專利名稱：：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞的檢測(cè)方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于癌診斷的、基于基因表達(dá)分析來檢測(cè)具有微衛(wèi)星不穗定性的細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)報(bào)道通過人類基因組計(jì)劃闡明的驚人發(fā)現(xiàn)之一是人基因組中含有的基因數(shù)比預(yù)測(cè)少的多，只有25000個(gè)左右。這個(gè)基因數(shù)和更低等生物相比幾乎沒有差異，不能充分解釋人的復(fù)雜的腦系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)統(tǒng)的功能。所以認(rèn)為在高等動(dòng)物的復(fù)雜的生物功能中，來自l個(gè)基因的多種的表達(dá)結(jié)構(gòu)起著重要的作用。來自1個(gè)基因的mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)的多樣性主要是通過mRNA轉(zhuǎn)錄、或者RM加工階段的選擇性啟動(dòng)子的利用、或者選擇性剪切進(jìn)行控制的(參見非專利文獻(xiàn)1)。選擇性剪切是指在mRM前體中多個(gè)內(nèi)含子存在的情況下，通常通過在多種剪切部位間發(fā)生在相互鄰接的剪切部位間進(jìn)行的剪切反應(yīng)，由1個(gè)mRNA前體產(chǎn)生多種成熟的niRNA(剪切變體)的機(jī)制。另一方面，選擇性啟動(dòng)子是指存在控制1個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄的選擇性的多個(gè)啟動(dòng)子。在選擇性啟動(dòng)子存在的情況下，由于在這個(gè)基因上存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄啟點(diǎn)，結(jié)果生成了具有不同的5'末端序列的多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。最近，報(bào)道說基于寡核苷酸帽法cDNA文庫中含有的1780295種的完整長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行的檢索，結(jié)果令人吃驚地發(fā)現(xiàn)在美國(guó)NCBI的RefSeq數(shù)據(jù)庫(http:〃ncbi.nih.gov/RefSeq/;轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相關(guān)數(shù)椐庫)中登記的基因中有約52%的基因在選擇性啟動(dòng)子的控制之下，平均每1個(gè)基因存在3.1個(gè)選擇性啟動(dòng)子(參見非專利文獻(xiàn)2)。已知通過這樣的由1個(gè)基因進(jìn)行多種表達(dá)，衍生出在進(jìn)化的過程中的生物的多樣性和復(fù)雜的生物功能，另外一方面，導(dǎo)致在個(gè)體中的異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)自體缺陷，其結(jié)果有時(shí)誘發(fā)細(xì)胞癌變(參見非專利文獻(xiàn)3)。對(duì)于遣傳性非息肉性大腸癌(Hereditarynon-poliposiscolorectalcancer;HNPCC)，通過從1993年到1995年分離的錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)的各種基因的發(fā)現(xiàn)，對(duì)其在遺傳學(xué)上的理解取得理飛躍性的進(jìn)步。錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制是指識(shí)別DNA復(fù)制和基因重組時(shí)在DNA上產(chǎn)生的異常的堿基匹配(錯(cuò)配)，將其除去加以修復(fù)的機(jī)制。已知在家族性肺瘤中最具代表性的疾病之一的HNPCC中，90%以上的情況下，作為錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷的反映的結(jié)果，其腫瘤組織的DNA中微衛(wèi)星不穗定性(MicrosatellUeinstability;MSI)呈陽性(參見非專利文獻(xiàn)4)。微衛(wèi)星是指2~5個(gè)堿基對(duì)的重復(fù)單位反復(fù)重復(fù)數(shù)次到數(shù)十次的重復(fù)序列，其不穗定性是指它們的重復(fù)數(shù)變得異常地少的現(xiàn)象。MSI通常能夠通過采用PCR法的微衛(wèi)星標(biāo)記(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250等)的分析實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，所以MSI的檢測(cè)成為在HNPCC診斷時(shí)的一個(gè)輔助(參見非專利文獻(xiàn)5)。此外，在1997年的MSI檢測(cè)相關(guān)國(guó)際交流會(huì)議中，將檢測(cè)出這些標(biāo)記中的2個(gè)以上的不穩(wěn)定性的腫瘤定義為MSI-H(檢測(cè)出腫瘤中30%以上的MSI的狀態(tài))，判定具有臨床病理性特征，癌的基因診斷多數(shù)根據(jù)致病基因的突變解析的結(jié)果。不過作為家族性腺痛性息肉病(Familialadenomatouspolyposis;FAP)的致病基因的APC基因等是不同的，在HNPCC的情況下，已經(jīng)確定了5個(gè)(hMSH2、hMLHl、hPMSl、hPMS2、以及hMSH6)致病基因，不過在這些致病基因有突變的情況下，發(fā)病的比例(浸透率；penetrancerate)也不是100%，所以在美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)的分類中，基于上述致病基因的突變進(jìn)行的HNPCC的基因診斷現(xiàn)在尚且未達(dá)到臨床水平，處于研究水平階段.也有人提出了針對(duì)hMLHl等癌相關(guān)基因進(jìn)行基因組上的基因突變和甲基化檢測(cè)，以此作為指標(biāo)的癌檢測(cè)方法的方案(專利文獻(xiàn)1以及2)。不過疾病覆蓋率不太高，此外在簡(jiǎn)便性以及迅速性方面也有問題。所以亟需開發(fā)出用于包括HNPCC在內(nèi)的癌診斷的、簡(jiǎn)便并且高可靠性的好的細(xì)胞檢測(cè)方法。認(rèn)為如果公開發(fā)能夠判斷癌發(fā)病的基因表達(dá)水平的細(xì)胞檢測(cè)方法，因?yàn)槟軌虼_認(rèn)檢測(cè)時(shí)的細(xì)胞的基因表達(dá)狀態(tài)，所以能夠用于實(shí)時(shí)地檢測(cè)細(xì)胞的突變。不過尚未開發(fā)出這樣有用的檢測(cè)方法。專利文獻(xiàn)1:特開2005-304497號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:特表2002-533061號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1:LandryJ.R.etal.，TrendsinGenetics,(2003)19(11)p.640-648非專利文獻(xiàn)2:KimuraK.etal.，GenomeResearch,(2006)16:p，55-65非專利文獻(xiàn)3:BrinkmanB.M.,Clin.Biochem.，(2004)37(7):p.584-594非專利文獻(xiàn)4:LiuB.etal.，NatureMed.，(1996)2:p,169-174非專利文獻(xiàn)5:LaihoP.etal.，CancerResearch,(2002)62:p.1166-1170非專利文獻(xiàn)6:DengG.etal.，CancerResearch,(1999)59:p.2029-203
