專利名稱：D－泛解酸內酯水解酶cDNA及其克隆、表達和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來源于串珠鐮孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株中的D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因及其克隆載體，表達載體重組質粒，電轉化構建重組菌及轉化制備D-泛解酸，涉及D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因技術領域。
背景技術：
泛解酸，Pantothenic acid，D(+)-N(α，γ-二羥基-β，β-二甲基丁酰)-β丙氨酸[D(+)-N(α，γ-dihydroxy-β，β-dimethylbutyl)-β-alanine]，又稱遍多酸、維生素B5、或B3，是一種重要的藥物、食品添加劑和飼料添加劑。它又是輔酶A的組成部分，參與糖、脂肪、蛋白質代謝，其產品形式一般為其右旋體鈣鹽D-泛酸鈣。D-泛解酸的制備方法主要有化學拆分法，物理拆分法，生物拆分法，目前只有生物拆分法中的利用產D-泛解酸內酯水解酶菌株選擇性地不對稱水解D-泛解酸內酯，得到D-泛解酸。
可以產生D-泛解酸內酯水解酶的菌株有鐮孢霉菌屬Fusarium，赤霉菌屬Gibberella，粘帚霉菌屬Gliocladium，黑曲霉菌屬Aspergillus，以及柱盤孢菌屬Cylindrocarpon，Volutella等。
1994年日本的Sakamoto等人[Shimizu S，Kataoka M，Shimizu K，HirakataM，Sakamoto K，Yamada H.Purification and characterization of a novellactonohydrolase，catalyzing the hydrolysis of aldonate lactones andaromatic lactones，from Fusarium oxysporum.Eur J Biochem，1992，209383-390.]對Genera屬的Fusarium Oxysporm IFO5942菌株中可立體專一性拆分D，L-泛解酸內酯的酶進行了分離純化，并對酶的反應條件進行了探索性研究，確定了酶轉化的最佳反應條件[Kataoka M，Shimizu K，Sakamoto K，Yamada H，Shimizu S.Appl.Microbiol.biotechnol，1995，43974～977]。同時他們對酶的分子量及亞基組成也進行了測定，發(fā)現該酶由兩個亞基組成，分子量約為12500。對該酶的抑制劑也進行了研究，可抑制該酶的因子有Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg2+以及EDTA。
1998年日本的Michihiko Kobayashi等[Kobayashi M，Shinohara M，SakohC，Kataoka M，Shimizu S.Lactone-ring-cleaving enzymeGenetic analysis，novel RNAediting，and evolutionary implications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，9512787～12792.]對Fusarium Oxysporm AKU 3702菌株中的D-泛解酸內酯水解酶基因進行了研究，發(fā)現D-泛解酸內酯水解酶基因組全長約2.2kb左右，含有6個內涵子，通過構建cDNA文庫，利用基因探針篩選到了編碼D-泛解酸內酯水解酶cDNA基因，其全長約為1.2kb左右，將該酶cDNA基因與載體連接后轉入大腸桿菌中，并進行了活性表達，經SDS-PAGE檢測，發(fā)現有兩種不同分子量(49kDa和51kDa)的基因表達產物，二者都具有D-泛解酸內酯水解酶，懷疑49kDa的酶為51kDa酶在細胞內蛋白酶作用下的產物。
2002年日本的Sakamoto等人發(fā)表了源于真核生物的D-泛解酸內酯水解酶的基因序列并將該基因修飾后轉至原核生物細胞內，進行了過量表達，經測定該表達產物有立體專一性拆分D，L-泛解酸內酯的活力并對其序列進行了分析。利用該表達產物進行工業(yè)化生產效果較好。這一研究解決了利用菌體細胞直接轉化所帶來的困難，也提高了酶的活力及產物的收率。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種D-泛解酸內酯水解酶cDNA及其克隆、表達和應用。發(fā)表來源于串珠鐮孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株[中國專利.01104070.X，2001.]中D-泛解酸內酯水解酶cDNA基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列，構建含有該序列的克隆載體，表達載體和轉化了表達載體的重組菌，以及利用含有表達載體重組菌以D-泛解酸內酯或D，L-泛解酸內酯為底物生物轉化制備D-泛解酸。
