霉素?；福?5~25°C進(jìn)行?；磻?yīng)；反應(yīng)過程中PH維持在6.0~7.2 ；
[0009]b)待反應(yīng)終止后，過濾80~120目篩網(wǎng)，即得到濾物一青霉素酰化酶，濾液一頭孢氨節(jié)混懸液；
[0010]c)將頭孢氨芐混懸液過濾，得到頭孢氨芐粗粉。
[0011]所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物為左旋苯甘氨酸甲酯及其鹽、苯甘氨酸乙酯及其鹽中的任意一種。
[0012]優(yōu)選的，所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物為左旋苯甘氨酸甲酯鹽。
[0013]所述左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸鹽。
[0014]加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽固體、左旋苯甘氨酸甲酯鹽溶液或左旋苯甘氨酸甲酯鹽混懸液。
[0015]所述7-ADCA水溶液其質(zhì)量濃度為10~15%，其水溶液的溫度為15~25°C，PH為
7.8 ~8.0。
[0016]a)步所述?；磻?yīng)過程中，使用氨水維持PH在6.0~7.2。
[0017]待a)步所述?；磻?yīng)的反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁之后，開始向反應(yīng)液中緩慢加入純化水。
[0018]具體的，所述a)步，將從開始反應(yīng)至反應(yīng)液開始出現(xiàn)渾濁的時間記為A，當(dāng)反應(yīng)時間為2~3XA時，開始緩慢加入純化水，并在加入純化水的過程中用HPLC法判斷反應(yīng)終點。
[0019]具體的，所加入純化水的量與反應(yīng)液的體積比為0.15~0.5: I ;所述加入純化水的過程用時20~60min。
[0020]優(yōu)選的，所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物與所述7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.3: I的比例投料。
[0021]進(jìn)一步的，所述c)步，用頭孢氨芐混懸液過濾后的濾液洗滌所得到的青霉素酰化酶，然后過濾80~120目篩網(wǎng)，得到濾物一青霉素?；福瑸V液一頭孢氨芐混懸液，然后將頭孢氨芐混懸液再次過濾，得到頭孢氨芐粗粉；重復(fù)本步驟，收集98%以上的頭孢氨芐粗粉。
[0022]更進(jìn)一步的，將上述所收集的全部的頭孢氨芐粗粉與最后所得濾液混合后，用硫酸調(diào)PH至0.1~2.5，然后過0.45 μ m濾膜過濾后得料液，將料液溫度升高至30~60°C、用氨水調(diào)節(jié)料液PH至4.0~6.0，然后養(yǎng)晶、過濾、水洗滌、丙酮洗滌，最后干燥，得終產(chǎn)物。
[0023]上述青霉素?；傅闹苽浞椒ㄈ缦?
[0024]I)構(gòu)建SEQ ID NO:3所示的青霉素?；傅木幋a基因:
[0025]1.1)根據(jù)Genebank中無色桿菌屬CCM4824青霉素酰化酶蛋白序列(SEQ ID NO:1，Genebank:AY919310.1 )，將其第330位苯丙氨酸替換為丙氨酸，第415位賴氨酸替換為精氨酸，第770位亮氨酸替換為苯丙氨酸，在這三個位置引入突變位點，即得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
[0026]1.2)根據(jù)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，使用在線設(shè)計工具Jcat反向設(shè)計出核苷酸序列，針對宿主大腸桿菌表達(dá)所需的優(yōu)選密碼子和基因高效表達(dá)所需的G + C堿基含量，優(yōu)化上述設(shè)計的核苷酸序列為SEQ ID N0:3所示序列，SEQ ID N0:3所示序列與野生型基因序列SEQ ID N0:4相比:大腸桿菌稀有密碼子從野生型(SEQ ID N0:4)的55個降低到了 2個，G + C堿基含量由野生型(SEQ ID NO:4)的68.75%下降到57.25% ;同時在設(shè)計過程中去除BamHI酶切位點，有利后期基因操作。通過上述系列設(shè)計有利于宿主菌大腸桿菌高效表達(dá)該基因(SEQ ID NO:3)。
[0027]2)構(gòu)建含有I)步所述編碼基因的重組載體:
[0028]所述重組載體所用到的質(zhì)粒為PET系列誘導(dǎo)型載體，優(yōu)選PET28質(zhì)粒；[0029]2.1)將SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列進(jìn)行全基因合成，獲得ASPGA基因；
[0030]2.2)將所述PET28質(zhì)粒和所述ASPGA基因分別使用BamH I和Hind III雙酶切體系進(jìn)行酶切，分別得到ASPGA基因片段和PET28質(zhì)粒片段；
[0031]2.3)使用T4連接酶對ASPGA基因片段和PET28質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌中，然后涂布到LB培養(yǎng)抗性平板，然后挑取生長出的陽性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒即得到所構(gòu)建的重組載體——表達(dá)載體PET28-ASPGA。
[0032]3)構(gòu)建含有2)步所述重組載體的重組菌株:
[0033]在E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入所述重組載體混勻，然后經(jīng)過冷卻、熱激、冷卻、復(fù)蘇等步驟，完成轉(zhuǎn)化，吸取轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布加有卡那霉素抗生素的平板，倒置培養(yǎng)，生長出的菌株即為重組菌株——轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/PET28-ASPGA 或轉(zhuǎn)化體 JM109 (DE3) /PET28-ASPGA ；
[0034]構(gòu)建重組菌株時所用的宿主細(xì)胞可選擇生工生物工程(上海)有限公司出售的E.coliBL21(DE3)或 E.coli JM109(DE3)。
[0035]4)步驟3)所述重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá):