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問趙本發(fā)明的目的是提供能夠用于癌診斷的、基于基因表達(dá)分析的細(xì)胞的檢測(cè)方法.解決問趙的方法本發(fā)明人等為了解決上述問題，反復(fù)努力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由人MLHl基因(hMLHl基因)表達(dá)至少3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體(變體1、變體2、變體3)，此外在顯示微衛(wèi)星不穗定性的癌細(xì)胞中，與其中主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體1相比，變體3的表達(dá)量相對(duì)增加，由此完成了本發(fā)明。即、本發(fā)明包含下述內(nèi)容。[1]基因表達(dá)分析方法，特征在于，測(cè)定生物試樣中的在5'末端含有序列號(hào)1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、以及在5'末端含有序列號(hào)2所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量，通過將其進(jìn)行比較，檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞。在該方法中，能夠使用實(shí)時(shí)PCR法測(cè)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量。使用實(shí)時(shí)PCR法的測(cè)定可以使用TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用下述的(a)以及(b)的引物對(duì)進(jìn)行測(cè)定(a)引物對(duì):其是由至少含有序列號(hào)1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子1部分的一部分的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對(duì)其是由至少含有序列號(hào)2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。作為適合上述(a)以及(b)的引物對(duì)的例子可以列舉作為由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合的引物對(duì)(a)、以及作為由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合的引物對(duì)(b)。使用這些引物對(duì)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在利用TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法的情況下，可以使用在一端添加了熒光物質(zhì)，另一端添加了消光物質(zhì)的序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。用上述本發(fā)明的方法檢測(cè)的顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞多數(shù)情況下是癌細(xì)胞.該癌可以是大腸癌。此外，這種大腸癌可以是遺傳性非息肉性大腸癌。含有下述的(a)以及(b)的引物對(duì)的、用于檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞的基因表達(dá)量的分析用引物組(a)引物對(duì)其是由至少含有序列號(hào)1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對(duì)其是由至少含有序列號(hào)2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15-50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。含有下述的(a)以及(b)的引物對(duì)的、用于檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞的基因表達(dá)量分析用試劑盒。(a)引物對(duì)其是由至少含有序列號(hào)1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子1部分的一部分的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對(duì)其是由至少含有序列號(hào)2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。該試刑盒中含有的引物對(duì)(a)以及(b)優(yōu)選引物對(duì)(a)是由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，引物對(duì)(b)是由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。該試劑盒還可以含有在一端添加了熒光物質(zhì)、另一端添加了消光物質(zhì)的序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。作為該試劑盒的檢測(cè)對(duì)象的上述細(xì)胞優(yōu)選是癌細(xì)胞。特別是該試劑盒可以作為癌診斷用試劑盒使用，還可以作為大腸癌診斷用試劑盒使用，特別是作為遺傳性非息肉性大腸癌診斷用試劑盒使用。發(fā)明的效果本發(fā)明的檢測(cè)方法即使針對(duì)僅僅含有少量癌細(xì)胞的生物試樣也能夠簡(jiǎn)便并且清楚地檢測(cè)hMLHl基因的表達(dá)狀態(tài)，能夠迅速并且簡(jiǎn)便地檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞(特別是、癌細(xì)胞)。圖l是表示hMLHl基因的3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體的外顯子結(jié)構(gòu)的圖。圖2是表示在6種癌細(xì)胞林中的hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1以及3的表達(dá)量的圖。黑色條型表示變體l、白色條型表示變體3。圖2的下半頁表示的是上半頁圖所示的各癌細(xì)胞林中變體1和變體3的表達(dá)量的比較結(jié)杲，將變體1的表達(dá)量比變體3的少表示為VI<V3，將變體1未能檢測(cè)到，僅僅檢測(cè)到變體3，表示為Vl(-)，V3(+)，將變體1的表達(dá)量比變體3多表示為VI>V3。此外，圖2的下半頁中，微衛(wèi)星不穗定性(MSI)的陽性為(+)，陰性為(-)，并且hMLHl基因的啟動(dòng)子區(qū)域中確認(rèn)有甲基化為(+)，未確認(rèn)有為(-)。序列表序列號(hào)6~8以及10~12是引物。序列號(hào)9是探針.具體實(shí)施方式下面詳細(xì)說明本發(fā)明。人MLH1基因(hMLHl基因)是大腸桿菌(E.coli)的DNA錯(cuò)配修復(fù)基因mutL的人等同物(相同體)。hMLHl基因作為識(shí)別在遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)中高頻性突然突變的基因座已經(jīng)為人所知。hMLHl基因的mRNA的RefSeq序列公開在GenBank登記號(hào)NM000249中，在本說明書中為了參照該序列，表示為序列號(hào)13。