一種檢測犬惡絲蟲的熒光定量pcr引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒，所述引物序列如SEQ?ID?NO.1和2所示，所述探針為SEQ?ID?NO.3和4。采用上述引物和探針可通過FRET-PCR技術(shù)對犬惡絲蟲進行檢測可特異擴增引起犬惡絲蟲病的唯一病原體-犬惡絲蟲的核酸，而不擴增其它類似但不引起犬惡絲蟲病的絲蟲的核酸。
【專利說明】—種檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)會引起血液寄生線蟲病(Heartworm disease),不僅嚴重影響?zhàn)B犬業(yè)的發(fā)展，同時也給人類健康帶來嚴重威脅。犬惡絲蟲的檢測方法主要有:1)微絲蝴檢查。主要通過血檢微絲蝴，即可確認犬體有成蟲寄生。但是，由于在犬惡絲蟲感染的早期，血液中不能檢測到微絲蝴，且在自然感染犬惡絲蟲的犬中有10%-67%為單性感染，不能產(chǎn)生微絲蝴，導(dǎo)致該法容易出現(xiàn)假陰性。同時，成蟲寄生數(shù)量較少或采血時間、采血位置不當?shù)纫矔绊懳⒔z蝴的檢出率。并且在實際檢測中約有20%以上感染犬用此法檢測會出現(xiàn)假陰性；2)可以采用血液學(xué)檢查、心血管檢查和X線檢查進行輔助檢測。此方法對設(shè)備儀器有較高的要求，對于廣泛使用有一定的困難；3)免疫學(xué)方法。通過檢測犬惡絲蟲抗原或抗犬惡絲蟲抗體，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(dot-ELISA)和商品化診斷試劑盒等在內(nèi)的免疫學(xué)技術(shù)已經(jīng)被逐漸應(yīng)用于檢測犬惡絲蟲；4)分子生物學(xué)診斷。主要通過PCR方法檢測，該方法具有較高的靈敏性和特異性。然而現(xiàn)有的PCR方法的靈敏度不夠，不能對犬惡絲蟲進行快速、有效和準確的分子檢測。尤其重要的是，犬惡絲蟲病的感染潛伏期較長且多為隱性感染，而現(xiàn)有的市場監(jiān)測方法因靈敏度不夠，而出現(xiàn)較高的假陰性率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]鑒于犬惡絲蟲引起的感染潛伏期較長且多為隱性感染，而現(xiàn)有檢測犬惡絲蟲的方法的假陰性率較高，急建立一種能夠敏感、特異、快速、準確地檢測犬惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)核酸的分子診斷方法。為解決此技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒。
[0004]本發(fā)明通過在病原5.8S rRNA上選擇了一個相對保守的區(qū)域作為目的片段設(shè)計相關(guān)引物和探針，發(fā)明一種高度靈敏可特異性擴增犬惡絲蟲核酸的PCR系統(tǒng)，且該系統(tǒng)不擴增惡絲蟲屬的其他種屬的核酸，如D.repens, D.tenuis, D.ursi等。優(yōu)化試驗保證此發(fā)明技術(shù)的特異性和敏感性。
[0005]從GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下相關(guān)的rRNA基因的序列后(AF217800, EU087700),用 Clustal Multiple Alignment Algorithm 的方法對所有序列進行比對，設(shè)計了一對引物和一對探針。
[0006]本發(fā)明所述一種檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR引物和探針，其序列如下:
[0007]上游引物:5’-TTCAATAACTCTAAGCGGGGGATCACCT-3’ (SEQ ID N0.1) [0008]下游引物:5’-TCTGATCGATATTGACCCTCAACCAGA C-3’ (SEQ ID N0.2)
[0009]6-FAM 探針:5，-TGCAGACGCATTGAGCACAAAGATTTC-(6-FAM)-3，(SEQ ID N0.3)
[0010]LCRed640 探針:5’-LCRED640-AATGCACATTGCACCATCGGGTTG A-磷酸-3 ‘(SEQ IDN0.4)
