基于pdms的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括模型體，在模型體內(nèi)側(cè)設(shè)有左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池，在左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池之間設(shè)有隔層，在隔層上設(shè)有連通左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池的開口，在左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池內(nèi)均配有與所述隔層的側(cè)面相貼合的擋塊。本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，可建立兩種細(xì)胞在同一平面的三維共培養(yǎng)體系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)觀察，可以進(jìn)行細(xì)胞遷移、趨化、侵襲以及成管實(shí)驗(yàn)，便于在原位或收集細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，并且克服了垂直共培養(yǎng)無法排除重力干擾的缺陷，可以反復(fù)使用并具有簡單易行、重復(fù)性好、廉價(jià)安全等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)模型，特別是一種基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型。
【背景技術(shù)】
[0002]體外細(xì)胞共培養(yǎng)(co-culture)是將兩種細(xì)胞(可以來自同一種組織，也可以來自不同的組織)混合共同培養(yǎng)，從而使其中一種細(xì)胞的形態(tài)和功能穩(wěn)定表達(dá)，并維持較長時(shí)間。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)能模擬體內(nèi)生成的微環(huán)境，便于更好的觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機(jī)制和可能作用的靶點(diǎn)，填補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)和整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的鴻溝。
[0003]該技術(shù)能夠主要涉及以下幾方面的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用:1.細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸作用，引起胞質(zhì)膜的直接接觸并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)ECM，其含有間質(zhì)膠原、纖連蛋白、蛋白多糖及層粘連蛋白等成分，從而模擬了與體內(nèi)相似的微環(huán)境，維持細(xì)胞的立體構(gòu)形及促進(jìn)細(xì)胞的功能。2.細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，觀察細(xì)胞共培養(yǎng)后其功能、性狀和生長行為的變化，如某一細(xì)胞的分泌物對(duì)另外一種細(xì)胞基因表達(dá)的影響，細(xì)胞與細(xì)胞之間的“對(duì)話”等。3.研究藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能的影響及相關(guān)機(jī)制，為新藥研發(fā)提供重要技術(shù)支持。
[0004]目前常見的細(xì)胞共培養(yǎng)方法可以大致分為直接接觸式共培養(yǎng)和非直接接觸式共培養(yǎng)。直接接觸式共培養(yǎng)是指在適宜條件下，將兩種及兩種以上細(xì)胞按照一定比例接種于同一培養(yǎng)皿中共同培養(yǎng)，使兩種細(xì)胞直接接觸，并通過旁分泌、自分泌作用產(chǎn)生細(xì)胞因子等進(jìn)行相互作用。其缺點(diǎn)是兩種細(xì)胞分離較困難，不便于觀察和后續(xù)檢測。非直接接觸式共培養(yǎng)是指將兩種及兩種以上細(xì)胞分別接種于不同的載體上，然后將這些載體置于同一個(gè)培養(yǎng)環(huán)境之中，不同種細(xì)胞間不存在直接接觸。由于兩種細(xì)胞容易分離，便于觀察和不影響后續(xù)的檢測，主要包括以下幾種技術(shù)方法:1.用一種細(xì)胞的培養(yǎng)上清液(含有不同生長因子)與另外一種細(xì)胞共培養(yǎng)。其操作簡單，但無法動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的變化。2.將接種一種細(xì)胞的玻片放入培養(yǎng)另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng)。此方法操作簡單，但是不能動(dòng)態(tài)觀測細(xì)胞間的相互作用和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。3.將兩種細(xì)胞先后接種于同一培養(yǎng)皿中垂直共培養(yǎng)，中間以基質(zhì)膠或聚碳酸酯膜分隔的夾心式共培養(yǎng)法。4.Transwell共培養(yǎng)法:應(yīng)用一類有通透性的杯狀裝置，杯子底部覆有具通透性的膜聚碳酸酯膜(孔徑大小有0.1-12.0um)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，細(xì)胞A種在上室內(nèi)，下層培養(yǎng)板中接種細(xì)胞B并且其培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。