一種高立體選擇性酯水解酶、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有高度R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶及其編碼基因，以及含有該編碼基因的載體、工程菌及其應(yīng)用。所述酯水解酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，編碼基因如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明酯水解酶具有較高的催化活力和立體選擇性，可以用于制備光學(xué)純的手性化合物，特別是左乙拉西坦中間體α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。
【專利說(shuō)明】一種高立體選擇性酯水解酶、編碼基因及其應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高立體選擇性酯水解酶及其編碼基因，以及含有該編碼基因的載體、工程菌及其應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一類在手性合成中有著重要用途的生物催化劑。這些酶能識(shí)別很寬的底物，目前> 40%的生物不對(duì)物合成反應(yīng)可有酯水解酶催化完成，這些反應(yīng)具有條件溫和、反映的區(qū)域選擇性和立體選擇性高等特點(diǎn)。在酶動(dòng)力學(xué)拆分外消旋酯、胺和轉(zhuǎn)化前手性醇等方面等到廣泛的應(yīng)用。另外，它們還可用于選擇性酯化、轉(zhuǎn)酯化和聚合反應(yīng)中。
[0003]由于對(duì)手性藥物和中間體需求的增長(zhǎng)，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人們的重視和工業(yè)化應(yīng)用。生物法合成手性化合物的關(guān)鍵問(wèn)題在于尋找具有高度立體選擇性催化功能的生物催化劑。由于酯水解酶具有廣泛的用途，篩選新的酯水解酶正成為酶工程的研究熱點(diǎn)。雖然酯水解酶在微生物界分布很廣，但它們的立體選擇性催化功能不一樣。在同一生物體內(nèi)往往存在多種酯水解酶，由于它們之間立體選擇性存在差異性，利用為生物細(xì)胞或它們的粗酶制品進(jìn)行酶法合成手性化合物時(shí)往往會(huì)降低產(chǎn)物的光學(xué)純度(Geun-Joong Kim, Journal of Molecular Catalysis B:Enzymaticl7, 2002:29-38)。解決這一問(wèn)題可以通過(guò)工程的調(diào)控手段來(lái)減少副反應(yīng)的發(fā)生，也可以通過(guò)分離純化得到單一的酶制劑來(lái)進(jìn)行催化反應(yīng)，但這些過(guò)程往往較復(fù)雜和高的成本，再生產(chǎn)中不易被采用。如果通過(guò)基因工程的手段，直接 克隆和表達(dá)所需要的酶的基因，就能夠很方便達(dá)到以上的目的。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種篩選獲得的具有較高R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種具有R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明人通過(guò)篩選大量的微生物，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌能產(chǎn)生一種具有高度R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，本發(fā)明酯水解酶來(lái)自蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WZZ001，保藏編號(hào)CCTCC M2012403,已在CN102994429A中披露。發(fā)明人通過(guò)PCR擴(kuò)增得到芽孢桿菌WZZ001的一種具有R-異構(gòu)體立體選擇性的酯酶基因BCEST，測(cè)定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID N0.1所示，其中編碼序列(⑶S)從DNA第I個(gè)堿基起至第1458終止，ATG為轉(zhuǎn)錄起始密碼子，TAA為轉(zhuǎn)錄終止密碼；并得到相應(yīng)的氨基酸序列，如列表中SEQID N0.2 所示。
[0008]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0009]本發(fā)明還涉及所述酯水解酶的編碼基因。具體的，所述基因核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0010]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。
[0011]本發(fā)明還涉及含有所述編碼基因的重組載體，以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的
重組基因工程菌。
[0012]所述重組載體是用常規(guī)方法將本發(fā)明的酯水解酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成，該載體可以是市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pLEX(Novagen, Inc., Madison, ffis.), PQE(Qiagen)，pREP,PSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是僅限于這些載體。較佳的是將PCR擴(kuò)增到的BCEST基因產(chǎn)物通過(guò)TA克隆和表達(dá)載體pEASY-El連接，形成BCEST基因的表達(dá)載體(質(zhì)粒)pEASY-E1-BCEST。表達(dá)載體pEASY-E1-BCEST轉(zhuǎn)化Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增質(zhì)粒。
[0013]所述基因工程菌是將包含本發(fā)明酯水解酶基因核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主微生物，例如感受態(tài)大腸桿菌——大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中得到的基因工程菌株，如將上述質(zhì)`粒pEASY-E 1-BCEST轉(zhuǎn)化其中得到含有pEASY-E 1-BCEST的大腸埃希氏菌 E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E1-BCEST。
