用于檢測(cè)癌癥中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和測(cè)定與dna堿基切除修復(fù)途徑抑制的合成致死性的 ...的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)涉及癌癥、尤其是錯(cuò)配修復(fù)(MMR-)缺陷腫瘤領(lǐng)域。本文提供對(duì)檢測(cè)腫瘤是否為錯(cuò)配修復(fù)缺陷具有高敏感性的新標(biāo)記。該標(biāo)記尤其是微衛(wèi)星區(qū)域中的突變。因此，提供用于診斷腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的方法，其包括測(cè)定這些標(biāo)記的存在。此外，提供試劑盒來(lái)檢測(cè)這些標(biāo)記(或其亞組)在樣品中的存在。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)癌癥中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和測(cè)定與DNA堿基切除 修復(fù)途徑抑制的合成致死性的新標(biāo)記

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及癌癥、尤其是錯(cuò)配修復(fù)（MMR-)缺陷腫瘤領(lǐng)域。本文提供對(duì)檢測(cè)腫瘤是 否為錯(cuò)配修復(fù)缺陷具有高敏感性的新標(biāo)記。該標(biāo)記尤其是微衛(wèi)星區(qū)域中的突變。因此，提 供用于診斷腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的方法，其包括測(cè)定該些標(biāo)記的存在。此外，提供試劑盒 來(lái)檢測(cè)該些標(biāo)記（或其亞組）在樣品中的存在。
[0002] 有趣地，突變優(yōu)先影響通過(guò)同源重組（HR)途徑的雙鏈斷裂值SB)修復(fù)，DSB修復(fù)在 MMR缺陷腫瘤中功能上受損。本文中顯示，該些腫瘤對(duì)通過(guò)酶聚ADP核糖聚合酶的藥理學(xué)抑 制（PARP抑制）誘導(dǎo)單鏈斷裂敏感。因此，基于MMR和PARP之間的合成致死相互作化提 供用于MMR缺陷腫瘤的新治療模式。

【背景技術(shù)】
[0003] 腫瘤中與DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷相關(guān)的基因組不穩(wěn)定性的形式稱(chēng)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (MSI)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI)是微衛(wèi)星中的重復(fù)DNA核巧酸單位的數(shù)目的克隆變化。它 通常出現(xiàn)在錯(cuò)配修復(fù)（MMR)基因缺陷的腫瘤中；DNAMMR系統(tǒng)未能修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā) 生的錯(cuò)誤，導(dǎo)致普遍存在于整個(gè)基因組中的簡(jiǎn)單、重復(fù)的微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度內(nèi)的單核巧酸突 變和改變的加速累積。
[0004]MMR缺陷是非常清楚的Lynch綜合癥病因，Lynch綜合癥是造成2%至5%的子 宮內(nèi)膜（EM)癌或結(jié)直腸（CRC)癌的癌癥易感性的常染色體顯性遺傳障礙。Lynch綜合癥 由MMR途經(jīng)基因（MLH1、MS肥、M甜3、MS冊(cè)或PMS2)中的突變或缺失引起Qiricny, 2006)。 此外，MLHl的外遺傳沉默（常稱(chēng)為"散發(fā)性"Lynch綜合癥）促成該些腫瘤的另外15% (Kuismanen等，2002)。還已在少數(shù)卵巢癌、膜腺癌、胃癌、白血病W及幾種其他癌癥中描述 了MMR缺陷。
[0005]MMR機(jī)制的缺陷在腫瘤組織中但不在正常周?chē)M織中產(chǎn)生DNA復(fù)制錯(cuò)誤。具體而 言，體細(xì)胞錯(cuò)誤作為單核巧酸和二核巧酸重復(fù)中的插入/缺失突變累積一稱(chēng)為微衛(wèi)星不 穩(wěn)定性（MSI)的現(xiàn)象（Pinol等，2005)。
[0006]MMR缺陷的腫瘤在諸如5-氣尿嚼巧和焼化劑（如替莫哇胺（temozolomide))的 標(biāo)準(zhǔn)化療后顯示不同的預(yù)后和治療結(jié)果。未治療的具有MMR缺陷腫瘤的CRC患者具有略好 的預(yù)后，但似乎未從基于5-氣尿嚼巧的輔助性化療（其是CRC的首選化療）受益。具體 而言，在MMR缺陷腫瘤中，5-氣尿嚼巧誘導(dǎo)的錯(cuò)配被耐受，導(dǎo)致未能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡化ewish 等，2010)。MMR缺陷腫瘤對(duì)EM中常用的化療順式笛氨和脫駿笛氨也有抗性化ewish 等，2010)。此外，MMR缺陷腫瘤可W對(duì)包括抗-EGFR和抗-VEGF治療的祀向治療具有抗性， 因?yàn)樗鼈冊(cè)诩せ钆月坊蛳掠涡盘?hào)傳導(dǎo)途徑的基因中獲得二次突變。例如，MMR腫瘤可W在雙 鏈斷裂修復(fù)基因（例如13611、411?和^050)、已知的癌基因或腫瘤抑制基因（例如？11(3〔八 或PTEN)中獲得突變。另一種可能性是MLHl的外遺傳沉默與諸如BRAFV600E突變的具體 突變一致（Ogino等，2012)，其代表晚期CRC中對(duì)祀向抗-EGFR治療的反應(yīng)的已建立的陰性 預(yù)測(cè)因子值eRoock等，2010)。
[0007] 個(gè)性化MMR缺陷腫瘤的治療的努力已集中于鑒定與MMR途徑的合成致死相互 作用。具體而言，研究掲示，增加的氧化損傷（通過(guò)氨基蝶嶺暴露或PINKl沉默（Martin 等，2011))和堿基切除修復(fù)炬ER)途徑的干擾（通過(guò)DNA聚合酶Y或目抑制（Martin 等，2010))致敏MMR缺陷腫瘤。具體而言，在MMR腫瘤中，氧化損傷誘導(dǎo)8-氧鳥(niǎo)嘿嶺 (8-oxoG)DNA損傷，其未能通過(guò)邸R或MMR途徑充分修復(fù)，在DNA水平主要產(chǎn)生GC至TA的 二核巧酸顛換，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，已假設(shè)存在腫瘤可耐受的最大突變頻率，在最大突變 頻率W上，突變的進(jìn)一步增加將是有害的。因此，已提出用誘變核巧類(lèi)似物附加地治療MMR 腫瘤，直至獲得導(dǎo)致腫瘤的錯(cuò)誤災(zāi)變樣消融的臨界突變水平。但是，到現(xiàn)在為止，該些努力 未能轉(zhuǎn)化為臨床上有效的治療選擇。備選地，還可W祀向由于MMR缺陷而發(fā)生的二次突變 值orard等，2011)。但是，表征MMR缺陷腫瘤的二次突變譜的研究限于在一個(gè)或幾個(gè)報(bào)道 基因座觀察，或僅集中在已知熱點(diǎn)序列處的突變上。雖然它們能夠確定突變最常影響單核 巧酸和二核巧酸重復(fù)，但存在于該些腫瘤中的體細(xì)胞突變譜仍未得到很好的表征。
[0008] 由于MMR缺陷主要存在于結(jié)直腸腫瘤和子宮內(nèi)膜腫瘤中代表家族形式的癌癥，且 由于腫瘤顯示MMR缺陷的突變譜特征，常使用評(píng)估MMR缺陷的診斷測(cè)試。
[0009]目前為止，最常用的檢測(cè)MSI的方法是測(cè)量包含整個(gè)微衛(wèi)星的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增 子的長(zhǎng)度。該需要DNA、一對(duì)引物（其中之一常進(jìn)行末端英光標(biāo)記）、測(cè)序儀和適宜的軟件。 備選地，如果對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，則可W簡(jiǎn)單地計(jì)數(shù)重復(fù)單位的數(shù)目。MSI也可W通過(guò)檢測(cè) 錯(cuò)配修復(fù)基因之一的免疫組織化學(xué)（IHC)染色的丟失來(lái)直接診斷。免疫組織化學(xué)法和基因 法都表征為大量的假陽(yáng)性，為此，在常規(guī)診斷背景中進(jìn)行免疫組織化學(xué)和基因水平的組合 評(píng)估。
[0010] 人基因組中有至少500000個(gè)微衛(wèi)星，由于MMR缺陷并非影響給定腫瘤中的所有微 衛(wèi)星，研究一個(gè)W上微衛(wèi)星和研究常受不穩(wěn)定性影響的微衛(wèi)星很重要。由于微衛(wèi)星標(biāo)記最 初由研究人員根據(jù)它們自己的實(shí)驗(yàn)非常隨機(jī)地挑選，在Bethesda,MD舉行了會(huì)議來(lái)討論該 問(wèn)題，并提出建議來(lái)促進(jìn)研究之間的一致性。該導(dǎo)致稱(chēng)為Bethesda系列9的"金標(biāo)準(zhǔn)"標(biāo)記 系列的推薦。此系列由H個(gè)二核巧酸重復(fù)值2S123、D5S346、D17S250)和兩個(gè)單核巧酸重 復(fù)炬AT26、BAT2W組成，且仍是MSI的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。已提出，如果40%或更多的測(cè)試標(biāo)記不 穩(wěn)定（也稱(chēng)為MSI-高或MSI-H)，則認(rèn)為腫瘤MSI陽(yáng)性。在使用五標(biāo)記系列時(shí)，該意味著在 它們中的至少兩個(gè)為陽(yáng)性時(shí)稱(chēng)為MSI;但是，具有MSI的腫瘤中通常有四個(gè)或全部五個(gè)為陽(yáng) 性。全部五個(gè)標(biāo)記測(cè)試為陰性的腫瘤稱(chēng)為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS)。對(duì)于在1個(gè)腫瘤標(biāo)記上（或 <30%的腫瘤標(biāo)記上）測(cè)試為陽(yáng)性的腫瘤，提出了術(shù)語(yǔ)MSI-L9。