[0011]本發(fā)明還提供了檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括5xFRET-qPCR Stock22微升，22微升的5x的寡核苷酸混合物(含濃度為5 μ M的上游引物、5 μ M下游引物、1μ M的6-FAM探針、1 μ M的LCRed640探針，以及5個單位的高保真DNA聚
合酶)。
[0012]采用上述引物和探針可通過FRET-PCR技術(shù)對犬惡絲蟲進行檢測可特異擴增引起犬惡絲蟲病的唯一病原體-犬惡絲蟲的核酸，而不擴增其它類似但不引起犬惡絲蟲病的絲蟲的核酸(如 D.repens, D.tebuis 等)。
[0013]FRET-PCR特異性的確定。設(shè)計的引物和探針經(jīng)過GenBank的BLAST搜索，確認本發(fā)明設(shè)計的引物能特異地擴增犬惡絲蟲5.8s rRNA基因片段，而不擴增其它類似而不導(dǎo)致犬惡絲蟲病的種屬的基因片段。此外，觀察以上擴增對象在PCR過程中熒光強度(640nm)的變化，以及PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中條帶的大小。熒光在640nm波長出現(xiàn)或增強，顯示陽性；PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的172bp的條帶；對擴增的PCR產(chǎn)物進行測序，測序的結(jié)果和GenBank的犬惡絲蟲標準序列進行比對。
[0014]FRET-PCR靈敏度的確定:由IDT合成本發(fā)明PCR的擴增產(chǎn)物的代表序列，依據(jù)合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 μl合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝、1個拷貝的基因。用本發(fā)明系統(tǒng)擴增含不同基因濃度的代表序列，來確定本發(fā)明檢測此基因的靈敏度。結(jié)果顯示，此發(fā)明的單個反應(yīng)系統(tǒng)可以擴單拷貝的5.8S rRNA基因。選擇一個含犬惡絲蟲的血樣(200μ1)經(jīng)核酸提純后，5倍梯度連續(xù)稀釋(從左向右)后用于PCR擴增。隨著樣品的稀釋，樣品的cp值按照比例增加，表明此系統(tǒng)的高擴增效率(圖1)。
[0015]現(xiàn)有檢測犬惡絲蟲方法的特異性和敏感性不夠，不能對快速、準確的檢測犬的惡絲蟲。尤其重要的是，犬惡絲蟲感染的潛伏期較長且多為隱性感染，現(xiàn)有的市場檢測方法的假陰性率較高。該方法具有較高的靈敏度和特異性、所需樣品量少等優(yōu)點，為犬惡絲蟲的體外快速檢測提供了強大的技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.犬惡絲蟲核酸PCR擴增曲線。含犬惡絲蟲的血樣(200 μl)經(jīng)核酸提純后，5倍梯度稀釋(從左向右)后用于PCR擴增。隨著樣品的稀釋，樣品的cp值按比例增加，體現(xiàn)此系統(tǒng)的高效擴增。橫坐標=PCR的循環(huán)數(shù)；縱坐標:反應(yīng)系統(tǒng)的熒光值(640/498)。
[0017]圖2.來自哥斯達黎加的犬全血核酸經(jīng)犬惡絲蟲PCR擴增曲線。來自哥斯達黎加的40份犬全血樣品，經(jīng)核酸提純后用于本發(fā)明的犬惡絲蟲PCR。其中9個樣品為陽性，其余的陰性樣品的熒光線完全水平。橫坐標:PCR的循環(huán)數(shù)；縱坐標:反應(yīng)系統(tǒng)的熒光值(640/498)ο
[0018]圖3.來自哥斯達黎加的犬全血核酸經(jīng)犬惡絲蟲PCR的熔解曲線。來自哥斯達黎加的40份狗全血樣品，經(jīng)核酸提純后用于犬惡絲蟲病PCR。其中的9個陽性樣品出現(xiàn)特征性的約62攝氏度的熔解溫度(Tm)。橫坐標:熔解的溫度；縱坐標:根據(jù)軟件計算的50%探針退火后形成的熒光負對數(shù)峰[-(d/dT)熒光(498-640)]。【具體實施方式】
[0019]1.FRET-PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下:
[0020]上游引物:5’-TTC AAT AAC TCT AAG CGG GGG ATC ACC T-3’
[0021]下游引物:5’-TCT GAT CGA TAT TGA CCC TCA ACC AGA C-3’