該hMLHl基因的mRNA的RefSeq序列(序列號(hào)13)中含有hMLHl基因中所含有的19個(gè)外顯子部分。在本發(fā)明中，作為hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體(variant;突變體)，除了與作為主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的上述RefSeq序列幾乎一致的變體1之外，發(fā)現(xiàn)還存在變體2以及變體3(圖1)。該變體1在其5'末端含有序列號(hào)1的堿基序列(外顯子l+2)，之后連接著hMLHl基因的外顯子3~19部分(與序列號(hào)13的第268~2524位堿基相當(dāng))。變體2具有與變體1幾乎相同的外顯子結(jié)構(gòu)，但在外顯子2部分(序列號(hào)5)的5'末端缺失5個(gè)堿基。另一方面，因?yàn)樽凅w3來自從變體1更后方的約300bp的轉(zhuǎn)錄啟點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄而得到的mRM前體，所以其5'末端含有和變體1不同的序列號(hào)2的堿基序列(外顯子l+2)，其后面連接有和變體1以及2共同的外顯子3~19部分。因?yàn)樽凅wl的外顯子l部分中含有翻譯啟始部位ATG，所以推測(cè)變體3編碼的蛋白質(zhì)與變體1編碼的蛋白質(zhì)至少在5'末端的氨基酸序列上不同，是作為不完整的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的或者根本不產(chǎn)生。本發(fā)明中還表現(xiàn)出了在大腸癌等的癌細(xì)胞、特別是顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞中，與上述的變體1的表達(dá)量相比較，變體3的表達(dá)量相對(duì)增加。因?yàn)轭A(yù)測(cè)在生物內(nèi)通常變體l的表達(dá)量最多，所以這樣的hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之間的表達(dá)重的比率的變化顯示生物試樣中的細(xì)胞中hMLHl基因的表達(dá)狀態(tài)的異常。所以由此認(rèn)為這種異常與細(xì)胞中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及癌變有關(guān)。本發(fā)明的方法是基于以上發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)分析方法，其特征在于，測(cè)定在生物試樣中的變體1(在5'末端含有序列號(hào)1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)、以及變體3(在5，末端含有序列號(hào)2所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)的表達(dá)量，通過將其進(jìn)行比較檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞。在本發(fā)明中，生物試樣可以是從人受試者回收到的任意的組織、細(xì)胞或者體液。這樣的生物試樣可以是例如皮膚、粘膜組織、消化道組織等，也可以是血液、淋巴液、唾液、精液等。更優(yōu)選的生物試樣特別是腫瘤、癌組織、或者癌變疑似組織。生物試樣也可以是建立品系的培養(yǎng)細(xì)胞。特別優(yōu)選的生物試樣是來自大腸癌的組織或者細(xì)胞、或者也可以大腸癌(并非是限定，例如、遺傳性非息肉性大腸癌)的疑似大腸組織或者細(xì)胞等。本發(fā)明中用語"轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"包含從某些基因轉(zhuǎn)錄得到的mRM前體、該邁RNA前體的修飾物(通過加帽結(jié)構(gòu)添加或者多聚腺苷酸化進(jìn)行量修飾的產(chǎn)物等)、成熟mRNA、以及從成熟RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，當(dāng)指的是RNA的情況下，為了指定該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而將各序列號(hào)等所示的堿基序列中的"T(胸腺嘧啶)"換成"U(尿嘧啶)"。本發(fā)明中"轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(變體)的表達(dá)量"指的是生物試樣中的由該基因表達(dá)得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在量。生物試樣中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1以及變體3的表達(dá)量的測(cè)定可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)公知的方法，對(duì)這樣的表達(dá)量的測(cè)定沒有限定，可以使用例如實(shí)時(shí)PCR法、半定量的RT-PCR法、使用毛細(xì)管電泳裝置的竟?fàn)幍腜CR法、使用DNA芯片或者微陣列的基因表達(dá)量測(cè)定法、Northern印記法等測(cè)定從生物試樣中制備得到的核酸試樣(例如RNA、cDM)中的各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在量。從生物試樣制備核酸試樣可以按照常規(guī)方法進(jìn)行，也可以在分析前進(jìn)行純化。本發(fā)明中實(shí)施的基因組DNA或RNA的制備可以按照J(rèn).Sambrooketal.(Eds.)，MolecularCloning,3nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,(2001)等的分子生物學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)書進(jìn)行。變體1以及變體3的表達(dá)量的測(cè)定只要能區(qū)分開不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)行定量，可以使用任何方法。本發(fā)明中分別檢測(cè)例如、變體1和變體3間具有很大差別的外顯子1部分，進(jìn)行定量的方法很方便。作為一個(gè)例子。對(duì)使用實(shí)時(shí)PCR法的表達(dá)量測(cè)定進(jìn)行詳細(xì)的說明。實(shí)時(shí)PCR法是實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，進(jìn)行解析的技術(shù)。通常使用熱循環(huán)儀和分光熒光光度計(jì)一體化的實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行。實(shí)時(shí)PCR和以往的PCR法相比，不需要進(jìn)行電泳，所以能夠迅速并且簡(jiǎn)便地解析，而且對(duì)DNA和RM的定量性優(yōu)良。通過實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行定量的原理如下所示。首先，將梯度稀釋的已知量的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)試樣，一邊進(jìn)行PCR，一邊進(jìn)行PCR產(chǎn)物量的監(jiān)測(cè)，讀取針對(duì)各稀釋樣在指數(shù)級(jí)擴(kuò)增區(qū)域達(dá)到的一定的擴(kuò)增產(chǎn)物量的循環(huán)數(shù)(thresholdcycle;Ct值)，將其作為橫軸坐標(biāo)，然后將標(biāo)準(zhǔn)試樣的初期模板量作為縱軸坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于含有未知濃度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的待測(cè)核酸試樣，一邊進(jìn)行和標(biāo)準(zhǔn)試樣相同的條件下的PCR反應(yīng)，一邊進(jìn)行監(jiān)測(cè)，求出達(dá)到與上述相同的擴(kuò)增產(chǎn)物量的循環(huán)數(shù)(Ct值)。