[0011] 雖然仍認(rèn)為Bethesda系列是標(biāo)準(zhǔn)，但已知它具有比較低的敏感性（也取決于哪一 個(gè)MMR基因突變）。例如，對(duì)于具有MLHl突變的患者，敏感性為80 %，但對(duì)于具有MS冊(cè)突 變的患者，它僅為55%W。該可W通過(guò)加入其他標(biāo)記來(lái)改善W，但實(shí)際上為MSI-H的患者仍 可W呈現(xiàn)為MSI-L或MSS。該并非沒(méi)有意義，因?yàn)镸SI狀態(tài)在幾種癌癥（例如Lynch綜合 癥的那些）的預(yù)后（MSI-H患者通常較好11)、治療（MSI-H腫瘤不響應(yīng)基于氣-尿嚼巧（即） 的輔助性治療，因?yàn)樾枰暾腗MR系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)具有即修飾的DNA的細(xì)胞的調(diào)亡11-")和 診斷中很重要，新診斷的結(jié)直腸癌（CRC)患者常進(jìn)行MSI狀態(tài)篩查。
[0012] 另一顯著的劣勢(shì)是，Bethesda系列僅推薦用于結(jié)腸癌，即使已知其他顯示MSI的 癌癥9。該似乎是由于該樣的事實(shí)，該五個(gè)標(biāo)記是非常隨機(jī)地鑒定為在微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)腸癌 中突變，但生物學(xué)機(jī)制未知。
[0013] 另一劣勢(shì)屬于技術(shù)性的。Bethesda標(biāo)記系列包含非常長(zhǎng)的重復(fù)（例如，BAT26標(biāo) 記包含26核巧酸A重復(fù)），用來(lái)測(cè)定MSI狀態(tài)的典型PCR產(chǎn)物超過(guò)l(K)bp。為了準(zhǔn)確測(cè)序 該些片段并測(cè)定重復(fù)的精確長(zhǎng)度，通常與多毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)合使用基于Sanger的測(cè)序 方法。但是，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室使用所謂的"下一代"測(cè)序，下一代測(cè)序利用大規(guī)模并行測(cè) 序技術(shù)。雖然更便宜，但該些技術(shù)利用較短的閱讀，且不能用來(lái)檢測(cè)Bethesda標(biāo)機(jī)系列上 的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。因此，實(shí)驗(yàn)室需要維持兩臺(tái)測(cè)序儀：一臺(tái)用于Bethesda標(biāo)機(jī)系列篩查， 一臺(tái)用于其他實(shí)驗(yàn)。如果狀態(tài)不需要特殊的測(cè)序儀來(lái)測(cè)定MSI,且此測(cè)定可W在常用的設(shè)備 上進(jìn)行，則它將方便得多。
[0014] 因此，找到比目前使用的Bethesda系列更敏感同時(shí)保持對(duì)MSI的特異性的微衛(wèi) 星不穩(wěn)定性標(biāo)記將是有利的。理想地，用無(wú)偏檢測(cè)法找到該些標(biāo)記（即在整個(gè)基因組內(nèi)尋 找而不是檢查認(rèn)為在疾病背景中改變的具體區(qū)域）。另一優(yōu)勢(shì)是指示MSI的標(biāo)記的鑒定本 身。該就是說(shuō)，它們是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的通用標(biāo)記，而不僅僅是結(jié)腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 的標(biāo)記（如Bethesda系列的情況）。該確實(shí)將避免找到其中可W存在MSI的每種癌癥的新 標(biāo)記的需要。另一優(yōu)勢(shì)將是可W不依賴(lài)于技術(shù)地測(cè)定其狀態(tài)的標(biāo)記的鑒定。更具體而言， 可W用下一代測(cè)序技術(shù)鑒定（而不是僅用Sanger測(cè)序鑒定）的標(biāo)記。該樣，實(shí)驗(yàn)室無(wú)需保 持它們僅用于檢查Bethesda系列標(biāo)記的儀器。
[0015] 此外，還存在進(jìn)一步優(yōu)化MMR特異性治療例如W更合理地預(yù)測(cè)它們對(duì)祀向治療的 反應(yīng)的巨大需要。另外，存在找到克服對(duì)常用治療的抗性的方式的需要，例如，通過(guò)鑒定MMR 缺陷腫瘤對(duì)其敏感的治療，即使它們對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療具有抗性。
[001引發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明的目的是提供用于測(cè)定具體癌癥的MSI狀態(tài)的更好的標(biāo)記。為了確保檢測(cè) 無(wú)偏，我們?cè)诖耸状螆?bào)道錯(cuò)配修復(fù)缺陷腫瘤的下一代測(cè)序。選擇不處于長(zhǎng)微衛(wèi)星中的標(biāo)記， 使得它們的檢測(cè)不依賴(lài)于Sanger測(cè)序技術(shù)。另外，為了擴(kuò)大標(biāo)記的適用性，在不同腫瘤類(lèi) 型中評(píng)價(jià)了標(biāo)記，使得它們代表多種癌癥的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性標(biāo)記，而不是癌癥類(lèi)型特異性 標(biāo)記。最后，選擇經(jīng)常存在于腫瘤中的標(biāo)記。有趣地，許多頻發(fā)（熱點(diǎn)）突變聚集在影響 DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的基因中，且可W顯示此途徑在功能上受影響。因此，可W證明，該些 標(biāo)記為陽(yáng)性的腫瘤對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑（如PARP抑制劑）的抑制敏感；該產(chǎn)生合 成致死相互作用。
[0018] 如將在實(shí)施例章節(jié)中展開(kāi)，下一代測(cè)序允許鑒定可W用來(lái)檢測(cè)MMR缺陷且符合該 些條件的新的標(biāo)記系列。
[0019] 鑒定出的標(biāo)記可W分為兩類(lèi)；存在于具體基因的編碼區(qū)（即外顯子）中的微衛(wèi)星 區(qū)域中的插入/缺失，及存在于具體基因的非編碼區(qū)（最尤其是5'和3'UTR區(qū)）中的插入 /缺失。
[0020] 因此，本文提供診斷腫瘤的MSI狀態(tài)的方法，其包括測(cè)定插入/缺失在腫瘤DNA樣 品中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域中的存在，其中該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是：
[002。-存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域； 或
[0022]-選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那些和/或存在于來(lái)自表I中所列基 因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少H個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域；
[002引其中至少一個(gè)插入/缺失的存在指示MSI。
[0024] 根據(jù)其他具體實(shí)施方案，該微衛(wèi)星區(qū)域是同聚物區(qū)域。還根據(jù)其他具體實(shí)施方案， 該微衛(wèi)星區(qū)域與表1或2中鑒定的微衛(wèi)星區(qū)域相同（即該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域選自表1或 2中所列的微衛(wèi)星區(qū)域的列表）。
[002引根據(jù)具體實(shí)施方案，存在于UTR中的微衛(wèi)星區(qū)域可W選自表4而不是表1。根據(jù)其 他具體實(shí)施方案，該些微衛(wèi)星區(qū)域可W選自表6而不是表1。
[0026] 根據(jù)備選而非排他的具體實(shí)施方案，存在于基因的外顯子中的微衛(wèi)星區(qū)域可W選 自表5而不是表2。根據(jù)其他具體實(shí)施方案，該區(qū)域可W選自表7而不是表2。