本發(fā)明的技術方案是利用反轉錄PCR技術(RT-PCR技術)并以來源于串珠鐮孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株中的總RNA為模板合成cDNA第一鏈。在引物1、引物2的作用下利用cDNA第一鏈為模板擴增了約1500bp的片斷，將該片段連接到pMD18-T載體上獲得克隆載體pMD18-T-LAC和轉化了pMD18-T-LAC的重組大腸桿菌。對重組質粒測序，并對測序結果利用軟件分析，該序列含有一個開放閱讀框。根據測序結果設計引物3、引物4，利用引物3、引物4以克隆載體pMD18-T-LAC為模板，獲得了長為1146bp的編碼D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因。該基因核苷酸序列為ATGGCTAAGC TTCCTTCTAC GGCCCAGATT ATTGACCAGA AGTCCTTTAA TGTCTTGAAG 60GATGTGCCGC CTCCCGCAGT GGCCAATGAC TCTCTGGTGT TCACTTGGCC TGGTGTGACT 120GAGGAGTCTC TTGTTGAGAA GCCTTTTCAT GTCTACGATG AAGAGTTTTA CGACGTCATC 180GGAAAGGACC CCTCTTTGAC CCTCATCGCA ACATCGGACA CCGACCCAAT CTTCCATGAG 240GCTGTCGTAT GGTATCCTCC TACTGAAGAG GTCTTCTTTG TCCAGAATGC TGGCGCTCCC 300GCTGCTGGCA CTGGCTTGAA CAAGTCTTCC ATCATTCAGA AGATTTCCCT CAAGGAGGCC 360GACGAGGTCC GCAAGGGCAA GAAGGATGAG GTCAAGGTCG CGGTTGTTGA CTCAAACCCT 420CAGGTCATCA ACCCCAATGG TGGCACTTAC TACAAGGGCA ACATCATCTT TGCTGGTGAG 480GGCCAAGGCG ACGATGTTCC CTCCGCCCTG TACCTGATGA ACCCTCTCCC TCCTTACAAC 540ACCACCACCC TCCTCAACAA CTACTTTGGT CGCCAGTTCA ACTCCCTCAA CGACGTCGGT 600ATCAACCCCA GGAACGGTGA CTTGTACTTC ACCGATACCC TCTATGGATA CCTCCAGGAC 660TTCCGTCCTG TTCCTGGTCT GCGAAACCAA GTCTATCGTT ACAACTTTGA CACCGGCGCC 720GTCACTGTCG TCGCTGATGA CTTTACCCTC CCTAACGGTA TTGGCTTTGG CCCCGACGGC 780AAGAAGGTCT ATGTCACCGA CACTGGTATC GCTCTTGGCT TTTACGGCCG CAACCTCTCT 840TCACCCGCCT CTGTTTACTC CTTCGATGTA AACCAGGACG GTACTCTCCA GAACCGCAAG 900ACCTTTGCTT ACGTCGCGTC TTTCATCCCC GATGGTGTTC ATACCGACTC CAAGGGCCGT 960GTTTATGCCG GTTGCGGCGA TGGTGTCCAC GTCTGGAACC CTTCGGGCAA GCTAATCGGC 1020AAGATCTACA CCGGTACTGT TGCTGCTAAC TTCCAGTTTG CCGGCAAGGG AAGGATGATT 1080ATTACTGGAC AGACCAAGTT GTTCTATGTT ACTTTAGGGG CTTCGGGTCC CAAGCTCTAT 1140GATTAG 1146利用軟件對該基因序列進行分析，并推知其編碼的氨基酸序列為MAKLPSTAQI IDQKSFNVLK 20DVPPPAVAND SLVFTWPGVT 40EESLVEKPFH VYDEEFYDVI 60GKDPSLTLIA TSDTDPIFHE 80AVVWYPPTEE VFFVQNAGAP 100AAGTGLNKSS IIQKISLKEA 120DEVRKGKKDE VKVAVVDSNP 140QVINPNGGTY YKGNIIFAGE 160GQGDDVPSAL YLMNPLPPYN 180