[0014]本發(fā)明還涉及所述基因在制備重組酯水解酶中的應(yīng)用。具體的應(yīng)用包括用上述本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的酯水解酶。其中，該宿主細(xì)胞可以為原核、真核微生物或昆蟲等。較佳的是大腸桿菌，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體為上述的基因工程菌株:大腸埃希氏菌E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E1-BCEST。此菌株可在常規(guī)的IPTG誘導(dǎo)下(在0D600=0.5~0.6左右時(shí)加入，至其濃度為0.1~lmmol/L均可)高效表達(dá)酯水解酶蛋白，即為本發(fā)明的重組酯水解酶。
[0015]本發(fā)明還涉及所述的酯水解酶在立體選擇性催化拆分外消旋底物制備手性化合物中的應(yīng)用。所述外消旋底物為下列之一乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯、BOC-丙氨酸甲酯、B0C-2-氨基丁酸甲酯、B0C-2-氨基戊酸甲酯。
[0016]本發(fā)明的重組酯水解酶可以用于制備光學(xué)純的手性化合物(R構(gòu)型酸和S構(gòu)型酯)，特別是左乙拉西坦中間體(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。
[0017]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明酯水解酶具有較高的催化活力和立體選擇性，可以用于制備光學(xué)純的手性化合物，特別是左乙拉西坦中間體(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。
(四)【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0018]圖1為本發(fā)明酯水解酶基因BCEST的PCR擴(kuò)增電泳圖譜，其中，UBCEST的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2> DNA Marker ( λ -Hind III digest, TakaRa 公司)。
[0019]圖2為本發(fā)明質(zhì)粒pEASY-E 1-BCEST PCR驗(yàn)證電泳圖譜，其中，1、重組質(zhì)粒pEASY-E 1-BCEST PCR 產(chǎn)物；2、DNA Marker ( λ-Hind III digest, TakaRa 公司)。
[0020]圖3為本發(fā)明基因工程菌株E.coli BL21 (DE3)/pEASY-El-BCEST表達(dá)產(chǎn)物的PAGE電泳圖，其中，1、基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-BCEST誘導(dǎo)前產(chǎn)物；2、基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-BCEST經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)物；3、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(TakaRa 公司)。
[0021]圖4為底物外消旋α -乙基-2-氧_1_吡咯烷乙酸甲酯氣相檢測(cè)圖譜。
[0022]圖5為本發(fā)明重組酯酶水解α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的氣相檢測(cè)圖譜。
[0023]圖6為表達(dá)質(zhì)粒pEASY-E 1-BCEST構(gòu)建示意圖。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0025]實(shí)施例中的材料與方法為:
[0026]所采用的分子克隆技術(shù)參見(jiàn)J.薩姆布魯克等編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
[0027]TransStartTM Taq DNA Polymerase購(gòu)于TransGen Biotech 公司。DNA marker、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收純化試劑盒、瓊脂糖電泳試劑均購(gòu)自TaKaRa，大連寶生物公司，使用方法參考商品說(shuō)明書。
[0028]Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)
[0029]大腸埃希氏菌BL21 (DE3) (TakaRa,大連寶生物公司)
[0030]N1-NTA Sefinose Kit (Bio Basic INC 公司)
[0031]實(shí)施例1:從蠟狀芽孢桿菌克隆BCEST基因
[0032]根據(jù)Bacilluscereus ATCC10876基因組DNA序列(GenBank:ACLT01000051.1)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物I和引物2。
[0033]引物I 序列:TCTAAAATTGAAACACCTGTTATG
[0034]引物2 序列:TTATTTAATTTTCTTAAATGTAAGC
[0035]以蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus CCTCC M2012403基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(利用Takala試劑盒)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表1和2所示。步驟2到4重復(fù)29次。
[0036]表1:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.一種具有R-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述酯水解酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5.一種用權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6.權(quán)利要求2或3所述基因在制備重組酯水解酶中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的酯水解酶在立體選擇性催化拆分外消旋底物制備手性化合物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述外消旋底物為下列之一:α -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯 、BOC-丙氨酸甲酯、B0C-2-氨基丁酸甲酯、B0C-2-氨基戊酸甲酯。
【文檔編號(hào)】C12P7/62GK103820416SQ201410022841
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】汪釗, 鄭建永, 應(yīng)向賢, 章銀軍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)