待測(cè)核酸試樣得到的Ct值與上述制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，能夠算出待測(cè)核酸試樣中含有的初期模板量。這個(gè)初期模板量相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量。對(duì)實(shí)時(shí)PCR中的PCR產(chǎn)物量的監(jiān)測(cè)(檢測(cè))沒有限定，優(yōu)選能夠使用熒光物質(zhì)來進(jìn)行。作為這種熒光監(jiān)測(cè)法沒有限定，可以使用例如intercalater、TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法等公知的技術(shù)。intercalater法是通過將與雙鏈DNA結(jié)合的發(fā)出熒光的物質(zhì)(intercalater法)SYBR(注冊(cè)商標(biāo))GreenI添加到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)系中的方法。在該方法中，intercalater結(jié)合到PCR反應(yīng)合成的雙鏈DNA上，經(jīng)過激發(fā)光的照射發(fā)出熒光，通過測(cè)定其熒光強(qiáng)度，能夠監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量。這種intercalater法，不需要制備用于任意的雙鏈DNA檢測(cè)的針對(duì)每個(gè)基因的檢測(cè)用探針，試驗(yàn)成本低廉，反應(yīng)體系構(gòu)建也很容易，不過檢測(cè)特異性不那么高。而另外一方面，TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法是通常用將熒光物質(zhì)(FAM等)標(biāo)記了5'末端，消光物質(zhì)(TAMRA等)標(biāo)記(添加)了3'末端的寡核苷酸探針(TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針)添加到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)系的方法。這種方法中，TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針在退火步稞與模板DNA特異性地雜交，此時(shí)，因?yàn)樵谔结樕瞎泊嬗袩晒馕镔|(zhì)和消光物質(zhì)，所以，即使激發(fā)光照射熒光物質(zhì)，也能抑制熒光的發(fā)生。不過在后續(xù)的延伸步驟中，通過TaqDNA聚合酶具有的5'—3'核酸外切酶活性將與模板雜交的TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針依次分解，將熒光物質(zhì)從探針上釋放,解除了消光物質(zhì)的抑制，發(fā)出熒光。通過測(cè)定該熒光強(qiáng)度能夠監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量。這種TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法試驗(yàn)成本高，不過，檢測(cè)特異悻高，定量性也特別優(yōu)良。在本發(fā)明的方法中，為了測(cè)定各變體的表達(dá)量，可以適當(dāng)選用基于上述的實(shí)時(shí)PCR法的定量法。這種情況下，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)沒有限定，可以適當(dāng)使用TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法。在TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法中，使用在多聚核苷酸的一端添加(一般在5'末端)熒光物質(zhì)，另一端(一般在3'末端)添加消光物質(zhì)的TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針。這種探針是設(shè)計(jì)用于在實(shí)時(shí)PCR中生成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物退火的。作為添加到這種探針上的熒光物質(zhì)可以使用FAM、VIC，作為消光物質(zhì)可以使用TAMRA等。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以適當(dāng)加以設(shè)定，也可以參照后述的實(shí)施例中記栽的反應(yīng)條件。在本發(fā)明的方法中，為了各變體的表達(dá)量的測(cè)定，分別使用用于變體1的特異性PCR擴(kuò)增的下述引物對(duì)(a)、和用于變體3特異性PCR擴(kuò)增的下述引物對(duì)(b)，能夠擴(kuò)增各變體。(a)引物對(duì)由至少含有序列號(hào)1所示的堿基序列上的、1~204位的外顯子1部分的一部分(優(yōu)選10個(gè)堿基以上長(zhǎng)度、例如、10~30個(gè)堿基長(zhǎng)度)的連續(xù)15~50個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對(duì)由至少含有序列號(hào)2所示的堿基序列上的、1~91位的外顯子l部分的一部分(例如、10~30個(gè)堿基長(zhǎng)度)的連續(xù)15~50個(gè)堿基的械基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。這些引物對(duì)(a)以及(b)之中，優(yōu)選的具體例如下所述。引物對(duì)(a):由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合、引物對(duì)(b):由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。使用由這些序列號(hào)6~8的序列構(gòu)成的引物的組合，基于TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針法，通過實(shí)時(shí)RNA測(cè)定上述變體1以及3的表達(dá)量的情況下，作為TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針，特別優(yōu)選由一端添加(一般在5'末端)了熒光物質(zhì)、另一端添加(一般在3'末端)了消光物質(zhì)的序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。使用這些引物以及探針進(jìn)行變體的表達(dá)量測(cè)定，例如、通過含有下述步驟進(jìn)行'使用序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物，由來自生物試樣的cDNA進(jìn)行變體1的擴(kuò)增反應(yīng)的步驟、使用序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物，由來自生物試樣的cDNA進(jìn)行變體3的擴(kuò)增反應(yīng)的步槺、'監(jiān)測(cè)各個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量，由此計(jì)算出生物試樣中的變體1和變體3的初期含有重的步驟。