[0027] 根據(jù)非常具體的實(shí)施方案，該微衛(wèi)星區(qū)域可W選自表8中所列的基因。
[0028] 根據(jù)具體實(shí)施方案，診斷其MSI狀態(tài)的癌癥或腫瘤選自：結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、 卵巢癌、胃癌、白血病和Lynch綜合癥的腫瘤。
[0029] 由于非編碼區(qū)（如5'和3'UTR區(qū)）中的微衛(wèi)星中的插入/缺失經(jīng)受了比編碼區(qū) 中的插入/缺失少的選擇壓力（后者由此導(dǎo)致移碼突變，產(chǎn)生完全不同于最初的翻譯），可 W證明，來(lái)自非編碼區(qū)的微衛(wèi)星中的插入/缺失是不同癌癥類(lèi)型中MSI的可靠標(biāo)記。事實(shí) 上，在證明具有MSI的MMR缺陷腫瘤上測(cè)試時(shí)，本文鑒定的超過(guò)50%的非編碼區(qū)標(biāo)記評(píng)分為 陽(yáng)性。對(duì)于外顯子標(biāo)記，在該些腫瘤上測(cè)試時(shí)，仍有超過(guò)1/3評(píng)分為陽(yáng)性。該解釋了為什么 設(shè)想在至少部分標(biāo)記處于外顯子區(qū)中時(shí)使用至少H個(gè)標(biāo)記。
[0030] 還尤其設(shè)想使用外顯子區(qū)中的標(biāo)記和非編碼區(qū)中的標(biāo)記的組合。例如，根據(jù)具體 實(shí)施方案，其中測(cè)定插入/缺失的存在的該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是選自存在于來(lái)自表1中 所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域和選自存在于表2中所 列基因的外顯子中的那些的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域。
[0031] 根據(jù)具體實(shí)施方案，設(shè)想使用多于至少兩個(gè)或H個(gè)的標(biāo)記。使用更多的標(biāo)記通常 將產(chǎn)生更準(zhǔn)確的診斷（雖然此益處將增加成本。另外，一旦高于標(biāo)記的某個(gè)闊值，加入另一 標(biāo)記的相對(duì)價(jià)值即受限，因?yàn)樗⒎潜厝辉黾有畔ⅲ?。因此，根?jù)具體實(shí)施方案，使用至少 4、5、6、7或8個(gè)標(biāo)記（即選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那些和/或存在于來(lái)自 表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的微衛(wèi)星區(qū)域中的插入/缺失）。根據(jù)另一具 體實(shí)施方案，用至少8、9、10、11或12個(gè)插入/缺失在選自存在于表2中所列基因的外顯子 中的那些和/或存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的微衛(wèi)星區(qū) 域中的存在來(lái)測(cè)定MSI狀態(tài)。根據(jù)其他具體實(shí)施方案中，還使用甚至更多的標(biāo)記，例如至少 15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)標(biāo)記、或至少50個(gè)標(biāo)記。
[0032] 根據(jù)具體實(shí)施方案，所使用的至少一個(gè)標(biāo)記是之前未與癌癥相關(guān)的基因中或之前 未知在MMR缺陷腫瘤中受影響的基因中的外顯子標(biāo)記。因此，設(shè)想選自存在于表2中所列基 因的外顯子中的那些的一個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星包含存在于選自W下的基因中的至少一個(gè)微衛(wèi) 星；SETD1B、RBMXL1、CCDC150、0R7E24、C15orf40、KIAA2018、LTN1、化C22A9、C畑26、孤X27、 EX0SC9、FAMl 11B、KIAA0182、KIAA1919、MIS18BP1、PRRT2、TMEM60、AQP7、ARVl、CCDC168、 ELAVL3、F8、陽(yáng)TUB、HPS1、NBEAL1、P4HTM、PIGB、RBM43、RG9MTD1、SWR和TMEM9。根據(jù)甚 至更具體的實(shí)施方案，至少一個(gè)微衛(wèi)星存在于選自W下的基因中；SETD1B、TMEM60、DDX27、 EX0SC9、FAM111B和KIAA1919。根據(jù)備選實(shí)施方案，SEC31A、CN0T2、RNF145、RNPC3、SLC35W、TMBIM4、CD3G、D0CK3、MY010和PRRGl也可W用于該些列表中。
[0033] 根據(jù)備選的具體實(shí)施方案，所使用的至少一個(gè)標(biāo)記是定位于5'或3'UTR區(qū)中的 10和15個(gè)重復(fù)堿基之間的同聚物中的插入/缺失。
[0034] 尤其設(shè)想的標(biāo)記系列是表3中所示基因中的微衛(wèi)星。因此，根據(jù)該些實(shí)施方案，提 供該樣的方法，其中測(cè)定插入/缺失在腫瘤DNA的樣品中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域中的存在， 其中該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是來(lái)自表3中所示的56個(gè)基因的微衛(wèi)星區(qū)域。
[00巧]根據(jù)具體實(shí)施方案，MSI狀態(tài)可W進(jìn)一步表征如下；如果所研究的微衛(wèi)星區(qū)域的 17%或更多包含插入/缺失，則該腫瘤為MSI-H，如果2%和17%之間的微衛(wèi)星區(qū)域包含插 入/缺失，則該腫瘤為MSI-L，如果不到2 %的微衛(wèi)星區(qū)域包含插入/缺失，則該腫瘤為微 衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS)。作為實(shí)例，對(duì)于56個(gè)標(biāo)記的實(shí)例，如果0個(gè)或1個(gè)標(biāo)記為陽(yáng)性，則將該腫 瘤分類(lèi)為MSS，如果2至9個(gè)為陽(yáng)性標(biāo)記，則該腫瘤是MSI-L，如果10個(gè)或更多個(gè)為陽(yáng)性標(biāo) 記，則將該腫瘤分類(lèi)為MSI-H。備選地，來(lái)自Bethesda系列的范圍可W外推（10個(gè)中的0個(gè) 是陽(yáng)性標(biāo)記是MSS，10個(gè)中的1個(gè)或2個(gè)是陽(yáng)性標(biāo)記為MSI-L，3個(gè)或更多個(gè)是陽(yáng)性標(biāo)記為 MSI-H;其對(duì)應(yīng)于在MSS和MSI-L之間區(qū)分的1%和9%之間的陽(yáng)性標(biāo)記及分類(lèi)為MSI-H的 超過(guò)20 %陽(yáng)性標(biāo)記的邊界）。
[0036] 根據(jù)具體方面，本文提供的微衛(wèi)星插入/缺失標(biāo)記可W獨(dú)立于所使用的技術(shù)檢 巧IJ。但是，尤其設(shè)想不通過(guò)基于Sanger測(cè)序的方法來(lái)進(jìn)行插入/缺失的存在的測(cè)定。該是 因?yàn)橛肂ethesda標(biāo)記系列檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的方法通常通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)行，Sanger 測(cè)序是證明非常麻煩的流程。根據(jù)其他實(shí)施方案，尤其設(shè)想通過(guò)單堿基對(duì)延伸法（如 SequenomMassArray)、DNA雜交技術(shù)（例如化qman)、烙解曲線(xiàn)分析（包括HRM)或類(lèi)似技 術(shù)測(cè)定插入/缺失的存在。
[0037] 根據(jù)另一方面，提供用于測(cè)定腫瘤樣品中的MSI的生物標(biāo)志系列。該種生物標(biāo)志 序列包含選自存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表2 中所列基因的外顯子中的那些的至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域。根據(jù)非常具體的實(shí)施方案，該生物 標(biāo)志系列包含表3中所列微衛(wèi)星區(qū)域的至少一半。根據(jù)其他具體實(shí)施方案，該生物標(biāo)志系 列由表3中所列的56個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域所代表。
[0038] 尤其設(shè)想此生物標(biāo)志系列可W用來(lái)檢測(cè)癌癥中的MSI狀態(tài)。因此，提供此生物標(biāo) 志系列在診斷癌癥中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性中的用途。
[0039] 因此，提供本文所述的生物標(biāo)志系列用作藥物。更具體而言，提供本文所述的生物 標(biāo)志系列用作診斷劑。更具體而言，提供本文所述的生物標(biāo)志系列用于診斷癌癥中的微衛(wèi) 星不穩(wěn)定性。