TTTLLNNYFG RQFNSLNDVG 200INPRNGDLYF TDTLYGYLQD 220FRPVPGLRNQ VYRYNFDTGA 240VTVVADDFTL PNGIGFGPDG 260KKVYVTDTGI ALGFYGRNLS 280SPASVYSFDV NQDGTLQNRK 300TFAYVASFIP DGVHTDSKGR 320VYAGCGDGVH VWNPSGKLIG 340KIYTGTVAAN FQFAGKGRMI 360ITGQTKLFYV TLGASGPKLY 380D*381本發(fā)明將D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因同表達載體pTrc99a(PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway)或穿梭表達載體pYX212(Novogen company)連接構建了含有D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因的表達重組質粒pTrc99a-LAC或pYX212-LAC。
將重組質粒pTrc99a-LAC轉化至大腸桿菌獲得含有重組質粒pTrc99a-LAC的重組大腸桿菌，或將重組質粒pYX212-LAC轉化至釀酒酵母，獲得含有穿梭表達載體pYX212-LAC的重組釀酒酵母。以重組菌為酶源，利用D-泛解酸內酯或D，L-泛解酸內酯為底物轉化制備D-泛解酸。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)表了一種來源于串珠鐮孢霉菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536中的D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因核苷酸序列；并將該基因與表達載體連接構建得到含該基因的表達重組質粒pTrc99a-LAC或pYX212-LAC，再分別對應轉化至大腸桿菌或釀酒酵母，獲得含有重組質粒pTrc99a-LAC的重組大腸桿菌或含有穿梭表達載體pYX212-LAC的重組釀酒酵母，經測定含有該基因的重組菌有立體專一性拆分D-泛解酸內酯或D，L-泛解酸內酯的活力，可利用該重組菌生物法拆分制備D-泛解酸。重組大腸桿菌酶活力達37-41U/g，重組釀酒酵母酶活力達60-64U/g。


圖1克隆載體pMD18-T-LAC物理圖譜。
圖2pTrc99a-LAC重組質粒物理圖譜。
圖3pYX212-LAC重組質粒物理圖譜。
圖4D-泛解酸內酯水解酶cDNA基因PCR擴增argrose電泳圖。
1.利用引物1和引物2擴增得到的cDNA片段；2.250bp DNA Marker；3.利用引物3和引物4擴增得到的cDNA片段。
圖5陽性重組質粒pTrc99a-LAC的酶切結構圖。
1.DL2000 DNA Marker；2.D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因片段；3.pTrc-LAC/EcoRI；4.pTrc-LAC/SalI；5.pTrc-LAC/EcoRI and SalI；6.λDNA/HindIII DNA Marker。
圖6陽性重組質粒pYX212-LAC的酶切結構圖。
1.λDNA/HindIII DNA Marker；2.D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因片段；3.pYX212-LAC/EcoRI；4.pYX212-LAC/SalI；5.pYX212-LAC/EcoRI and SalI；6.DL2000 DNA Marker。
具體實施例方式
實施例1參照文獻[Chomczynski P.，Sacchi N.，Single Step Method of RNAIsolation by Acid Guanidinium Thiocyanate Phenol Chloroform Extraction.Anal.Biochem.1987，162156-159]的方法并對其進行改良，用以提取Fusariummoniliforme CGMCC 0536菌體的總RNA，具體操作如下取處理過的Fusariummoniliforme CGMCC 0536菌絲體0.4g，液氮速凍并研磨(加入少量石英砂)成粉末，快速將粉末移入50mL離心管中，加12mL變性液(異硫氫酸胍6mol/L，檸檬酸37.5mol/L，十二烷基肌酸鈉0.75mol/L，β-巰基乙醇0.15mol/L)，充分搖勻。向離心管中加入1.2mL乙酸鈉(2M pH4.0)混勻，加入12mL飽和酚混勻，加12mL氯仿∶異戊醇(體積比為24∶1)混勻。