[0022]6-FAM 探針:5，-TGC AGA CGC ATT GAG CAC AAA GAT TTC-(6-FAM)-3，
[0023]LCRed640 探針:5’ -LCRED640-AAT GCA CAT TGC ACC ATC GGG TTG A-磷酸-3，
[0024]2.制備PCR用的標準定量試劑。由IDT合成5.8S rRNA基因的核酸序列，此序列涵蓋此PCR的擴 增區(qū)域。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的5.8Sr RNA基因拷貝數(shù)目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 μ I合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝、I拷貝的5.8S rRNA基因，作為PCR用的標準定量試劑；
[0025]3.制備待檢樣品的DNA模板。本發(fā)明所用的檢測模板包括共169份，分別來自中國(廣州、昆明、鄭州各30份，共90份)、哥斯達黎加(40份)、尼加拉瓜(39份)三個國家的犬的全血樣本。收集的全血樣品保存于含EDTA的試管，用商業(yè)化試劑盒提純核酸，最后洗脫在200 μ I T10E0.?洗脫液，作為PCR的擴增模板；
[0026]具體的提取步驟:
[0027]3.1吸取20微升蛋白酶K加入到1.5ml離心管中。
[0028]3.2加入200微升全血到上述離心管中。
[0029]3.3加入200微升AL緩沖液到上述離心管中，在渦旋混勻儀上混勻15秒。
[0030]3.456°C孵育10分鐘，600rpm.瞬離(除去蓋子上的液滴)
[0031]3.5加入200微升乙醇(96%_100%)到樣本中，渦旋混勻儀上混勻15秒。瞬離
[0032]3.6將上述混勻后的樣本轉(zhuǎn)移至帶配備的有內(nèi)置濾膜的離心柱上，避免液體污染離心柱的邊緣。蓋緊蓋子，8000rpm離心I分鐘。棄去含有濾液的2ml收集管，換上新的收集管。
[0033]3.7小心打開離心柱蓋子，加入500微升AWl洗液，避免液體污染離心柱的邊緣。蓋緊蓋子，8000rpm離心I分鐘。棄去含有濾液的2ml收集管,換上新的收集管。
[0034]3.8小心打開離心柱蓋子，加入500微升AW2洗液，避免液體污染離心柱的邊緣。蓋緊蓋子，14000rpm離心3分鐘。棄去含有濾液的2ml收集管,換上新的收集管。
[0035]3.9HOOOrpm離心I分鐘。棄去含有濾液的2ml收集管。將離心柱放置在1.5ml離心管上。
[0036]3.10小心打開蓋子，加入100微升洗脫液，置于恒溫混勻儀上，560C，600rpm孵育5分鐘。8000rpm離心I分鐘。再重復(fù)一次該步驟。
[0037]3.11將洗脫下來的濾液吸取到新的1.5ml離心管中，_20°C或_80攝氏度保存。
[0038]4.PCR擴增體系。20 μ I的擴增體系包含10 μ I的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩沖液、ΙμΜ上游引物_1、1μΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探針、0.2μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0039]5.PCR擴增循環(huán)參數(shù)(以Roche公司LightCycler480熒光定量PCR儀為例)
[0040]PCR擴增包括18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)和40個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)。18 個溫度遞減的高嚴謹循環(huán):6xlsec@95 °C，12seci64 °C，8seci72 °C ；9xlseci95 °C，12seci62°C,8seci72°C ；3xlseci95°C, 12seci60°C,8seci72°C ；40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán):40xlsec@95t:，8sec(g58t:，30sec(g67t:，and30sec@72°C。