[0040] 根據(jù)其他實(shí)施方案，提供用于測(cè)定腫瘤樣品中的MSI的試劑盒，其包含對(duì)生物標(biāo) 志系列（即選自存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表 2中所列基因的外顯子中的那些的至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域）進(jìn)行基因型分型的工具。最具體 而言，該試劑盒將適于尤其設(shè)想的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志系列。根據(jù)具體實(shí)施方案，該試劑盒 將包含對(duì)Bethesda系列標(biāo)記或擴(kuò)展的Bethesda系列標(biāo)記進(jìn)行基因型分型的工具。該類(lèi)試 劑盒尤其適于進(jìn)行該標(biāo)記與Bethesda系列的并肩比較。
[0041] 如實(shí)施例章節(jié)中所示，本文提供的插入/缺失標(biāo)記富集在涉及DNA雙鏈斷裂修復(fù) 途徑并影響其功能性的基因中。因此，其中存在該些標(biāo)記的細(xì)胞對(duì)DM堿基切除修復(fù)抑制 的合成致死性敏感。該提供了新的治療機(jī)會(huì)，因?yàn)镸SI陽(yáng)性腫瘤常對(duì)所使用的標(biāo)準(zhǔn)化療具 有抗性。
[0042] 因此，在另一方面，提供篩查癌細(xì)胞對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性 的方法，其包括測(cè)定該癌細(xì)胞中的MSI狀態(tài)。根據(jù)具體實(shí)施方案，該DNA堿基切除修復(fù)酶抑 制劑是PARP抑制劑。根據(jù)具體實(shí)施方案，該癌細(xì)胞來(lái)自選自W下的癌癥；結(jié)直腸癌、子宮內(nèi) 膜癌、卵巢癌、胃癌、白血病和Lynch綜合癥的腫瘤。雖然該些方法基本上可W在體內(nèi)、離體 和在體外進(jìn)行，但尤其設(shè)想在體外進(jìn)行它們。
[0043] 根據(jù)具體實(shí)施方案，MSI的存在指示癌細(xì)胞對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的 敏感性；即在用該種抑制劑處理時(shí)，該癌細(xì)胞將死亡、停止生長(zhǎng)或更少地增殖。
[0044] 根據(jù)具體實(shí)施方案，該癌細(xì)胞是獲自個(gè)體的細(xì)胞，且對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制 劑處理的敏感性的篩查用于指導(dǎo)該個(gè)體的處理。根據(jù)備選實(shí)施方案，該敏感性篩查用于分 層或分類(lèi)個(gè)體進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
[0045] 根據(jù)具體實(shí)施方案，通過(guò)本文所述的方法來(lái)確定MSI的存在，即包括測(cè)定插入/缺 失在腫瘤DNA的樣品中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域中的存在的方法，其中該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū) 域是：
[0046] -存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域； 或
[0047]-選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那些和/或存在于來(lái)自表1中所列基 因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少H個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域；
[004引其中至少一個(gè)插入/缺失的存在指示MSI。
[0049] 根據(jù)其他具體實(shí)施方案，用本文所述的生物標(biāo)志系列確定MSI的存在，即包含選 自存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表2中所列基因 的外顯子中的那些的至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域的生物標(biāo)志系列。
[0050] 因此，不僅提供篩查癌細(xì)胞對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性的方法， 還提供診斷患有癌癥的個(gè)體對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性的方法，其包括W 下步驟：
[0051]-測(cè)定獲自該個(gè)體的癌細(xì)胞的樣品中的MSI狀態(tài)；
[005引-將該MSI狀態(tài)與對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性相關(guān)，其中MSI的存 在指示對(duì)該處理的敏感性。
[0053] 可選地，該些方法包括從該個(gè)體獲得癌細(xì)胞的樣品的附加步驟（在測(cè)定步驟之 前）。然后通常在所獲得的樣品的細(xì)胞中進(jìn)行MSI狀態(tài)的測(cè)定。尤其設(shè)想在體外進(jìn)行癌細(xì) 胞的樣品中的MSI狀態(tài)的測(cè)定。
[0054] 根據(jù)具體實(shí)施方案，該DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑抑制劑是PARP抑制劑。根據(jù)具 體實(shí)施方案，該癌細(xì)胞來(lái)自選自W下的癌癥：結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、白血病 和Lynch綜合癥的腫瘤（或Lynch綜合癥譜的任意其他腫瘤）。根據(jù)具體實(shí)施方案，通過(guò)本 文所述的方法來(lái)確定MSI的存在，即包括測(cè)定插入/缺失在腫瘤DNA的樣品中的至少兩個(gè) 微衛(wèi)星區(qū)域中的存在的方法，其中該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是：
[005引-存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域； 或
[0056] -選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那些和/或存在于來(lái)自表I中所列基 因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少H個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域；
[0057] 其中至少一個(gè)插入/缺失的存在指示MSI。
[0058] 根據(jù)其他具體實(shí)施方案，用本文所述的生物標(biāo)志系列確定MSI的存在，即包含選 自存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表2中所列基因 的外顯子中的那些的至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域的生物標(biāo)志系列。
[0059] 還設(shè)想此方面的方法可W包括用DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理該個(gè)體的步驟 (如果通過(guò)MSI狀態(tài)確定該個(gè)體對(duì)該種處理敏感）。
[0060] 因此，還提供用于在有需要的個(gè)體中治療具有MSI的癌癥的方法，其包括：
[0061]-確定MSI在該癌癥中的存在；
[0062] -對(duì)該個(gè)體施用DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑。
[0063] 設(shè)想通過(guò)對(duì)該個(gè)體施用該抑制劑來(lái)治療該癌癥。該方法可W可選地具有從該個(gè)體 獲得癌細(xì)胞的樣品的附加步驟（在測(cè)定MSI和確定MSI的存在的步驟之前）。
[0064] 根據(jù)具體實(shí)施方案，該DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑抑制劑是PARP抑制劑。根據(jù)具 體實(shí)施方案，該癌細(xì)胞來(lái)自選自W下的癌癥：結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、白血病 和Lynch綜合癥的腫瘤。根據(jù)具體實(shí)施方案，通過(guò)本文所述的方法來(lái)確定MSI的存在，即包 括測(cè)定插入/缺失在腫瘤DNA的樣品中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域中的存在的方法，其中該至 少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是：