震蕩10s，冰浴15min。10000g離心20min。上清液移至新管，加與上清液等體積的混合溶劑(酚∶氯仿∶異戊醇體積比為25∶24∶1)，震蕩完全，冰浴15min。4℃10000g離心20min，上清液移至新管，加等體積異丙醇，混勻，-20℃沉淀1h。4℃10000g離心20min，收集RNA，傾倒上清(小心)，將RNA沉淀溶解于3.5mL變性液中，溶解混勻。將溶解液分裝幾管，700μL/管，加等體積異丙醇，-20沉淀1h。4℃10000g離心10min后，75％乙醇洗2次，每次500μL/管，將沉淀懸起后，室溫靜止10min，室溫10000g離心5min，傾去上清，操作臺上風干。每管加100μL無核糖核酸酶的水(RNase-free水)，溶解好后，測OD值，并取適量樣品進行甲醛變性電泳。
實施例2利用商品化的mRNA分離試劑盒分離從實施例1獲得的總RNA中分離mRNA。分離的原理是在總RNA中只有mRNA在3’末端有一個PolyA結構，當總RNA通過含有Oligo(dT)的介質時，具有3’末端PolyA結構的mRNA被吸附，利用洗液將雜質及其他RNA洗去后，再利用洗脫液將mRNA洗脫下來，即可得到純度較高的mRNA。本實施例利用Promega公司的mRNA分離試劑盒，具體操作如下1.0.1～1mg的RNA加無核糖核酸酶的水(RNase-free水)至500μL(1μg/ml)，65℃水浴10min，加3μL由試劑盒提供的Biotinglated-Oligo(dT)，加13μL由試劑盒提供的20×SSC，輕柔混合后放置室溫至完全冷卻(放置時間不超過10min)。
2.洗SA-PMP(由試劑盒提供的含有Oligo(dT)的磁性小珠)，輕彈試管將SA-PMP懸起，放置于磁架上，小心移去上清，用由試劑盒提供的0.5×SSC洗3次(300μL/次)，將SA-PMP重懸于100μL 0.5×SSC中。
3.將1中產物放入2中，室溫放置10min，輕柔倒轉1～2min，SA放置于磁架上，小心移去上清，用0.1×SSC洗4次(300μL/次)，每次輕柔充分混合。
4.用RNase-free水(100μL)重懸SA，輕柔混合，放置于磁架上，將上清移至干凈的離心管中，用150μL RNase-free水重復洗SA-PMP幾次(若有沉淀，可12000g 4℃離心1min)。
實施例3在反轉錄酶的作用下，以mRNA為模板合成cDNA第一鏈，設計的Oligo(dT)引物中T堿基的數量介于12～18個之間。在50℃下恒溫進行反轉錄反應，反應時間為1～2h，獲得的cDNA第一鏈用作cDNA第二鏈合成的模板。
首先，對基因數據庫中公布的編碼D-泛解酸內酯水解酶基因序列進行對比分析，根據分析結果我們設計了一對引物。
參照基因數據庫中公布的尖鐮孢霉菌株中編碼D-泛解酸內酯水解酶的基因組和cDNA設計引物1序列為5’-GCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’，引物2Oligo(dT15)，由上海生工生物工程公司提供，根據mRNA3’末端結構進行設計。
利用高保真Pyrobest DNA聚合酶以D-泛解酸內酯水解酶cDNA第一鏈為模板，在引物1、引物2的引發(fā)下，合成cDNA第二鏈。經瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現擴增得到一長度為1.5kb的片段，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4。
切膠回收該片段并純化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入堿基A。在T4 DNA連接酶作用下將該片段同T載體進行連接，得到克隆重組質粒pMD18-T-LAC見圖1。
將該重組質粒電轉化至大腸桿菌中，利用籃白篩選系統(tǒng)進行篩選，隨機挑取白色克隆測序，利用軟件分析測序結果，根據分析結果設計以下引物引物35’-CCGGAATTCATGGCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’引物45’-ATTCCGGTCGACCTAATCATAGAGCTTGGGAC-3’分別在引物3和引物4中引入了EcoRI和SalI限制性酶切位點。
實施例4以實施例3中的克隆重組質粒pMD18-T-LAC為模板，在實施例3中的引物3和引物4的引發(fā)下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶進行擴增，獲得長為1146bp的編碼D-泛解酸內酯水解酶cDNA的結構基因，測序后利用EcoRI和SalI限制性內切酶對擴增片段進行處理，并利用T4 DNA連接酶將該片段同用相同的限制性內切酶處理的商業(yè)化載體pTrc99a或穿梭表達載體pYX212進行連接，構建表達載體pTrc99a-LAC或穿梭表達載體pYX212-LAC。將構建的表達載體pTrc99a-LAC電轉化至大腸桿菌，涂平板37℃進行培養(yǎng)過夜，或穿梭表達載體pYX212-LAC電轉化至釀酒酵母，涂平板在30℃進行培養(yǎng)2-3天，隨機挑取克隆抽提質粒進行酶切鑒定，鑒定結果見圖5和圖6。