[0041]6.PCR結(jié)果的判定和定量分析。DNA模板的制備過程均設(shè)有DNA提取的陰性和陽性對照，隨后的PCR擴增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照、定量的標準試劑(每10 μ I standard含104，103，102，101拷貝的5.8S rRNA基因)。結(jié)果顯示，此發(fā)明的單個反應(yīng)系統(tǒng)可以擴增單拷貝的5.8S rRNA基因(圖3)。
[0042]實施例1:檢測來自哥斯達黎加40份狗全血核酸
[0043]40份采自哥斯達黎加的狗全血，每份取200微升全血經(jīng)過商業(yè)核酸提取試劑盒提取后，用200微升洗脫液洗脫核酸。使用本發(fā)明建立的PCR檢測系統(tǒng)，檢測該40份狗全血核酸，根據(jù)實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線(圖2 ;圖3)判斷，40份樣本中，有9份陽性樣本。陽性率達到22.5%。9份陽性樣品的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過商業(yè)試劑盒純化后，送至專門的測序公司進行測序。，在NCBI上比對測序結(jié)果。發(fā)現(xiàn)9個陽性樣本均為犬惡絲蟲。每個PCR檢測反應(yīng)都伴隨經(jīng)測序確認的標準株作為陽性對照、和稀釋液作為陰性對照。稀釋不同倍數(shù)的陽性對照顯示陽性，陰性對照顯示陰性，而表明次檢測結(jié)果的正確性。 [0044]實施例2:檢測來自尼加拉瓜39份狗全血核酸
[0045]39份采自尼加拉瓜的狗全血，每份取200微升全血經(jīng)過商業(yè)核酸提取試劑盒提取后，使用本發(fā)明建立的PCR檢測系統(tǒng)，根據(jù)實時熒光定量PCR的擴增曲線判斷，此39份樣本中均為陰性。每個PCR檢測反應(yīng)都伴隨經(jīng)測序確認的標準株作為陽性對照、和稀釋液作為陰性對照。稀釋不同倍數(shù)的陽性對照顯示陽性，陰性對照顯示陰性，而表明次檢測結(jié)果的正確性。
[0046]實施例3:檢測來自中國三個地區(qū)共90份狗全血核酸
[0047]90份采自中國的廣州、昆明、鄭州三個地區(qū)(每個地區(qū)各30份)的狗全血，每份取200微升全血經(jīng)過商業(yè)核酸提取試劑盒提取后，用200微升洗脫液洗脫核酸，用于本發(fā)明建立的PCR檢測系統(tǒng)。根據(jù)實時熒光定量PCR的擴增曲線判斷，此90份樣品均為陰性。這些狗均為來動物醫(yī)院就診的寵物狗，生長環(huán)境相對衛(wèi)生和營養(yǎng)狀況較好，并且許多狗還會定期接種疫苗，接觸病原體機會較少，也許這是出現(xiàn)全陰性結(jié)果的原因。這可能不同地域的地理環(huán)境的差異和傳播宿主的存在與否有關(guān)。每個PCR檢測反應(yīng)都伴隨經(jīng)測序確認的標準株作為陽性對照、和稀釋液作為陰性對照。稀釋不同倍數(shù)的陽性對照顯示陽性，陰性對照顯示陰性，而表明次檢測結(jié)果的正確性。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR引物和探針，其特征在于所述引物為: 上游引物:5’ -TTC AAT AAC TCT AAG CGG GGG ATC ACC T-3’ 下游引物:5’ -TCT GAT CGA TAT TGA CCC TCA ACC AGA C-3， 探針為:
.6-FAM 探針:5’ -TGC AGA CGC ATT GAG CAC AAA GAT TTC-(6-FAM)-3’ LCRed640 探針:5’ -LCRED640-AAT GCA CAT TGC ACC ATC GGG TTG A-磷酸-3。
2.一種檢測犬惡絲蟲的熒光定量PCR的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括5xFRET-qPCR Stock22微升，22微升的5x的寡核苷酸混合物所述寡核苷酸混合物含濃度為.5 μ M的上游引物、5 μ M下游引物、I μ M的6-FAM探針、I μ M的LCRed640探針以及5個單位的高保真DNA聚 合酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710450SQ201310728970
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】王成明, 危藍菁, 張繼壘, 宋春蓮, B·卡騰巴克 申請人:揚州大學(xué)