[006引-存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域； 或
[0066] -選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那些和/或存在于來(lái)自表1中所列基 因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少H個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域；
[0067] 其中至少一個(gè)插入/缺失的存在指示MSI。
[0068] 根據(jù)其他具體實(shí)施方案，用本文所述的生物標(biāo)志系列確定MSI的存在，即包含選 自存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表2中所列基因 的外顯子中的那些的至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域的生物標(biāo)志系列。
[0069] 附圖簡(jiǎn)述
[0070] 圖1.MS冊(cè)缺陷高變體中的體細(xì)胞取代和插入/缺失。
[0071] (a)MMR缺陷腫瘤和兩種MMR健全腫瘤中的平均突變頻率（每mpb堿基的突變 數(shù)，）。化）按插入/缺失和取代分層的突變頻率。（c-d)在微衛(wèi)星、同聚物（長(zhǎng)度超過(guò)化P)、 短同聚物（長(zhǎng)度為3至化P)中及"不在重復(fù)區(qū)域中"觀察到的插入/缺失的分?jǐn)?shù)，與它們 在該些區(qū)域中的預(yù)期分?jǐn)?shù)相比。（e-f)分層為外顯子、基因間和內(nèi)含子區(qū)域的MMR缺陷腫瘤 中的插入/缺失（e)和取代（f)的頻率。
[0072] 圖2.MS冊(cè)缺陷高變體中的體細(xì)胞突變和插入/缺失模式。
[0073] (a)黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、MMR缺陷子宮內(nèi)膜腫瘤、兩種MMR健全子 宮內(nèi)膜腫瘤的全基因組序列和來(lái)自子宮內(nèi)膜腫瘤患者的匹配種系DNA(外周白細(xì)胞）中的 體細(xì)胞取代模式。（b-c)MMR缺陷化）和MMR健全（C)腫瘤中的體細(xì)胞取代頻率按第一個(gè)核 巧酸突變的二核巧酸分層。歸一化的取代頻率反映受影響的二核巧酸的數(shù)目除W那些二核 巧酸的全基因組數(shù)目，表示為總?cè)〈l率的百分比。（d)預(yù)測(cè)MMR缺陷腫瘤中的取代頻率的 基因組特征多變量線(xiàn)性回歸模擬。所展示的是顯示取代頻率和基因組特征之間相關(guān)的按取 代的數(shù)目排序的基因組特征數(shù)據(jù)的熱圖。在熱圖右側(cè)的條形圖中展示各基因組特征的源自 線(xiàn)性模型的T值，并顯示顯著性（灰色陰影等于P〉0.01)和相關(guān)方向。為了在單個(gè)熱圖中 容納不同尺度的各特征，按百分位數(shù)分布展示基因組特征數(shù)據(jù)，白色和紅色分別表示低和 高百分位數(shù)。因?yàn)閿?shù)目不足W按IMb窗口進(jìn)行模擬，將CpG位點(diǎn)中的G:C〉A(chǔ):T轉(zhuǎn)換按IOMb 窗口分級(jí)。（e)高變體中每IMb窗口的取代、轉(zhuǎn)換（排除CG中的G:C〉A(chǔ):T)和顛換的頻率 對(duì)按十分位數(shù)分級(jí)的該窗口的復(fù)制時(shí)間。頻率相對(duì)于最早窗口復(fù)制展示。誤差棒表示平均 值的標(biāo)準(zhǔn)誤（對(duì)于復(fù)制時(shí)間超過(guò)0. 2的取代和轉(zhuǎn)換，P<0. 01)。（f)CpG島內(nèi)和CpG島外的 取代、轉(zhuǎn)換（排除CG中的G:C〉A(chǔ):T)和顛換的頻率，相對(duì)于其在高變體中的全基因組頻率。 (g)預(yù)測(cè)MMR缺陷腫瘤中的插入/缺失頻率的基因組特征多變量線(xiàn)性回歸模擬。熱圖和條 形圖如針對(duì)系列（d)所述。化)MMR缺陷腫瘤中按核巧酸分層的受插入/缺失影響的同聚物 的分?jǐn)?shù)，與具有該核巧酸含量的同聚物的全基因組分?jǐn)?shù)相比。（i)插入或缺失所示數(shù)目的堿 基的所有插入/缺失的分?jǐn)?shù)。（j-k)高變體中的體細(xì)胞取代和最接近的體細(xì)胞插入/缺失 (j)或取代化）之間的距離及基于20個(gè)隨機(jī)模型的預(yù)期距離。
[0074]圖3. 10個(gè)MMR缺陷外顯子組的體細(xì)胞突變模式。
[00巧](a) 10個(gè)MMR缺陷腫瘤和4個(gè)MMR健全腫瘤的編碼外顯子中的平均突變頻率?；?按插入/缺失和取代分層的10個(gè)MMR缺陷腫瘤對(duì)4個(gè)MMR健全腫瘤的編碼外顯子中的平 均突變頻率。（c-d)MMR缺陷外顯子（C)和一組公開(kāi)的種系從頭取代（d)中按二核巧酸（第 一個(gè)核巧酸突變）分層的取代頻率。作圖的歸一化取代頻率反映受影響二核巧酸的數(shù)目除 W那些二核巧酸的全基因組數(shù)目，并表示為總體細(xì)胞取代頻率的百分比。（e)在MLHl缺陷 和MSH2缺陷腫瘤中在微衛(wèi)星、同聚物、短同聚物中及不在重復(fù)區(qū)域中觀察到的插入/缺失 的分?jǐn)?shù)，與該些區(qū)域的全基因組分?jǐn)?shù)相比。
[007引圖4.MMR缺陷腫瘤的外顯子組、5'和3'UTR中的熱點(diǎn)突變。
[0077] (a)同聚物的分?jǐn)?shù)作為其在編碼區(qū)、5'和3'UTR中的長(zhǎng)度的函數(shù)。化）受插入/ 缺失影響的同聚物的分?jǐn)?shù)作為編碼區(qū)、5'和3'UTR中的同聚物長(zhǎng)度的函數(shù)。（C)MMR缺陷腫 瘤的編碼區(qū)、5'和3'UTR中的平均體細(xì)胞插入/缺失頻率。（d)經(jīng)常受插入/缺失影響的 同聚物的分?jǐn)?shù)作為編碼區(qū)、5'和3'UTR的同聚物長(zhǎng)度的函數(shù)。
[0078] 圖5.評(píng)估MSI的Bethesda和56標(biāo)記熱點(diǎn)突變系列。
[0079] 在114個(gè)未選擇的原發(fā)性子宮內(nèi)膜腫瘤的獨(dú)立系列中分析了擴(kuò)展的Bethesda系 列及通過(guò)外顯子組測(cè)序鑒定的外顯子、5'和3'UTR中的56個(gè)熱點(diǎn)突變的系列。結(jié)果基于 擴(kuò)展的Bethesda系列按照高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H)、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-L)或微衛(wèi) 星穩(wěn)定（MS巧狀態(tài)進(jìn)行顏色編碼。
[0080] 圖6.通過(guò)皿途徑影響DNADSB修復(fù)的體細(xì)胞突變。
[0081] 通過(guò)皿途徑修復(fù)DSB的示意圖（修改自IPA同源重組途徑示意圖）。標(biāo)記為澄 色（灰色背景）的基因攜帶我們自己的MMR缺陷腫瘤集中或來(lái)自公開(kāi)可得的TCGA數(shù)據(jù)集 的MSI-H腫瘤中的體細(xì)胞突變。
[008引圖7. MMR缺陷細(xì)胞對(duì)PARP抑制敏感。
[0083] (a)染色DNA修復(fù)標(biāo)記RAD51 (綠色）并用DAPI(藍(lán)色）復(fù)染的暴露于0或10UM olaparib的MMR缺陷和MMR健全原代腫瘤細(xì)胞的代表性共焦圖像。箭頭（黃色）指示包 含超過(guò)5個(gè)綠色核點(diǎn)的RAD51陽(yáng)性細(xì)胞?；┖衼V個(gè)RAD51核點(diǎn)的細(xì)胞的定量。顯示 用olaparib(10yM)或載體對(duì)照處理后24小時(shí)時(shí)8種不同的MMR缺陷細(xì)胞和4種不同的 MMR健全細(xì)胞的培養(yǎng)物的平均值。（c-d) 8種MMR缺陷細(xì)胞（C)和4種MMR健全細(xì)胞（d)伴 隨olaparib的濃度遞增（lyM、3yM、10yM)的平均細(xì)胞增殖。用xCE化igenceRTCADP 系統(tǒng)（RocheAppliedScience)測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖直至處理后48小時(shí)。將值對(duì)模擬處理 的對(duì)照（OuMolaparib)歸一化。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。星號(hào)表示，在所示時(shí)間點(diǎn)， 處理的細(xì)胞和模擬處理的細(xì)胞之間統(tǒng)計(jì)上顯著的差異（P<〇. 05)。（e)每種細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì) 胞增殖率（MMR缺陷細(xì)胞W藍(lán)色顯示（圖中靠下的8個(gè)）和MMR健全細(xì)胞W紅色顯示（圖 中靠上的4個(gè)））?？偟膩?lái)說(shuō)，MMR缺陷細(xì)胞表征為增殖的劑量依賴(lài)性減少，而MMR健全細(xì)胞 未響應(yīng)olaparib(重復(fù)測(cè)量P= 2. 0E-7 ;還見(jiàn)圖7c)。
[0084] 發(fā)明詳述
[00財(cái)定義