實施例5
以實施例4中獲得的含有表達載體pTrc99a-LAC的重組大腸桿菌或含有穿梭表達載體pYX212-LAC的重組釀酒酵母濕菌體作為轉化用酶，以D-泛解酸內酯或D，L-泛解酸內酯為底物，進行轉化反應制備D-泛解酸。轉化體系組成及轉化操作如下在250mL三角瓶中加入0.5g濕菌體和底物濃度為2％的50mL反應液，30℃搖床150r/min條件下反應60min，離心去除菌體，清液為含有D-泛解酸的水溶液。用HPLC分析測定D-泛解酸生成量，推知重組菌酶活。測定結果見表1和表2。
表1.以重組大腸桿菌為酶源測定的D-泛解酸內酯水解酶酶活力測定結果

表2.以重組釀酒酵母為酶源測定的D-泛解酸內酯水解酶酶活力測定結果

權利要求
1.一種來源于串珠鐮孢霉(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536菌株中的D-泛解酸內酯水解酶cDNA，其結構基因核苷酸序列為ATGGCTAAGC TTCCTTCTAC GGCCCAGATT ATTGACCAGA AGTCCTTTAA TGTCTTGAAG 60GATGTGCCGC CTCCCGCAGT GGCCAATGAC TCTCTGGTGT TCACTTGGCC TGGTGTGACT 120GAGGAGTCTC TTGTTGAGAA GCCTTTTCAT GTCTACGATG AAGAGTTTTA CGACGTCATC 180GGAAAGGACC CCTCTTTGAC CCTCATCGCA ACATCGGACA CCGACCCAAT CTTCCATGAG 240GCTGTCGTAT GGTATCCTCC TACTGAAGAG GTCTTCTTTG TCCAGAATGC TGGCGCTCCC 300GCTGCTGGCA CTGGCTTGAA CAAGTCTTCC ATCATTCAGA AGATTTCCCT CAAGGAGGCC 360GACGAGGTCC GCAAGGGCAA GAAGGATGAG GTCAAGGTCG CGGTTGTTGA CTCAAACCCT 420CAGGTCATCA ACCCCAATGG TGGCACTTAC TACAAGGGCA ACATCATCTT TGCTGGTGAG 480GGCCAAGGCG ACGATGTTCC CTCCGCCCTG TACCTGATGA ACCCTCTCCC TCCTTACAAC 540ACCACCACCC TCCTCAACAA CTACTTTGGT CGCCAGTTCA ACTCCCTCAA CGACGTCGGT 600ATCAACCCCA GGAACGGTGA CTTGTACTTC ACCGATACCC TCTATGGATA CCTCCAGGAC 660TTCCGTCCTG TTCCTGGTCT GCGAAACCAA GTCTATCGTT ACAACTTTGA CACCGGCGCC 720GTCACTGTCG TCGCTGATGA CTTTACCCTC CCTAACGGTA TTGGCTTTGG CCCCGACGGC 780AAGAAGGTCT ATGTCACCGA CACTGGTATC GCTCTTGGCT TTTACGGCCG CAACCTCTCT 840TCACCCGCCT CTGTTTACTC CTTCGATGTA AACCAGGACG GTACTCTCCA GAACCGCAAG 900ACCTTTGCTT ACGTCGCGTC TTTCATCCCC GATGGTGTTC ATACCGACTC CAAGGGCCGT 960GTTTATGCCG GTTGCGGCGA TGGTGTCCAC GTCTGGAACC CTTCGGGCAA GCTAATCGGC 1020AAGATCTACA CCGGTACTGT TGCTGCTAAC TTCCAGTTTG CCGGCAAGGG AAGGATGATT 1080ATTACTGGAC AGACCAAGTT GTTCTATGTT ACTTTAGGGG CTTCGGGTCC CAAGCTCTAT 1140GATTAG1146。