并且，在該監(jiān)測(cè)步驟中通過向各個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)系中添加TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針，能夠從得到的熒光強(qiáng)度測(cè)定出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量。在本發(fā)明的方法中，進(jìn)行如上所述的變體1以及變體3的表達(dá)量的測(cè)定后，通過將其進(jìn)行比較，能夠檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞。具體而言，比較變體1和變體3，當(dāng)與變體1的表達(dá)量的測(cè)定值相比，變體3的表達(dá)量的測(cè)定值高的情況下，表示所研究的生物試樣中含有顯示微衛(wèi)星不穗定性細(xì)胞的可能性高。并且如果檢測(cè)不到變體l，僅僅檢測(cè)到變體3的情況下，由于變體3的表達(dá)量為多，也能判斷含有顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞。這樣，在本發(fā)明的方法中，能夠針對(duì)來自受試者回收的生物試樣進(jìn)行顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞的存在的檢測(cè)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是基因組上的2~5個(gè)堿基的重復(fù)單位(微衛(wèi)星)的重復(fù)數(shù)異常少的現(xiàn)象。高度的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在全部大腸癌中有12~16%、在遣傳性非息肉性大腸癌中有90%以上。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性實(shí)際上在子宮癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系統(tǒng)腫瘤、扁平上皮癌等各種癌中被觀測(cè)到，與癌的相關(guān)性強(qiáng)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是由于DNA修復(fù)機(jī)制的缺陷造成的，所以推測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的情況具有癌多發(fā)傾向性和預(yù)后不良。所以通過本發(fā)明的方法檢測(cè)到顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞的情況下，可以判斷該細(xì)胞是癌細(xì)胞的可能性高。這樣檢測(cè)的顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞可以是癌細(xì)胞，具體的而言，例如大腸癌、遣傳性非息肉性大腸癌、子宮癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系統(tǒng)腫瘤、扁平上皮癌、子宮內(nèi)膜癌、胰癌，優(yōu)選大腸癌，特別是遺傳性非息肉性大煬癌。這樣以來本發(fā)明涉及測(cè)定生物試樣中hMLHl基因的變體1和變體3的表達(dá)量，通過將其進(jìn)行比較，進(jìn)行癌細(xì)胞的檢測(cè)的方法。此外，本發(fā)明涉及在上述方法中優(yōu)選使用的含有引物對(duì)(a)、(b)的引物組，即，該引物組是用于檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞的基因表達(dá)量分析用的、下述(a)以及(b)所示的各引物的組合。(a)引物對(duì)由至少含有序列號(hào)1所示的堿基序列上的、1~204位的外顯子1部分的一部分(例如、10~30個(gè)堿基長(zhǎng)度)的連續(xù)15~50個(gè)堿基的械基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合、以及(b)引物對(duì)由至少含有序列號(hào)2所示的堿基序列上的、1~91位的外顯子1部分的一部分的(例如、10~30個(gè)堿基長(zhǎng)度)的連續(xù)15~50個(gè)械基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號(hào)5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。作為這些引物組的具體例子，可以列舉:含有序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號(hào)8所示的械基序列構(gòu)成的引物的組合。這些引物可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的寡核苷酸合成技術(shù)或者以序列號(hào)1或者2等上述hMLHl基因變體1以及3內(nèi)的序列作為模板通過PCR法等容易地進(jìn)行制備。并且本發(fā)明中的"引物"只要能用于PCR等中，可以標(biāo)記適合檢測(cè)用的標(biāo)記就行。例如，本發(fā)明涉及的引物可以是在5'末端或者y末端添加了熒光色素、酶、蛋白質(zhì)、放射性同位體、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素等的標(biāo)記的多聚核苷酸。在本發(fā)明中，通過向多聚核苷酸添加而用于檢測(cè)用等的寡核苷酸(例如、用于突變檢測(cè)的invader法中的與模板無關(guān)的序列"flap"等)也包含在"標(biāo)記"中。此夕卜，本發(fā)明涉及含有上迷引物對(duì)(a)以及(b)的、用于檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穗定性的細(xì)胞的基因表達(dá)量分析用試劑盒。該試劑盒中還可以含有一端添加了熒光物質(zhì)、另一端添加了消光物質(zhì)的序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的探針的TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針。該試劑盒的檢測(cè)對(duì)象優(yōu)選是癌細(xì)胞，特別是可以用于顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的癌細(xì)胞的檢測(cè)用。所以，本試刑盒可以用作癌診斷用試劑盒。此外，本試劑盒可以用作大腸癌診斷用試刑盒、特別是遺傳性非息肉性大腸癌診斷用試劑盒。實(shí)施例下面使用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步具體地加以說明。不過，本發(fā)明的技術(shù)的范圍不局限于這些實(shí)施例中。[實(shí)施例1]hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體的探索本發(fā)明人等為了研究hMLHl基因通過利用選擇性剪切或者選擇性啟動(dòng)子而作為多個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體(突變體)進(jìn)行表達(dá)的可能性，進(jìn)行了下述試驗(yàn)，如非專利文獻(xiàn)2所記栽的基于使用寡核苷酸帽法構(gòu)建的cDNA文庫(SuzukiandSugano(2003)MethodsMol.Biol.221:p.73-91)得到人基因完全長(zhǎng)cDNA，闡明含有5'末端的人完全長(zhǎng)cDM的堿基序列信息有大約1800000種。這些序列信息登記于GenBank中，一般都是公開的.