[0086] 將就具體實(shí)施方案并參考某些附圖描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于該些具體實(shí)施方 案和附圖，而是僅通過(guò)權(quán)利要求來(lái)限制。權(quán)利要求中任何參考符號(hào)不應(yīng)解釋為限制范圍。所 述附圖僅是示意性和非限制性的。在附圖中，為了說(shuō)明的目的，一些元素的大小可W夸大， 而不是按比例繪制。在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用術(shù)語(yǔ)"包含"時(shí)，它不排除任意其他元素 或步驟。在提到單數(shù)名詞時(shí)使用不定冠詞或定冠詞（例如"一"、"一個(gè)"、"該"）時(shí)，除非另 有明確說(shuō)明，該包括多個(gè)該名詞。
[0087] 此外，本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中的術(shù)語(yǔ)第一、第二等用于在相似的元素之間進(jìn)行區(qū) 分，并非必然用于描述連續(xù)順序或時(shí)間順序。應(yīng)理解，該樣使用的術(shù)語(yǔ)在適當(dāng)環(huán)境下可互 換，本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠W本文所描述或說(shuō)明的順序之外的其他順序操作。
[0088] 提供W下術(shù)語(yǔ)或定義僅是為了輔助理解本發(fā)明。除非文中明確定義，本文所用 的所有術(shù)語(yǔ)具有與它們之于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員相同的含義。對(duì)于本領(lǐng)域的定義 和術(shù)語(yǔ)，從業(yè)者尤其可參考Sambrook等，MolecularCloning=AL油oratoryManual,第 2 版，ColdSpringHarborPress,Plainsview,NewYork(1989);和Ausubel等，Qirrent ProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。 本文提供的定義不應(yīng)解釋為具有比本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解小的范圍。
[0089] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"微衛(wèi)星"或"微衛(wèi)星區(qū)域"指核巧酸序列中由至少兩個(gè)重復(fù)單位 組成且具有最少6個(gè)堿基的長(zhǎng)度的單核巧酸、二核巧酸、H核巧酸、四核巧酸、五核巧酸或 六核巧酸重復(fù)。微衛(wèi)星的具體亞類(lèi)包括同聚物。本文所用的"同聚物"指微衛(wèi)星區(qū)域，其是 至少6個(gè)堿基的單核巧酸重復(fù)；換言之，如果在DNA水平看，則是至少6個(gè)連續(xù)的A、C、T或 G殘基的一段序列。最尤其是，在測(cè)定微衛(wèi)星時(shí)，審視個(gè)體的基因組DNA(或存在于個(gè)體中的 癌癥的基因組DNA)。
[0090] 本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)"MSI狀態(tài)"指微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI)的存在，微衛(wèi)星不穩(wěn)定 性是微衛(wèi)星中重復(fù)DNA核巧酸單位數(shù)目的克隆改變或體細(xì)胞改變。MSI狀態(tài)可W是H個(gè)離 散種類(lèi)之一；MSI-H，也稱(chēng)為MSI-高、MSI陽(yáng)性或MSI;MSI-L，也稱(chēng)為MSI-低；或微衛(wèi)星穩(wěn)定 (MSS)，也稱(chēng)為缺乏MSI。通常，為了分類(lèi)為MSI-H，用于分類(lèi)MSI狀態(tài)的標(biāo)記中的至少20% 需評(píng)分為陽(yáng)性，而對(duì)于MSS分類(lèi)，不到2. 5%評(píng)分為陽(yáng)性。如果中間數(shù)目的標(biāo)記評(píng)分為陽(yáng)性， 則將腫瘤分類(lèi)為MSI-L。應(yīng)注意，由于該些初始界限衍生自擴(kuò)展的Bethesda標(biāo)記系列（其 僅由10個(gè)標(biāo)記組成），由于通常將評(píng)估不到100個(gè)標(biāo)記，且陽(yáng)性標(biāo)記的數(shù)目是整數(shù)，該百分 比是近似值。MSS和MSI-L之間的差異通常將是1%和9%之間的標(biāo)記評(píng)分為陽(yáng)性（在評(píng) 估10個(gè)標(biāo)記時(shí)，該意味著1個(gè)陽(yáng)性標(biāo)記導(dǎo)致MSI-L分類(lèi)），而MSI-L和MSI-H之間的差異通 常將是15%和25%之間的陽(yáng)性標(biāo)記（即，在該闊值之上，腫瘤是MSI-H，在該闊值之下，腫 瘤是MSI-L)。備選地，僅評(píng)估微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的存在和缺乏之間的差異而不是在H個(gè)種類(lèi) 中進(jìn)行區(qū)分，在該種情況下，該狀態(tài)為存在MSI或缺乏MSI( =MSS)。鑒于完整的錯(cuò)配修復(fù) (MMR)系統(tǒng)的缺乏和MSI的存在之間的相關(guān)性，診斷MSI的存在（或診斷MSI狀態(tài)）可W解 釋為診斷MMR效率。但是，應(yīng)注意，MMR可W有功能或缺乏，不存在中間種類(lèi)。因此，MSI-L 也對(duì)應(yīng)于MMR缺陷一該種情況等同于僅評(píng)估MSI的存在或缺乏。
[0091]"診斷腫瘤的MSI狀態(tài)"或"診斷個(gè)體中腫瘤的MSI狀態(tài)"或"診斷個(gè)體的MSI狀 態(tài)"或"測(cè)定腫瘤（或個(gè)體）的MSI狀態(tài)"在本文中認(rèn)為是同義詞。測(cè)定（或診斷）MSI狀 態(tài)通常暗示基于在所研究的微衛(wèi)星區(qū)域中檢測(cè)到一個(gè)或多個(gè)插入/缺失的存在而得出MSI 的結(jié)論，或基于未在所研究的微衛(wèi)星區(qū)域中檢測(cè)到插入/缺失而得出缺乏微衛(wèi)星不穩(wěn)定的 結(jié)論。因此，在微衛(wèi)星區(qū)域中"測(cè)定插入/缺失的存在"意指在該微衛(wèi)星區(qū)域中評(píng)估或檢測(cè) 插入/缺失的存在或缺乏。同樣，在至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域中測(cè)定插入/缺失的存在意指在 該至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域的每一個(gè)中評(píng)估或檢測(cè)插入/缺失的存在或缺乏。至少一個(gè)插入/ 缺失的存在指示MSI(如本申請(qǐng)中所解釋?zhuān)_定MSI所需的陽(yáng)性標(biāo)記的精確數(shù)目將取決于所 使用的標(biāo)記的數(shù)目）。
[0092] 本文所用的"插入/缺失"指包括插入、缺失二者及其組合的突變種類(lèi)。微衛(wèi)星區(qū) 域中的插入/缺失導(dǎo)致核巧酸的凈獲得或喪失?？蒞通過(guò)將它與其中不存在插入/缺失的 DNA相比（例如將來(lái)自腫瘤樣品的DNA與來(lái)自具有該腫瘤的個(gè)體的種系DNA相比），或者尤 其是在單態(tài)微衛(wèi)星或同聚物的情況下，通過(guò)將它與該微衛(wèi)星的已知長(zhǎng)度相比（尤其是通過(guò) 計(jì)數(shù)重復(fù)單位的數(shù)目），可W確定插入/缺失的存在。根據(jù)具體實(shí)施方案，尤其設(shè)想插入/ 缺失具有1和5個(gè)核巧酸之間的長(zhǎng)度（即微衛(wèi)星或同聚物的長(zhǎng)度比該微衛(wèi)星或同聚物的正 常已知長(zhǎng)度長(zhǎng)或短1至5個(gè)核巧酸）。根據(jù)其他具體實(shí)施方案中，該插入/缺失具有1至4 個(gè)核巧酸、1至3個(gè)核巧酸或1或2個(gè)核巧酸的長(zhǎng)度。應(yīng)注意，由于插入/缺失可W是插入 和缺失的組合，改變的核酸序列可W比該長(zhǎng)度參考大（例如，5個(gè)核巧酸的缺失與3個(gè)核巧 酸的插入導(dǎo)致長(zhǎng)度改變2,但微衛(wèi)星的序列也可W改變）。但是，最典型地，插入/缺失將是 通常為1或2個(gè)核巧酸的插入或缺失。
[0093]"單態(tài)微衛(wèi)星"是其中所有個(gè)體、尤其是給定群體的所有個(gè)體具有相同數(shù)目的重復(fù) 單位的微衛(wèi)星。該與"多態(tài)微衛(wèi)星"不同，多態(tài)微衛(wèi)星用來(lái)指其中給定群體的超過(guò)1 %展示 重復(fù)單位數(shù)目的雜合性的微衛(wèi)星。作為實(shí)例，BAT26標(biāo)記在超過(guò)99%的歐洲人種中由26個(gè) 腺嘿嶺組成，而在至多25%的美國(guó)人種（包括非洲裔美國(guó)人）中觀察到在此位置具有不同 數(shù)目的腺嘿嶺（例如15、20、22、23)的等位基因"。因此，BAT26在歐洲人種是單態(tài)微衛(wèi)星， 在美國(guó)人種是多態(tài)微衛(wèi)星le。
