一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法，以分離自海洋的海洋細(xì)菌為受試生物，將凝膠劑加入到細(xì)菌液體培養(yǎng)基中加熱溶解、冷卻后，將受試化合物均勻分散在凝膠溶液中，然后將含受試化合物凝膠溶液均勻涂布玻璃板上制成凝膠測試板；將凝膠測試板置于接種受試生物的海水中，連續(xù)培養(yǎng)后，將凝膠測試板取出、淋洗，定容于容量瓶中，測試OD值（光密度值）或吸光度值，將OD值或吸光度值換算成抑菌率，通過比較抑菌率的大小評價受試化合物的防污性能。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是評價方法操作簡單、易行，評價周期短，用海洋細(xì)菌為受試生物，可應(yīng)用于海洋防污涂料研發(fā)過程防污劑的篩選。
【專利說明】一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速篩選評價方法，尤其涉及一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋生物污損問題，制約著人類對海洋資源的開發(fā)利用，并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，防除海洋生物污損最常用的方法是涂裝防污涂料。防污劑是防污涂料最主要的防除海洋生物污損有效成份之一，篩選評價防污劑是防污涂料研發(fā)過程不可缺少的步驟。提高完善防污性能的評價方法，對防污涂料開發(fā)具有重要意義。國標(biāo)GB/T5370-2007《防污漆樣板淺海浸泡試驗(yàn)方法》中提供了一種防污涂料評價方法，將防污劑配成防污涂料后也可用來國標(biāo)GB/T5370-2007中方法評價防污劑的防污性能，但是評價周期長。中國作者田斌2005年的碩士論文《海洋防污涂層生物學(xué)性能研究》中用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酒精酵母3種菌株作為受試生物來評價防污劑的防污性能，但由于受試生物不是典型海洋細(xì)菌，不能代表海洋菌種，評價結(jié)果代表性常受質(zhì)疑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法和應(yīng)用，它以分離自海洋的海洋細(xì)菌為受試生物，將凝膠劑加入到細(xì)菌液體培養(yǎng)基中加熱溶解后冷卻制成凝膠溶液，將受試化合物均勻分散在凝膠溶液中，然后將含受試化合物凝膠溶液均勻涂布玻璃板上制成凝膠測試板，再將凝膠測試板置于接種受試生物的海水中，連續(xù)培養(yǎng)后，將凝膠測試板取出、淋洗，定容于容量瓶中，測試OD值(光密度值)或吸光度值，將OD值或吸光度值換算成抑菌率，通過比較抑菌率的大小評價受試化合物的防污性能。所述的評價方法操作簡單、易行，評價周期短，用海洋細(xì)菌為受試生物，可應(yīng)用于海洋防污涂料研發(fā)過程中防污劑的篩選。
[0004]上述的海洋細(xì)菌，其特征是用選擇性培養(yǎng)基，自海水、海洋沉積物、涉海設(shè)施浸海部分分離出。
[0005]上述的選擇性培養(yǎng)基是Zobell 2216 E培養(yǎng)基、海洋弧菌用TCBS培養(yǎng)基、分離放線菌用高氏合成I號培養(yǎng)基、腐殖酸培養(yǎng)基、天門冬素培養(yǎng)基、精氨酸培養(yǎng)基、上述的改良型培養(yǎng)基的一種或幾種。
[0006]上述的液體培養(yǎng)基是Zobell 2216 E液體培養(yǎng)基、海洋弧菌用TCBS液體培養(yǎng)基、分離放線菌用高氏合成I號液體培養(yǎng)基、腐殖酸液體培養(yǎng)基、天門冬素液體培養(yǎng)基、精氨酸液體培養(yǎng)基、上述的改良型液體培養(yǎng)基的一種或幾種。
[0007]上述的凝膠劑是瓊脂、明膠、魚膠、卡拉膠中的一種或幾種。
[0008]上述凝膠測試板的制作方法，其特征是將凝膠劑加入到細(xì)菌液體培養(yǎng)基中加熱溶解后冷卻制成凝膠溶液，將受試化合物均勻分散在凝膠溶液中，然后將含受試化合物凝膠溶液均勻涂布在玻璃板上制成。[0009]上述的玻璃板，是長100 mm、寬IOOmm或長200 mm、寬200mm或長250 mm、寬2500mm
表面光滑的玻璃板。
[0010]上述的測試OD值或吸光度值的方法，其特征是是用酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)，以液體基培養(yǎng)基為參比，測定凝膠測試板淋洗液的OD值或吸光度值。