[0036]挑取上述重組菌株的單菌落于含Kan (濃度50 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min條件下培養(yǎng)8~IOh后成為活化種子，然后將活化種子以2%的接種量接種到M9培養(yǎng)基中(裝液量 為50ml/250ml)，23°C、200r/min條件下培養(yǎng)14h后，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)使其終濃度為0.05mM,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)12h，得菌液。
[0037]5)粗制酶液的制備及其進(jìn)一步的分離純化和固定化
[0038]5.1)將4)步得到的菌液離心，收集菌體，然后加入與菌液等體積的磷酸鹽緩沖液(0.02M, PH8.0)重懸，使用超聲細(xì)胞破壁儀破壁20min，然后離心取上清，即為粗制酶液；
[0039]5.2)粗制酶液1L，使用0.01M的鹽酸調(diào)整PH至5.5，于50°C下保溫30min，然后離心除去沉淀；在上清液中加入15% (質(zhì)量體積比)的硫酸銨，充分混合后離心除去沉淀，然后在上清液中再次加入15% (質(zhì)量體積比)的硫酸銨，充分混合后離心收集沉淀；將沉淀溶解于200ml磷酸鹽緩沖液(0.2M，PH8.0)中，即得到濃縮酶液；
[0040]5.3)取濃縮酶液200ml，加入磷酸鹽使其終濃度為0.4M，并調(diào)節(jié)PH至6.8~7.2，然后加入活化好的LX-1000HA載體20g，于25°C、150rpm條件下攪拌固定化24h，真空抽濾后收集固定化酶，用2倍體積去離子水沖洗3-5遍，過濾收集得到固定化酶，即為a)步所述其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的青霉素?；浮?br> [0041]本發(fā)明有效克服了酶縮合反應(yīng)過程中的逆反應(yīng)，由此大大降低了側(cè)鏈的使用量、避免了側(cè)鏈過高消耗所導(dǎo)致的產(chǎn)品雜質(zhì)多的問題，由此也避免了目的產(chǎn)物難以純化的問題。與此同時，本發(fā)明方法還大大提高了 7-ADCA的轉(zhuǎn)化率(采用本發(fā)明方法可使7-ADCA平均轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上)，由此也進(jìn)一步提高了產(chǎn)品品質(zhì)，降低了生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1是本發(fā)明所述其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的青霉素酰化酶的重組載體。
[0043]圖2是本發(fā)明所制備的頭孢氨芐的HPLC譜圖?！揪唧w實施方式】
[0044]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不以任何方式意味著對本發(fā)明的保護(hù)范圍做任何限制。
[0045]以下實施例1~6中，進(jìn)行HPLC分析的條件為:
[0046]填充劑:十八烷基硅烷鍵合硅膠；
[0047]流動相A:0.01mol/L醋酸鈉水溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0);流動相B:甲醇；流速為1.0ml/min，梯度洗脫，見表1 ;
[0048]檢測波長:220nm；
[0049]取雜質(zhì)對照品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸峰、α -苯甘氨酸峰、PGME峰和CEX峰的分離度應(yīng)符合要求。
[0050]表1:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種制備頭孢氨芐的方法，其特征在于該方法是， 將左旋苯甘氨酸酯類衍生物與7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.6:1的比例投料，再按照1`2倍于7-ADCA的投料量加入催化劑青霉素?；高M(jìn)行?；磻?yīng)；其中所述的青霉素酰化酶其編碼的基因序列如SEQ ID N0:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征在于它包括以下步驟: a)將左旋苯甘氨酸酯類衍生物在30~120min內(nèi)緩慢加入到7-ADCA水溶液中，然后加入所述的青霉素?；福?5~25°C進(jìn)行?；磻?yīng)；反應(yīng)過程中PH維持在6.0-7.2 ； b)待反應(yīng)終止后，過濾80-120目篩網(wǎng)，即得到濾物一青霉素酰化酶，濾液一頭孢氨節(jié)混懸液； c)將頭孢氨芐混懸液過濾，得到頭孢氨芐粗粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征在于，所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物為左旋苯甘氨酸甲酯及其鹽、左旋苯甘氨酸乙酯及其鹽中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征是，所述左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征是，加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽固體、左旋苯甘氨酸甲酯鹽溶液或左旋苯甘氨酸甲酯鹽混懸液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征是，所述7-ADCA水溶液其質(zhì)量濃度為10~15%，其水溶液的溫度為15~25°C，PH為7.8~8.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求 2所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征是，a)步所述?；磻?yīng)過程中，使用氨水維持PH在6.0-7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備頭孢氨芐的方法，其特征是，a)步所述?；磻?yīng)的反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁之后，向反應(yīng)液中緩慢加入純化水。
【文檔編號】C12P35/04GK103805671SQ201410046595
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】劉 東, 楊夢德, 胡國剛, 甘平娟, 張鎖慶, 魏闊, 楊宏利, 張文勝, 劉力強(qiáng), 王新輝, 曹歡, 黃剛 申請人:華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司