[0094]"腫瘤DNA的樣品"指可W用作進(jìn)行測(cè)序的基礎(chǔ)的任意樣品，其中存在來(lái)自癌癥的 DNA。本文所用的術(shù)語(yǔ)"癌癥"指涉及失調(diào)的細(xì)胞生長(zhǎng)的不同疾病，還指惡性腫瘤。術(shù)語(yǔ)"腫 瘤"在本申請(qǐng)中用作同義詞。設(shè)想此術(shù)語(yǔ)涵蓋所有實(shí)體瘤類(lèi)型（癌、肉瘤、胚細(xì)胞瘤），但它 還明確涵蓋非實(shí)體癌癥類(lèi)型，如白血病、淋己瘤和骨髓瘤。因此，"腫瘤DM的樣品"也可W是來(lái)自患有白血病的人的血液樣品。通常，腫瘤DNA的樣品已在一個(gè)點(diǎn)從個(gè)體、尤其是患有 癌癥的個(gè)體分離?？蛇x地，它已進(jìn)行了一種或多種形式的預(yù)處理（例如，裂解、分級(jí)分離、 分離、純化）W測(cè)序DNA，但也設(shè)想測(cè)序來(lái)自未處理的樣品的DNA。本文所用的名詞"個(gè)體" 指單個(gè)脊椎動(dòng)物，更尤其是單個(gè)哺乳動(dòng)物，最尤其是單個(gè)人類(lèi)。本文所用的"個(gè)體"通常是 人，但也可W是哺乳動(dòng)物，尤其是馴養(yǎng)動(dòng)物，如貓、狗、兔、豚鼠、雪貂、大鼠、小鼠等，或農(nóng)場(chǎng) 動(dòng)物，如馬、牛、豬、山羊、綿羊、駝羊等。個(gè)體還可W是非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物，如魚(yú)類(lèi)、爬行動(dòng) 物、兩棲動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)；基本上任意可發(fā)展癌癥的動(dòng)物都符合該定義。
[0095] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"結(jié)直腸癌"意在包括結(jié)腸的惡性腫瘤（ICD-10中的C18)、直腸己 狀結(jié)腸連接部的惡性腫瘤（ICD-10中的C19)、直腸的惡性腫瘤（ICD-10中的C20)及化口和 化管的惡性腫瘤（ICD-10中的C21)。
[0096] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"Lynch綜合癥"指常染色體顯性遺傳病癥，其具有結(jié)腸或結(jié)直腸 癌W及其他癌癥（包括子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、小腸癌、肝膽管癌、上尿道癌、腦癌和皮 膚癌）的高風(fēng)險(xiǎn)。該些癌癥的高風(fēng)險(xiǎn)是由使DNA錯(cuò)配修復(fù)受損的遺傳突變引起。該病癥的 舊名是HNPCC。
[0097] 本文所用的"DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑"指可W在DNA水平（通過(guò)抑制相關(guān)基 因產(chǎn)物的形成，即通過(guò)阻止或干擾轉(zhuǎn)錄）、在RNA水平（通過(guò)中和或去穩(wěn)定mRNA來(lái)阻止 或干擾翻譯）或在蛋白質(zhì)水平（通過(guò)中和或抑制涉及BER的蛋白質(zhì)）干擾基因產(chǎn)物的堿 基切除修復(fù)功能的物質(zhì)。尤其設(shè)想該抑制劑是PARP抑制劑，因?yàn)樵擃?lèi)抑制劑已良好地表 征。最尤其設(shè)想的是PARP-I和/或PARP-2的抑制劑，因?yàn)樵撔┟甘亲罨钴S地涉及B邸的 PARP。但是，也可W使用其他PARP的抑制劑。在該方面，最近的出版物提出，PARP抑制劑 iniparib(明確設(shè)想使用）抑制PARP-I和2之外的其他PARP，尤其是PARP-5和6(JiJ，Lee MP,KadotaM等Pharmacodynamicandpathwayanalysisofthreepresumedinhibitors ofpoly(ADP-ribose)polymerase:ABT-888,AZD2281,和BSI201.Proceedingsofthe 102ndAnnualMeetingoftheAmericanAssociationforCancerResearch;2011年 4 月 2-6 日；Orlando,Fla.AACR. 2011.Abstractnr4527;MaegleyKA,Bin曲amP,Tatlock JH等AllPARPinhibitorsarenotequal:aninvitromechanisticcomparison ofPF-01367338toiniparib.JClinOncol. 2011 ;29(增刊；摘要el3576);化gourney RA,KenyonKR,FranciscoFR等FunctionalanalysisofPARPinhibitorsAZD 2281andBSI-201inhumantumorprimarycultures:acomparisonofactivityand examinationofsynergywithcytotoxicdrugs.JClinOncol. 2011 ;29 (增干U;摘要 el3599))。
[0098]PARP抑制劑的實(shí)例包括但不限于iniparib、olaparib、rucaparib、veliparib、 CEP9722、MK4827、BMN-673 和 3-氨基苯甲醜胺。
[0099] 詳述
[0100] 發(fā)生在錯(cuò)配修復(fù)（MMR)缺陷細(xì)胞中的DNA復(fù)制錯(cuò)誤作為錯(cuò)配突變持續(xù)存在并使得 易感一系列腫瘤。因此，測(cè)序了第一個(gè)來(lái)自MMR缺陷腫瘤的基因組，允許無(wú)偏地評(píng)估DNA復(fù) 制錯(cuò)誤。觀察到突變率相對(duì)于MMR健全的腫瘤顯著提高。插入或缺失（插入/缺失）突變 最常發(fā)生，且大致限于同聚物序列，而單堿基對(duì)取代主要由A:T〉G:C和G:C〉A(chǔ):T轉(zhuǎn)換組成， 且更常定位在插入/缺失附近。由于取代率在體細(xì)胞插入/缺失附近更高，該暗示插入/ 缺失突變?cè)贒NA復(fù)制過(guò)程中作為誘變位點(diǎn)。由于陰性克隆選擇，體細(xì)胞突變率在外顯子組 中比在基因組的其余部分中低，而由于陽(yáng)性選擇，幾個(gè)MMR缺陷腫瘤中發(fā)生了一些外顯子 突變。該些頻發(fā)突變尤其影響在正常匹配組織中表達(dá)的基因，暗示它們代表了MMR缺陷腫 瘤進(jìn)程的驅(qū)動(dòng)者。
[0101] 有趣地，插入/缺失主要定位在同聚物中，尤其是具有增加的長(zhǎng)度的同聚物中。該 些觀察結(jié)果還具有中間臨床implication。目前用于MSI腫瘤的診斷分類(lèi)WWS的擴(kuò)展的 Bethesda系列僅具有有限的敏感性（即MLH1-、M甜2-和MS冊(cè)-缺陷腫瘤的80%、84%和 55% 16)，很可能是因?yàn)榇讼盗杏?個(gè)微衛(wèi)星及僅2個(gè)長(zhǎng)度分別為25和26個(gè)核巧酸的同聚 物標(biāo)記組成。通過(guò)將我們的56個(gè)頻發(fā)插入/缺失的系列應(yīng)用于114個(gè)子宮內(nèi)膜腫瘤，我們 可W證明，至多43%的腫瘤顯示可變的MSI程度。該顯著高于之前的報(bào)道，最可能是因?yàn)樵?些插入/缺失不是隨機(jī)選擇的，而是通過(guò)無(wú)偏評(píng)估頻繁影響外顯子組、5'和3'UTR的突變 鑒定的。我們還觀察到，子宮內(nèi)膜腫瘤中的頻發(fā)插入/缺失定位在其他癌癥類(lèi)型的MMR腫 瘤中。由于3'UTR中的插入/缺失僅由受影響的同聚物的長(zhǎng)度決定，而在外顯子組中，它 們需在源組織表達(dá)的基因中進(jìn)行陽(yáng)性選擇，多種癌癥類(lèi)型所共有的大多數(shù)插入/缺失定位 在5'和3'UTR。因此，5'和3'UTR或其他非編碼序列中的頻發(fā)突變似乎尤其適于檢測(cè)多 種癌癥類(lèi)型中的MSI。有趣地，最頻發(fā)的突變的選擇系列對(duì)檢測(cè)多種癌癥類(lèi)型中的微衛(wèi)星不 穩(wěn)定性（MSI)高度敏感。在114個(gè)原發(fā)性子宮內(nèi)膜腫瘤中，在幾乎一半的腫瘤中觀察到了 MSI的連續(xù)譜，表明MSI比預(yù)期更頻繁地發(fā)生。
[0102] 如將在實(shí)施例章節(jié)中、尤其是在實(shí)施例5中詳述，在MMR缺陷腫瘤中，在5'UTR和 3'UTR區(qū)中尤其存在更常受插入/缺失影響的同聚物。表1中提供突變最頻發(fā)的基因的列 表。
[0103] 表1.16個(gè)MMR缺陷腫瘤樣品中的5'和3'UTR區(qū)中最頻發(fā)的插入/缺失（存在 于16個(gè)腫瘤樣品中的至少4個(gè)中）。后兩欄分別顯示該同聚物有多頻繁地受插入或缺失影 響。