本發(fā)明人等從GenBank收集這些序列信息，進(jìn)行multi-FASTA-format化，針對(duì)這樣得到的序列數(shù)據(jù)，將hMLHlmRNA的RefSeq序列(NCBIReferenceSequence)(GenBank登記號(hào)NM_000249;序列號(hào)13)作為query序列，用blastn程序進(jìn)行同源性檢索，將選中的序列中的E-value在101。以下的序列作為hMLHl相關(guān)cDNA序列。然后提取GenBank的人基因組序列數(shù)據(jù)的Build35的3號(hào)染色體中與hMLHl基因相當(dāng)?shù)膮^(qū)域的堿基序列，將該hMLHl基因的基因組序列和上述那樣選擇出的每個(gè)hMLHl相關(guān)cDM序列用BLAST程序的bUseq進(jìn)行處理，得到分別比對(duì)的結(jié)果。從這樣得到的hMLHl基因組序列與各hMLHl相關(guān)cDM序列的比對(duì)中，選擇出被認(rèn)為能與上迷的hMLHlRefSeq序列上的2位的外顯子部分(畫—000249的第177~267位堿基序列)更靠前面的區(qū)域內(nèi)也能很好地比對(duì)(alignment)的部分，并且比對(duì)部分中一致率達(dá)到98%以上的基因。解析選擇的比對(duì)序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)hMLHl相關(guān)cDNA序列和hMLHl基因組序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系有3種模式。即，判斷在hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在至少3種變體(變體1~3)。這3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'末端側(cè)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。在圖1中僅僅表示了各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中所舍的19個(gè)外顯子區(qū)域中的最初的3個(gè)。如圖1所示，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體1從5'末端側(cè)開始依次連接著外顯子1部分、外顯子2部分、外顯子3部分，在外顯子1部分中含有翻譯啟始部位(ATG)。通過該解析可知作為hMLHl基因的RefSeq序列的NM000249堿基序列，在該變體1的外顯子l部分的5'末端存在少量的缺失。與此相對(duì)，變體2具有和變體1幾乎相同的外顯子結(jié)構(gòu)，不過外顯子2部分和變體1的外顯子2部分相比，在5'側(cè)短了5個(gè)堿基，是選擇性剪切變體，此外，在變體3中，外顯子2部分以及外顯子3部分與變體1相同，不過，外顯子1部分是與變體1以及2不完全相同的序列。由此可知hMLHl基因通過選擇性啟動(dòng)子受到控制，變體3的結(jié)果是在比變體1靠近后面約325bp的轉(zhuǎn)錄啟點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過剪切后生成的。在上迷解析中表現(xiàn)出，在所選擇的hMLHl相關(guān)cDNA序列中，變體1是141個(gè)(75%)、變體2是14個(gè)(7.4%)、變體3是33個(gè)(17.6%)，變體1是最主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。分類為各變體的hMLHl相關(guān)cDNA序列表示在表1中。表1中，各hMLHl相關(guān)cDM序列如GenBank登記號(hào)所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)的變體1以及3的外顯子1~2部分的堿基序列如表2所示，表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[實(shí)施例2]通過實(shí)施例1的解析可知作為hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在3種的變體。雖然到目前為止已知hMLHl基因是細(xì)胞癌變相關(guān)的基因，不過這次為首次闡明存在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體，推測(cè)這些變體和癌之間具有相關(guān)性。所以然后著眼于變體1以及3，通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)定其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量，將癌細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行比較。作為待測(cè)材料，從ATCC(AmericanTypeCultureCollection)以及財(cái)團(tuán)法人人類科學(xué)振興財(cái)團(tuán)研究資源銀行購(gòu)買的培養(yǎng)細(xì)胞林LoVo、COLO320、C0L0201、SW48、RKO、HCT116(全部是來自人大腸癌細(xì)胞)。將各細(xì)胞在添加了10%FBS(Invitrogen公司)的AdvancedDMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中培養(yǎng)。從培養(yǎng)后的細(xì)胞中使用QIAGEN公司的RNeasyTissueKit提取總RNA。將提取的總RNA在后述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及實(shí)時(shí)PCR中作為待測(cè)試樣使用。此外，設(shè)計(jì)在實(shí)時(shí)PCR中使用的引物以及探針。引物以及探針的設(shè)計(jì)可以使用實(shí)時(shí)PCR儀ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems公司)附帶的PrimerExpress軟件進(jìn)行。從輸入各種條件得到的引物以及探針的檢索結(jié)果中選擇出分值高的最前面的IO組，用這些進(jìn)行實(shí)際的實(shí)時(shí)PCR來進(jìn)行評(píng)價(jià)的時(shí)候，因?yàn)槎嫉玫胶芎玫慕Y(jié)果，所以使用最高分值的引物以及探針的組合進(jìn)行下述的試驗(yàn)。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成反應(yīng))中使用SuperscriptIIIReverseTranscripUse(Invitrogen公司)。首先向管中加入2.Ojil的寡聚(dT)2。引物(50fiM)、2.Ojig的總RNA、4.Ojil的dNTPs(5mM)，加入DEPC處理水，使總量達(dá)到26jil。然后將該混合物在65"C下溫育5分鐘后，迅速移到冰上，加入5xFirstStrandBuffer(8.Opl)、0.1MDTT(2.0|il)、Superscript"IIIReverseTranscriptase(2.Ojil)、DEPC處理水(2.Ojil)，使總量達(dá)到40pl。將其用渦旋器混合后，進(jìn)行離心，將溶液收集到管子的底部，在50t:溫育60分鐘。然后，通過在？ox:溫育15分鐘終止反應(yīng)。然后，用上述得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems社)，通過實(shí)時(shí)PCR，嘗試對(duì)來自各細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中含有的變體l、變體3分別進(jìn)行定量。