2.如權利要求1所述的D-泛解酸內酯水解酶cDNA，由權利要求1中的核苷酸序列編碼，其氨基酸組成為MAKLPSTAQI IDQKSFNVLK 20DVPPPAVAND SLVFTWPGVT 40EESLVEKPFH VYDEEFYDVI 60GKDPSLTLIA TSDTDPIFHE 80AVVWYPPTEE VFFVQNAGAP 100AAGTGLNKSS IIQKISLKEA 120DEVRKGKKDE VKVAVVDSNP 140QVINPNGGTY YKGNIIFAGE 160GQGDDVPSAL YLMNPLPPYN 180TTTLLNNYFG RQFNSLNDVG 200INPRNGDLYF TDTLYGYLQD 220FRPVPGLRNQ VYRYNFDTGA 240VTVVADDFTL PNGIGFGPDG 260KKVYVTDTGI ALGFYGRNLS 280SPASVYSFDV NQDGTLQNRK 300TFAYVASFIP DGVHTDSKGR 320VYAGCGDGVH VWNPSGKLIG 340KIYTGTVAAN FQFAGKGRMI 360ITGQTKLFYV TLGASGPKLY 380D*381。
3.如權利要求1所述的D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因的克隆，其特征是a)利用反轉錄PCR技術，以串珠鐮孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0536菌株中的總RNA為模板合成了cDNA第一鏈；b)引物15’-GCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’引物2Oligo(dT15)，在引物1、引物2作用下，以cDNA第一鏈為模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶進行擴增得到長度為1.5kb的片段；c)經切膠回收該片段并純化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入堿基A，在T4 DNA連接酶作用下將該片段同T載體進行連接，得到克隆載體重組質粒pMD18-T-LAC和轉化了pMD18-T-LAC的大腸桿菌，并對重組質粒測序；d)設計引物35’-CCGGAATTCATGGCTAAGCTTCCTTCTACGGC-3’引物45’-ATTCCGGTCGACCTAATCATAGAGCTTGGGAC-3’在引物3、引物4作用下，以pMD18-T-LAC為模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶進行擴增得到長度為1146bp的編碼D-泛解酸內酯水解酶cDNA的結構基因。
4.如權利要求1所述的D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因的表達，其特征是利用EcoRI和SalI限制性內切酶對長度為1146bp的擴增片段進行處理，并利用T4 DNA連接酶將該片段同用相同的限制性內切酶處理的商業(yè)化載體pTrc99a或穿梭表達載體pYX212進行連接，構建表達載體重組質粒pTrc99a-LAC，并電轉化至大腸桿菌，涂平板在37℃進行培養(yǎng)過夜，或構建穿梭表達載體重組質粒pYX212-LAC，并電轉化至釀酒酵母中，涂平板在30℃進行培養(yǎng)2-3天；隨機挑取克隆抽提質粒進行酶切鑒定。
5.如權利要求1所述的D-泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因的應用，其特征是獲得的含有表達載體pTrc99a-LAC的重組大腸桿菌或含有穿梭表達載體pYX212-LAC的重組釀酒酵母濕菌體作為轉化用酶，以D-泛解酸內酯或D，L-泛解酸內酯為底物，進行轉化反應制備D-泛解酸，轉化體系組成及轉化操作如下在250mL三角瓶中加入0.5g濕菌體和底物濃度為2％的50mL反應液，30℃搖床150r/min條件下反應60min，離心去除菌體，清液為含有D-泛解酸的水溶液。
全文摘要
D－泛解酸內酯水解酶cDNA及其克隆、表達和應用，涉及D－泛解酸內酯水解酶cDNA結構基因技術領域。本發(fā)明利用反轉錄PCR技術，以串珠鐮孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0536菌株總RNA為模板合成cDNA第一鏈，再在引物1、引物2作用下擴增得到長度為1.5kb的片段，經切膠回收并純化處理后同T載體連接得到克隆載體重組質粒pMD18－T－LAC，在引物3、引物4作用下以該克隆載體為模板擴增，獲得長為1146bp的編碼D－泛解酸內酯水解酶cDNA的結構基因。構建表達載體重組質粒pTrc99a－LAC或pYX212－LAC及對應的含有以上重組質粒的重組菌。應用重組菌生物轉化D－泛解酸內酯或D，L－泛解酸內酯制備D－泛解酸。
文檔編號C12N15/55GK1597962SQ20041004161
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月3日 優(yōu)先權日2004年8月3日
發(fā)明者孫志浩, 柳志強 申請人:江南大學