專利名稱：熒光定量pcr檢測醋醅中五種菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于固態(tài)釀醋微生物群落中特定種屬微生物的定量研究。
背景技術(shù)：
我國食醋的生產(chǎn)歷史悠久，根據(jù)產(chǎn)地、品種的不同，食醋中醋酸含量也不盡相同。例如山西老陳醋的酸味較濃，而鎮(zhèn)江香醋的酸味酸中帶柔，酸而不烈。各地釀醋工藝、口感等的不同，造就了山西老陳醋、鎮(zhèn)江恒順香醋、福建永春老醋、保寧醋“四大名醋”。但眾多的食醋生產(chǎn)廠家的發(fā)酵過程都以傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)為主，工藝可控性較差，并且產(chǎn)品品質(zhì)存在批次差異，尤其是風(fēng)味差異較大。這主要是由于釀造過程中微生物復(fù)雜多樣，對醋醅發(fā)酵過程中的微生物作用機(jī)制不清楚。中國食醋的釀造工藝是多菌種混合發(fā)酵工藝，通過多種微生物的代謝作用產(chǎn)生風(fēng)味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的生產(chǎn)中有兩個主要的發(fā)酵階段:酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵。在酒精發(fā)酵階段，淀粉質(zhì)原料如糯米、高粱等經(jīng)過霉菌和酵母菌的一系列代謝，最終生成酒精；而在醋酸發(fā)酵階段是包括醋酸菌、乳酸菌在內(nèi)的眾多細(xì)菌起主要的作用，該階段是決定食醋風(fēng)味和品質(zhì)的關(guān)鍵步驟。其中乳酸菌屬是醋酸發(fā)酵過程的優(yōu)勢微生物，乳酸菌可以代謝產(chǎn)生乳酸，不僅可以改善食醋的口感，可以對乙酸的刺激口感起到緩沖作用，使得食醋的酸味更加的柔和。而其中主要的乳酸菌包括瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌等，闡明發(fā)酵過程中幾種乳酸菌生物量的動態(tài)變化對于控制食醋發(fā)酵過程以及提高產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要的生產(chǎn)意義。熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 DNA模板的定量，而且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量、全封閉反應(yīng)、定量準(zhǔn)確、速度快及自動化程度高等特點(diǎn)。本發(fā)明成功運(yùn)用了熒光定量PCR技術(shù)對醋醅中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量，并得到其生物量在食醋發(fā)酵過程中的動態(tài)變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有食醋固態(tài)釀造分析技術(shù)的不足，提供了一種分子生態(tài)技術(shù)用于定量檢測固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過程中瑞士乳桿菌helveticus、、卷曲乳桿菌(Xactobacillus crispatus、、干酪乳桿菌(Xactobacilluscasei )、德氏乳桿菌{Lactobacillus delbrueckii )和嗜酸乳酸菌{Lactobacillusacidophilus)的動態(tài)變化，以指導(dǎo)實(shí)踐。本發(fā)明是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明針對醋醅群落中的瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌分別設(shè)計特異性引物，提取分離純化得到的幾種乳酸菌的基因組，然后分別利用設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR得到特異性目的片段，再將目的片段與PMD19-T Vector連接，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得高濃度質(zhì)粒，然將此高濃度質(zhì)粒做10倍比稀釋，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。利用液氮研磨、酶法和高鹽結(jié)合的方法提取發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測樣品，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品同時進(jìn)行熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算待測樣品中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的含量。對于瑞士乳桿菌的熒光定量PCR方法，檢測拷貝數(shù)在4.18 X 104_4.18 X IO11copies/μ L范圍時，Real-time PCR的擴(kuò)增曲線為一組典型的倒S曲線,擴(kuò)增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺區(qū)能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越高，循環(huán)閾值CT越低。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程是y=_0.2997x+12.882，線性相關(guān)系數(shù)為0.9929，具有較好的線性關(guān)系，根據(jù)公式E=KTk-1 (k_標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，算得Real-timePCR的擴(kuò)增效率為0.99，在0.8-1.2之間，擴(kuò)增效率理想。另外瑞士乳桿菌Real-time PCR熔解曲線，在85°C左右出現(xiàn)單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。對于卷曲乳桿菌的熒光定量PCR方法，檢測拷貝數(shù)在1.22X IO4-L 22X IO11copies/μ L范圍時，Real-time PCR的擴(kuò)增曲線為一組典型的倒S曲線,擴(kuò)增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺區(qū)能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越高，循環(huán)閾值CT越低。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程是y=_0.3098x+12.206，線性相關(guān)系數(shù)為0.9988，具有較好的線性關(guān)系，根據(jù)公式E=10_k-1 (k_標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，算得Real-timePCR的擴(kuò)增效率為1.04，在0.8-1.2之間，擴(kuò)增效率理想。另外卷曲乳桿菌Real-time PCR熔解曲線，在83.5°C左右出現(xiàn)單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。對于干酪乳桿菌的熒光定量PCR方法，檢測拷貝數(shù)在2.04X 104_2.04X IO11copies/μ L范圍時，Real-time PCR的擴(kuò)增曲線為一組典型的倒S曲線,擴(kuò)增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺區(qū)能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越高，循環(huán)閾值CT越低。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程是y=_0.3099x+12.497，線性相關(guān)系數(shù)為0.9946，具有較好的線性關(guān)系，根據(jù)公式E=KTk-1 (k_標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，算得Real-timePCR的擴(kuò)增效率為1.04，在0.8-1.2之間，擴(kuò)增效率理想。另外卷曲乳桿菌Real-time PCR熔解曲線，在83°C左右出現(xiàn)單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。對于德氏乳桿菌的熒光定量PCR方法，檢測拷貝數(shù)在8.99 X 104_8.99 X IO11copies/μ L范圍時，Real-time PCR的擴(kuò)增曲線為一組典型的倒S曲線,擴(kuò)增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺區(qū)能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越高，循環(huán)閾值CT越低。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程是y=_0.3123x+12.328，線性相關(guān)系數(shù)為0.9981，具有較好的線性關(guān)系，根據(jù)公式E=KTk-1 (k-標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，算得Real-timePCR的擴(kuò)增效率為1.05，在0.8-1.2之間，擴(kuò)增效率理想。另外卷曲乳桿菌Real-time PCR熔解曲線，在82.5°C左右出現(xiàn)單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。