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 診斷腫瘤的MSI狀態(tài)的方法，其包括測(cè)定插入/缺失在所述腫瘤DNA樣品中的至少 兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域中的存在，其中至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是： -存在于來(lái)自表1中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域；或 -選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那些和/或存在于來(lái)自表1中所列基因的 5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少三個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域； 其中至少一個(gè)插入/缺失的存在指示MSI。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中微衛(wèi)星區(qū)域是同聚物區(qū)域。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中微衛(wèi)星區(qū)域與表1或表2中鑒定的微衛(wèi)星區(qū)域相同。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤選自結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃 癌、白血病和Lynch綜合癥的腫瘤。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是選自存在于來(lái)自表1 中所列基因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域，和選自存在于表2中 所列基因的外顯子中的那些的至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中選自存在于表2中所列基因的外顯子中的那 些的一個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星包含選自以下基因的至少一個(gè)微衛(wèi)星：SETD1B、RBMXL1、（XDC150、 TMEM60、DDX27、EX0SC9、FAM111B、KIAA0182、KIAA1919、0R7E24、P4HTM、PRRT2、RNPC3 和 TMEM97。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中至少兩個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是表3中所示的56個(gè)微 衛(wèi)星區(qū)域。
9. 權(quán)利要求7或8的方法，其中MSI進(jìn)一步表征如下：如果所述微衛(wèi)星區(qū)域的17%或 更多包含插入/缺失，則所述腫瘤為MSI-H，如果2%和17%之間的所述微衛(wèi)星區(qū)域包含插 入/缺失，則所述腫瘤為MSI-L，如果不到2 %的所述微衛(wèi)星區(qū)域包含插入/缺失，則所述腫 瘤為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS)。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中不通過(guò)基于Sanger測(cè)序的方法來(lái)進(jìn)行插入 /缺失的存在的測(cè)定。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)單堿基對(duì)延伸技術(shù)、DNA雜交技術(shù)或熔 解曲線(xiàn)分析來(lái)進(jìn)行插入/缺失的存在的測(cè)定。
12. 用于測(cè)定腫瘤樣品中的MSI的生物標(biāo)志系列，其包含選自存在于來(lái)自表1中所列基 因的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表2中所列基因的外顯子中的那些的至少八 個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域。
13. 權(quán)利要求12的生物標(biāo)志系列，其中至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域是選自表3中所列基因的 至少八個(gè)微衛(wèi)星區(qū)域。
14. 權(quán)利要求12或13的生物標(biāo)志系列，其用作診斷劑。
15. 權(quán)利要求12或13的生物標(biāo)志系列，其用于診斷癌癥中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。
16. 權(quán)利要求12或13的生物標(biāo)志系列的用途，用于診斷癌癥中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。
17. 用于測(cè)定腫瘤樣品中的MSI的試劑盒，其包含對(duì)選自存在于來(lái)自表1中所列基因 的5'UTR區(qū)或3'UTR區(qū)中的那些和存在于表2中所列基因的外顯子中的那些的至少八個(gè) 微衛(wèi)星區(qū)域進(jìn)行基因型分型的工具。
18. 在有需要的個(gè)體中治療具有MSI的癌癥的方法，其包括： -確定MSI在所述癌癥中的存在； -對(duì)所述個(gè)體施用DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑是PARP抑制劑。
20. 權(quán)利要求18或19的方法，其中通過(guò)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法和/或用權(quán) 利要求12和13的生物標(biāo)志系列確定MSI的存在。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中癌癥選自結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、白血病和 Lynch綜合癥的腫瘤。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中癌癥對(duì)用于這些類(lèi)型的癌癥的至少一種標(biāo)準(zhǔn)治療具有抗 性。
23. 篩查癌細(xì)胞對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性的方法，其包括測(cè)定所述 細(xì)胞中的MSI狀態(tài)。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中癌細(xì)胞來(lái)自選自結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌、白 血病和Lynch綜合癥的腫瘤的癌癥。
25. 權(quán)利要求23或24的方法，其中DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑是PARP抑制劑。
26. 權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法，其中MSI的存在指示對(duì)所述處理的敏感性。
27. 權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中癌細(xì)胞是獲自個(gè)體的細(xì)胞，且所述敏感性 的篩查用于指導(dǎo)所述個(gè)體的處理或用于分層或分類(lèi)所述個(gè)體進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
28. 權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法和 /或用權(quán)利要求12和13的生物標(biāo)志系列確定MSI的存在。
29. 診斷患有癌癥的個(gè)體對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性的方法，其包括 以下步驟： -可選地從所述個(gè)體獲得癌細(xì)胞的樣品； -測(cè)定從所述個(gè)體獲得的癌細(xì)胞的樣品中的MSI狀態(tài)； -將所述MSI狀態(tài)與對(duì)DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理的敏感性相關(guān)，其中MSI的存在 指示對(duì)所述處理的敏感性。
30. 權(quán)利要求29的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟：如果所述個(gè)體對(duì)這種處理敏感，則用 DNA堿基切除修復(fù)酶抑制劑處理所述個(gè)體。
31. 權(quán)利要求29或30的方法，其中通過(guò)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法和/或用權(quán) 利要求12和13的生物標(biāo)志系列確定MSI的存在。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104379765SQ201380030379
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月10日
【發(fā)明者】D·蘭布雷徹特 申請(qǐng)人:非營(yíng)利性組織佛蘭芒綜合大學(xué)生物技術(shù)研究所, 生命科學(xué)研究合伙人公司