為了進(jìn)行變體1的PCR擴(kuò)增，混合作為模板DNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物l.Opl、lxmaster-混合物lOjil、5.OjiM正義引物(5'-CAGCGGCCAGCTAATGCTAT-3';序列號(hào)6)3.5pl、5.OjiM反義引物(5'-CCATTGTCTTGATCTGAATCAACTTC-3';序列號(hào)7)3.5pl、5.OjiMTaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針(5'-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3';序列號(hào)9)5.Opl、超純水1.Ojil，制備總量為20>il的反應(yīng)液。為了變體3的PCR擴(kuò)增用，同樣地，混合作為棋板DM的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物l.Ojil、"master-混合物lOjil、5.OnM正義引物(5'-GGGTTGTTTGGAGTTTTAGATGCA-3';序列號(hào)8)3.5pl、5.OjiM反義引物(5'-CCATTGTCTTGGATCTGAATCAACTTC-3';序列號(hào)7)3.5|il、5.0jiMTaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針(5'-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3。序列號(hào)9)5.0jU、超純水l.Onl,制備總量為20jil的反應(yīng)液。此處使用的TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針是能夠在變體1以及3共同檢測(cè)中使用的探針，是由AppliedBiosystemsJapan株式會(huì)社制備的在5'末端標(biāo)記FAM(熒光物質(zhì))、在3'末端標(biāo)記TAMRA(消光物質(zhì))的形態(tài)的探針。制備的反應(yīng)液供給ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems公司)，在95C反應(yīng)IO分鐘后，在95X:下15秒，以及在60t:下l分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，然后測(cè)定熒光強(qiáng)度，還有，為了制作可以從實(shí)時(shí)PCR中測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度計(jì)算出試樣中的DNA量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR前，由來自COLO320細(xì)胞株的上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如下所述那樣預(yù)先制備PCR產(chǎn)物。首先，為了變體1的PCR擴(kuò)增用，混合作為模板DNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0jil、10xPCR緩沖液5.Ojil、dNTP混合物(各2.5mM)4.Opl、5.OjiM正義引物(5'-CTGGACGAGACAGTGGTGAAC-3';序列號(hào)10)3.5pl、5.OjiM反義引物(5'-ATACTGGCTAAATCCTCAAAGGACTG-3';序列號(hào)11)3.5pl、ExTaq聚合酶0.25|il、超純水37nl，制備得到總量為50pl的反應(yīng)液。為了變體3的PCR擴(kuò)增用，除了變更正義引物為序列號(hào)12(5/-TTTCTTTACCGCTCTCCCCCG-3')所示的序列之外，按照與上述變體1的PCR擴(kuò)增用相同的組成制備反應(yīng)液。制備的各反應(yīng)液在951C下反應(yīng)IO分鐘后，在95匸下30秒、在63匸下1分鐘、在72匸下1分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在721C反應(yīng)IO分鐘。對(duì)于這樣得到的來自COLO320細(xì)胞林的PCR產(chǎn)物測(cè)定DNA量后，進(jìn)行梯度稀釋，將其作為模板DNA與在上述的實(shí)時(shí)PCR中其他的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一樣地進(jìn)行擴(kuò)增。并且，進(jìn)行與上述相同的熒光強(qiáng)度的測(cè)定，根據(jù)得到的值，按照常規(guī)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)由上述測(cè)定的熒光強(qiáng)度得到的Ct(ThresholdCycle)值、和上述制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出從各細(xì)胞提取到的總RNA中含有的初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的變體1以及3的量。該各變體量的測(cè)定值即相當(dāng)于各自的表達(dá)量.以上那樣定量的6種大脈癌培養(yǎng)細(xì)胞中的變體1以及3的表達(dá)量結(jié)果如圖2所示.如圖2所示，對(duì)于變體1，在LoVo、HCT116、C0腦0、以及C0L0201細(xì)胞中檢測(cè)到了表達(dá)，在RKO以及SW48細(xì)胞中未檢測(cè)到表達(dá)(檢測(cè)限以下)。這些結(jié)果和目前的報(bào)道(非專利文獻(xiàn)5)是一致的。另一方面，本發(fā)明人等首次闡明的變體3的表達(dá)模式和變體1的表達(dá)模式是明顯不同的，在目前的報(bào)道未檢測(cè)到hMLHl的變體1的表達(dá)的RK0細(xì)胞和SW48細(xì)胞中檢測(cè)到了變體3的表達(dá)。此外，變體3在LoVo細(xì)胞以及HCT116細(xì)胞中，與變體l相比，表達(dá)量顯著多。該結(jié)果與在實(shí)施例1的解析中變體1是hMLHl基因的主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，變體3的表達(dá)量少的預(yù)測(cè)相反。速樣，變體3比變體1多表達(dá)的LoVo以及HCT116細(xì)胞、以及檢測(cè)到變體3但是檢測(cè)不到變體1的RK0細(xì)胞以及SW48細(xì)胞在使用文獻(xiàn)信息進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)呈現(xiàn)陽性(圖2、非專利文獻(xiàn)5)。此外，根據(jù)非專利文獻(xiàn)5的記栽研究左右hMLHl基因的表達(dá)量、同基因的啟動(dòng)子區(qū)域的曱基化程度的時(shí)候，只有檢測(cè)到變體3但未檢測(cè)到變體l的RK0細(xì)胞以及SW48細(xì)胞在hMLHl基因的啟動(dòng)子區(qū)域中檢測(cè)到了甲基化。即可以認(rèn)為hMLHl基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化抑制變體l的表達(dá)，不抑制變體3的表達(dá)。如果考慮到已知hMLHl基因與遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)相在內(nèi)的各種癌中高頻率地出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性陽性，可以認(rèn)為相對(duì)于hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體l，變體3的表達(dá)量的相對(duì)增加，和癌中MSI陽性以及啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化有關(guān)。對(duì)于變體3的表達(dá)條件和其表達(dá)所影響的癌癥發(fā)病的具體作用并不清楚。