對于嗜酸乳桿菌的熒光定量PCR方法，檢測拷貝數(shù)在1.95X 104-1.95X 10ncopies/μ L范圍時，Real-time PCR的擴(kuò)增曲線為一組典型的倒S曲線,擴(kuò)增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺區(qū)能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越高，循環(huán)閾值CT越低。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程是y=_0.301X+11.513，線性相關(guān)系數(shù)為
0.9983，具有較好的線性關(guān)系，根據(jù)公式E=10_k-1 (k_標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，算得Real-timePCR的擴(kuò)增效率為1.00，在0.8-1.2之間，擴(kuò)增效率理想。另外卷曲乳桿菌Real-time PCR熔解曲線，在79°C左右出現(xiàn)單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。熒光定量PCR技術(shù)檢測醋醅微生物群落中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的方法，具體步驟如下:
1、設(shè)計、合成針對瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的特異性引物。2、對分離純化得到的瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，利用細(xì)菌提取試劑盒分別對其培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提取。3、分別以瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的DNA為模板，以 Lhe-F/Lhe-R、Lcr-F/Lcr-R、Lca-F/Lca-R、Lde-F/Lde-R 和 Lacid-F/Lacid-R 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段，并將PCR產(chǎn)物割膠回收。4、構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片段與pMD19-T Vector連接，連接后轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用PCR驗(yàn)證目的片段是否插入PMD19-TVector,驗(yàn)證成功的質(zhì)粒作為突光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品。5、利用液 氮研磨、酶消化和高鹽提取結(jié)合的方法提取發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測樣品。6、熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立。通過反復(fù)試驗(yàn)，確定最優(yōu)反應(yīng)體系和循環(huán)條件。7、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，重組質(zhì)粒倍比稀釋8個梯度，與待測樣品同時進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)與CT值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的CT值對醋酸發(fā)酵過程不同時間醋醅群落中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量分析。所述的引物，是指其序列為:
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用熒光定量PCR檢測醋醅中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的方法，其特征及具體步驟如下: ①設(shè)計、合成針對瑞士乳桿菌{Lactobacillushelveticus、、卷曲乳桿菌{Lactobacillus crispatus)^ 干酪乳桿舊(XactobaciIIus casei)> 德氏乳桿菌{Lactobacillus 和嗜酸乳酸菌acidophilus、的特異性引物； ②對分離純化得到的瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，利用細(xì)菌提取試劑盒分別對其培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提??； ③分別以瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的DNA為模板，以 Lhe-F/Lhe-R、Lcr-F/Lcr-R、Lca-F/Lca-R、Lde-F/Lde-R 和 Lacid-F/Lacid-R 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段，并將PCR產(chǎn)物割膠回收； ④構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片段與pMD19-TVector連接，連接后轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用PCR驗(yàn)證目的片段是否插入PMD19-TVector,驗(yàn)證成功的質(zhì)粒作為突光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品； ⑤利用液氮研磨、酶消化和高鹽提取結(jié)合的方法提取發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測樣品； ⑥熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件； ⑦重組質(zhì)粒倍比稀釋8個梯度，與待測樣品同時進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)與CT值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的CT值對醋酸發(fā)酵過程不同時間醋醅群落中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，步驟①的特異性引物為:
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，步驟⑤所述的利用液氮研磨、酶消化和高鹽提取結(jié)合的方法提取發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測樣品的方法具體操作為: 稱取2 g醋醅，在研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管；向離心管中加入6mL DNA抽提緩沖液，再加入100 μ L溶菌酶(50 mg/mL)，于225 rpm搖床上37°C搖動30min;向離心管中加入1.5 mL 10% SDS,65°C水浴2 h,每隔15 20 min輕輕顛倒幾下，室溫6000Xg離心10 min ;收集上清；將上清液用等體積的氯仿-異戊醇(24:1體積比)，抽提一次，以0.6倍體積的異丙醇室溫沉淀lh, 16000g離心20 min,收集核酸沉淀,用70%乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μ L TE或ddH20中，加入終濃度為0.5 μ g/mlRNaseA,并在37 °C下水浴消化2 h,以去除RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA提取的效果，如果在10 kb左右出現(xiàn)條帶，則DNA提取成功，將成功提取的DNA溶液置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，步驟⑥確立的熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下: 反應(yīng)體系采用20 μ L體系，其中SsoFast EvaGreen預(yù)混液10 μ L，正向引物I μ L，反向引物I μ L，模板DNAlO ng，ddH20加至20 μ L ;反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30 s ;95°C變性5 S，最佳退火溫度10 S，讀取熒光信號數(shù)據(jù)，共循環(huán)擴(kuò)增40次。
全文摘要
本發(fā)明采用熒光定量PCR來檢測醋醅群落中瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的動態(tài)變化，為其他微生物群落的研究提供技術(shù)支持。
文檔編號C12Q1/06GK103184289SQ20131010747
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月30日
發(fā)明者許正宏, 史勁松, 陸震鳴, 陶京蘭, 李國權(quán), 錢建瑛 申請人:江南大學(xué)