以上兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以模擬體內(nèi)環(huán)境中細(xì)胞的生長結(jié)構(gòu)層次關(guān)系，但是其垂直結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的檢測無法排除重力干擾也不利于進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測。5.基于微流控芯片的細(xì)胞共培養(yǎng):根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同需要設(shè)計(jì)特殊結(jié)構(gòu)的微流控芯片，使兩種細(xì)胞可以在同一芯片的不同培養(yǎng)池中進(jìn)行共培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，規(guī)模化，節(jié)省樣品用量等，也可以排除重力干擾因素，但不利于收集細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。
[0005]相對(duì)于傳統(tǒng)的二維化單層細(xì)胞培養(yǎng)而言，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three dimensionalcell culture, TDCC)是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成三維的細(xì)胞載體復(fù)合物。三維細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞培植在一定的細(xì)胞外基質(zhì)中，細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellularmatrix, ECM)蛋白充當(dāng)生長支架,使得細(xì)胞能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu)，以此創(chuàng)建的細(xì)胞生長環(huán)境可以最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境。目前細(xì)胞三維培養(yǎng)應(yīng)用的生物材料主要包括:人工軟骨、PET聚乙烯酯、纖維蛋白支架、膠原支架、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、微膠囊和中空纖維等。
[0006]雖然目前有很多不同的細(xì)胞共培養(yǎng)方法和細(xì)胞三維培養(yǎng)方法被廣泛應(yīng)用，但是均受到技術(shù)問題所限，存在各自的缺點(diǎn)和不足，無法同時(shí)滿足細(xì)胞在水平方向進(jìn)行共培養(yǎng)、動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的相互作用和細(xì)胞三維生長和運(yùn)動(dòng)變化、收集足量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)檢測等幾方面的實(shí)驗(yàn)需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本實(shí)用新型的目的是提供一種結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉、具有兩個(gè)分隔細(xì)胞培養(yǎng)池、便于三維動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞間相互作用產(chǎn)生的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)變化、有利于收集細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0008]本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括模型體，在模型體內(nèi)側(cè)設(shè)有左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池，在左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池之間設(shè)有隔層，在隔層上設(shè)有連通左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池的開口，在左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池內(nèi)均配有與所述隔層的側(cè)面相貼合的擋塊。
[0009]本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其中所述的開口在寬度方向上呈下寬上窄形狀；所述的左培養(yǎng)池和右培養(yǎng)池相對(duì)于隔層對(duì)稱設(shè)置。
[0010]本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其中所述的模型體和隔層的高度為8 — 12mm ;所述的開口位于隔層的中間位置，開口的下寬為2.5—3.5 mm，上寬為1.5—
2.5 mmD