認(rèn)為與其說是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體3自體的MSI，進(jìn)一步對(duì)癌發(fā)病帶來惡劣影響，不如說變體1的表達(dá)量的低下或者喪失可能是造成誘發(fā)MSI的重要原因。不過，不論如何對(duì)這些機(jī)制進(jìn)行推測(cè)，可以明確與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1相比較，變體3的量的表現(xiàn)相對(duì)增加的情況表示存在伴隨MSI的癌細(xì)胞。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠在很早期的癌檢測(cè)樣本等中，簡(jiǎn)便并且清楚地檢測(cè)到大煬癌等的癌細(xì)胞的存在。本方法得到的檢測(cè)結(jié)果在以HNPCC代表的伴隨微衛(wèi)星不穗定性的癌癥的早期診斷中可以作為有用的判斷材料。序列表<110>日立公司<120〉微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細(xì)胞的檢測(cè)方法以及試劑盒<130〉H600399<160〉14<歸PatentlnVer.2.1<210>1<211〉295<212>DNA<213〉智人(Homosapiens)<220><223>發(fā)明人高橋亮介；永井啟一<400>1幼gaacgtgagcacgaggcactgaggtgattggctg幼ggcacttccgttgagcatctag60acgtttccttggctcttctggcgccaaaatgtcgttcgtggcaggggttattcggcggct120ggacgagacagtggtg咖cgcatxgcggcgggggaagttatccagcggccagctaatgc180tatcaaagagsttgattgaLgaactgtttagatgcaaaatccacaagtattcaagtgattgt240taaagagggaggcctgaagttgattC3gatccaagacaatggcaccgggsitc鄉(xiāng)295〈210〉2〈211>213<212〉DNA<213>智人<400>2gcatgcccacaacggcggaggccgccgggtttccgcagaccgtgtgtttctttaccgctcgttttagatgcaaaatccacaagtattcaaattcagatccaagacaatggcaccgggatctccctgacgtgccagtcaggccttctcctt60tcccccgagaccttttaagggttgtttgga120gtgattgttaaagagggaggcctgaagttg180agg213<210>3<211>204〈212>DNA<213>智人<400〉3aagaacgtgagcacgaggcactgaggtgatacgtttccttggctcttctggcgccaaaatggacgagacagtggtgaaccgcatcgcggctatc幼卿gatg3ttg3gssctgtggctgaaggcacttccgttgagcatctag60gtcgttcgtggc鄉(xiāng)ggttattcggcggct120gggggaagttatccagcggccagctaatgc180204<210>4〈211>122<212>醒<213>智人<400〉4gcatgcccacaacggcggaggccgccgggttccctgacgtgccagtcaggccttctcctt60ttccgcagaccgtgtgtUcUtaccgctctcccccg柳ccttUaagggttgtttgga120gt122<210>5<211〉91<212>DNA<213>智人<400〉5tttagatgcaaaatccacaagtattcaagtgattgUaaagagggaggcctg肌gttgat60tcagatccaagacaatggcaccgggatcagg91<210>6<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物<6cagcggccagctaatgctat<210〉7<211>26<212>腿<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物<400>7ccattgtcttgatctgaatcaacttc26<210〉8<211〉24<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述引物<400>8gggttgtttggsgttUagatgca24<210>9<211>33<212>腿〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針<400>9caagtattcaagtgattgttaaagagggaggcc33<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物■>10ctggacgagacagtggtgaac21<210>11<211>26<212〉DNA〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物■>11atactggctaaatcctcaaaggactg26<210>12<211>21<212>腿<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物〈400>12tttctttaccgctctcccccg21〈210>13<211>2524〈212>腿<213>智人<220><221>CDS<222>(61)..(2331)<柳>13attggctgaaggcacttccgttgagcatctagacgtttccttggctcttctggcgccaaa60atgtcgttcgtggcaggggttatteggeggMetSerPheValAlaGlyVallieArgArg1510ctggacgagacagtggtg108LeuAspGluThrValVal15aaccgcategcggcgggggaagttatecagAsnArglieAlaAlaGlyGluVallieGin2025eggccagetaatgetate156ArgProAlaAsnAlalie30aaagagatgattgagaactgtttagatgcaaaatecacaagtattcaa204LysGluMetlieGluAsnCysLeuAspAlaLysSerThrSerlieGin354045gtgattgttaaagagggaggcctgaagUgattcagatecaagacaat252VallieValLysGluGlyGlyLeuLysLeulieGinlieGinAspAsn505560ggcsecggg3tcagg咖g幼gatctggstattgtstgtgasaggttc300GlyThrGlylieArgLysGluAspLeuAsplieValCysGluArgPhe65707580actactagtaaact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在5′末端含有序列號(hào)1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、以及在5′末端含有序列號(hào)2所示的堿基序列的人MLH1基因的測(cè)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量，將其進(jìn)行比較，檢測(cè)顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細(xì)胞。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101130819SQ20071008509公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年2月28日優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日發(fā)明者永井啟一,高橋亮介申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所