[0011]本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，可建立兩種細(xì)胞在同一平面的三維共培養(yǎng)體系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)觀察，可以進(jìn)行細(xì)胞遷移、趨化、侵襲以及成管實(shí)驗(yàn)，便于在原位或收集細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，并且克服了垂直共培養(yǎng)無法排除重力干擾的缺陷，可以反復(fù)使用并具有簡單易行、重復(fù)性好、廉價(jià)安全等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本實(shí)用新型【具體實(shí)施方式】的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0013]圖2是圖1所示的俯視示意圖；
[0014]圖3是圖1所示的A-A剖視示意圖；
[0015]圖4是圖2所示的在培養(yǎng)池中加入擋塊后的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016]圖5是制作本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型的模具結(jié)構(gòu)示意圖；
[0017]圖6是圖5所示的俯視示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]如圖1、2、3、4所示:1為模型體，呈回轉(zhuǎn)體形狀，在模型體I內(nèi)側(cè)有兩個(gè)培養(yǎng)池，即左培養(yǎng)池3和右培養(yǎng)池4。在左培養(yǎng)池3和右培養(yǎng)池4之間設(shè)有與模型體I成一體結(jié)構(gòu)的隔層2，在隔層2上設(shè)有連通左培養(yǎng)池3和右培養(yǎng)池4的開口 8。開口 8位于隔層2的中間位置，即左培養(yǎng)池3和右培養(yǎng)池4相對(duì)于隔層2對(duì)稱設(shè)置。在左培養(yǎng)池3和右培養(yǎng)池4內(nèi)各配有一個(gè)與隔層2的側(cè)面相貼合的擋塊7，當(dāng)兩個(gè)擋塊7靠合在隔層2上時(shí)，在開口 8處形成了一個(gè)空隙。上述開口 8在寬度方向上可呈下寬上窄形狀。開口 8的下寬6為3 mm，即在2.5 — 3.5 mm之間均可，上寬5為2 mm，即在1.5 — 2.5 mm之間均可。模型體I和隔層2的高度為10 mm ,即在8—12mm之間均可。
[0019]本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制作過程如下:
[0020]模型體I的材料為SYLGARD 184硅橡膠，該硅橡膠是由液體組分組成的雙組分套件產(chǎn)品，包括基本組分與固化劑?；窘M分與固化劑按10:1質(zhì)量比完全混合，中等粘度混合液的稠度與SAE 40機(jī)油相似。
[0021]如圖5、6所示:10為模具體，有模具體內(nèi)腔11，在模具體內(nèi)腔11的內(nèi)部放置有對(duì)稱的呈半圓狀的右內(nèi)模12和左內(nèi)膜15，右內(nèi)膜12內(nèi)部有右內(nèi)膜腔13，左內(nèi)膜15內(nèi)部有左內(nèi)膜腔14。右內(nèi)模12和左內(nèi)膜15之間有間隙。模具體10、右內(nèi)模12和左內(nèi)膜15均為不銹鋼材料。模具體內(nèi)腔11的深度、右內(nèi)模12和左內(nèi)膜15的深度均為10 mm，即在8 — 12mm之間均可。
[0022]將上述完全混合的物料倒入模具體內(nèi)腔11、右內(nèi)模腔13和左內(nèi)膜腔14中，在80°C下烘烤固化2小時(shí)，形成本實(shí)用新型的PDMS模型。
[0023]待冷卻后，將固化的PDMS模型從模具體10中剝離，拆除嵌入其中的右內(nèi)模12和左內(nèi)膜15，并將右內(nèi)膜腔13和左內(nèi)膜腔14內(nèi)形成的半圓形固化物取出，最后形成一個(gè)環(huán)形的有兩個(gè)培養(yǎng)池且兩個(gè)培養(yǎng)池中間有隔層2的PDMS模型體I和兩個(gè)半圓形的PDMS模塊。
[0024]將模型體I中間的隔層2取中點(diǎn)截?cái)?，修剪出上述的開口 8。
[0025]將兩個(gè)半圓形PDMS模塊切割成適當(dāng)大小的長方體模塊形成兩個(gè)擋塊7。
[0026]本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，可建立兩種細(xì)胞在同一平面的三維共培養(yǎng)體系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)觀察，可以進(jìn)行細(xì)胞遷移、趨化、侵襲以及成管實(shí)驗(yàn)，便于在原位或收集細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，并且克服了垂直共培養(yǎng)無法排除重力干擾的缺陷，可以反復(fù)使用并具有簡單易行、重復(fù)性好、廉價(jià)安全等優(yōu)點(diǎn)。
[0027]本實(shí)用新型的模型的使用:使用前將上述模型進(jìn)行高壓滅菌和紫外線照射滅菌。
[0028]實(shí)驗(yàn)例1:基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型應(yīng)用于兩種細(xì)胞水平方向共培養(yǎng)及觀察二者的相互作用。
[0029]將本模型體I置入6孔板內(nèi)并壓緊使其底部緊貼6孔板底，將兩個(gè)長方體狀的擋塊7分別緊貼在隔層2的開口 8的兩側(cè)，使其形成一處空隙，將20ul基質(zhì)膠(美國BD公司)注入空隙，37°C孵育I小時(shí)使其凝固，待基質(zhì)膠凝固后取出兩側(cè)的長方體狀的擋塊7。此時(shí)，通過凝固的基質(zhì)膠分隔出兩個(gè)培養(yǎng)池，即右培養(yǎng)池4和左培養(yǎng)池3。
[0030]將一種細(xì)胞接種于左培養(yǎng)池3，將另一種細(xì)胞接種入右培養(yǎng)池4，兩者的培養(yǎng)液可以通過基質(zhì)膠，可以實(shí)現(xiàn)水平方向的兩種細(xì)胞共培養(yǎng)以及進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察、原位檢測和收集細(xì)胞檢測。
[0031]以腎小球內(nèi)皮細(xì)胞為例，將其接種于右培養(yǎng)池4，左培養(yǎng)池3空置，光鏡下可見本模型體培養(yǎng)池中的細(xì)胞和正常培養(yǎng)板中的細(xì)胞相比較，細(xì)胞生長狀態(tài)相同，外觀形態(tài)相同，以Real time-PCR、Western blot和免疫熒光檢測細(xì)胞骨架蛋白F-actin表達(dá)無差異，細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果無差異。之后將腎小球足細(xì)胞接種于左培養(yǎng)池，與右側(cè)培養(yǎng)池中的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線、PCNA檢測結(jié)果提示在本模型中共培養(yǎng)足細(xì)胞能顯著刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，其結(jié)果與應(yīng)用傳統(tǒng)Transwell體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比具有
一致性。
[0032]實(shí)驗(yàn)例2:本實(shí)用新型的模型應(yīng)用于一種細(xì)胞(或培養(yǎng)液中的成分)影響另一種細(xì)胞三維形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。
[0033]模型放置和細(xì)胞接種方法同實(shí)驗(yàn)例I。將一種細(xì)胞(或含有某成分的培養(yǎng)液)接種于左側(cè)培養(yǎng)池，將另一種細(xì)胞接種于右側(cè)培養(yǎng)池，可以動(dòng)態(tài)觀察前者對(duì)后者的作用，以及使后者向基質(zhì)膠內(nèi)生長、遷移的影響作用，從而觀察細(xì)胞三維形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的變化。適用于細(xì)胞遷移、趨化、侵襲、血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管形成、腫瘤細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)。
[0034]例如，在本模型的右培養(yǎng)池4中接種腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，左培養(yǎng)池3分別加入正常培養(yǎng)液、含VEGF (50pg/ml)的培養(yǎng)液、接種足細(xì)胞，觀察這三組的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在光鏡下的形態(tài)、遷移、成管的變化。結(jié)果顯示VEGF和足細(xì)胞均能顯著刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞向基質(zhì)膠中遷移并形成管狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)果與應(yīng)用傳統(tǒng)Transwell體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比具有一致性，但是應(yīng)用本實(shí)用新型的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型具有更便于進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察的優(yōu)點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其特征在于:包括模型體(1)，在模型體(I)內(nèi)側(cè)設(shè)有左培養(yǎng)池(3 )和右培養(yǎng)池(4 )，在左培養(yǎng)池(3 )和右培養(yǎng)池(4 )之間設(shè)有隔層(2 )，在隔層(2)上設(shè)有連通左培養(yǎng)池(3)和右培養(yǎng)池(4)的開口(8)，在左培養(yǎng)池(3)和右培養(yǎng)池(4)內(nèi)均配有與所述隔層(2)的側(cè)面相貼合的擋塊(7)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其特征在于:所述的開口(8)在寬度方向上呈下寬上窄形狀；所述的左培養(yǎng)池(3)和右培養(yǎng)池(4)相對(duì)于隔層(2)對(duì)稱設(shè)置。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于PDMS的三維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其特征在于:所述的模型體(I)和隔層(2)的高度為8 — 12mm;所述的開口(8)位于隔層(2)的中間位置，開口(8)的下寬(6)為 2.5—3.5 mm，上寬(5)為 1.5—2.5 mm。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK203419927SQ201320356837
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月21日
【發(fā)明者】林洪麗, 張團(tuán)兒, 滕佳琪 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院