[0011]上述的評價方法在研發(fā)海洋防污涂料過程中篩選防污劑時的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的篩選評價海洋防污劑方法的優(yōu)點(diǎn)是以海洋細(xì)菌為受試生物，代表性強(qiáng)，評價方法操作簡單、易行，評價周期短。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合附實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0014]實(shí)施例:
1、海洋細(xì)菌的分離
用海水選擇性培養(yǎng)基，用濾膜富集的的方法或涂布法或劃線法中的一種或幾種方法培養(yǎng)并分離取自海水、海洋沉積物、涉海設(shè)施浸海部分的海洋細(xì)菌，低溫下保存?zhèn)溆谩?br> [0015](1)從海水中分離細(xì)菌:
用滅菌的硝化纖維濾膜按不同體積海水量進(jìn)行富集，富集后的濾膜取下，接種到預(yù)先編號的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時間后，進(jìn)行分離，并在低溫下保存菌種。
[0016]用無菌采水瓶從舟山東極島附近海區(qū)三個站位取水樣。用滅菌的硝化纖維濾膜(0.45um)，分別對100mL、200mL、300mL海水樣品進(jìn)行富集，取下濾膜，分別緊貼于上述三種預(yù)先編好號的含有Zobell 2216 E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。將培養(yǎng)皿放置IOmin后，倒置放于25°C生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3-5天，觀察其形態(tài)，記錄數(shù)量，如菌落不純，挑取菌落用劃線法分離，直到純化，而后接種于斜面，甘油液封，-20°C下，保存?zhèn)溆谩?br> [0017](2)從涉海設(shè)施浸海部分分離細(xì)菌:
對從涉海設(shè)施浸海部分所取的樣品進(jìn)行低速離心，取上清液，并稀釋成不同倍數(shù)，選擇適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液，在預(yù)先編號的平板培養(yǎng)基上接種，培養(yǎng)一段時間后，分離，于低溫下保存?zhèn)溆?。上述的稀釋成倍?shù)范圍為KT1~10_6倍。
[0018]用無菌采樣瓶，在舟山東極島附近深水網(wǎng)箱上選擇9個點(diǎn)進(jìn)行取樣(用捏子采集不同的附著物)，對樣品進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速2000r/min，離心I分鐘，取上清液，用無菌海水稀釋到lO'lO'lO'lO'lO'lO—6倍。選取10_4、10_5和10_6倍的稀釋液，用涂布法在編好號的Zobell 2216 E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行涂布，每個濃度稀釋液涂3個板。將培養(yǎng)皿放置IOmin后，倒置放于25°C生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3_5天，觀察其形態(tài)，記錄數(shù)量，如菌落不純，挑取菌落用劃線法分離，直到純化，而后接種于斜面，甘油液封，于-20°C下，保存?zhèn)溆谩?br> [0019](3)從海洋沉積物中分離細(xì)菌:
取一定量海洋沉積物樣品，分散于無菌海水中，震蕩成懸浮液，稀釋不同倍數(shù)后，取適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液，涂布到含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，編號，培養(yǎng)一段時間后，觀察記錄菌落生長情況，采用劃線法對菌落進(jìn)行純化分離，于低溫下保存?zhèn)溆?。上述的稀釋成倍?shù)范圍為KT1 ~10_6 倍。
[0020]取IOg海泥或海沙樣品，分散于IOmL無菌海水中，震蕩成懸浮液，用無菌海水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 g/mL。取 10_4、10_5 和 10_6 g/mL 稀釋液用涂布法在編好號的Zobell 2216 E固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行涂布，每個濃度稀釋液涂3個板。將培養(yǎng)皿放置IOmin后，倒置放于25°C生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3_5天，觀察其形態(tài)，記錄數(shù)量，如菌落不純，挑取菌落用劃線法分離，直到純化，而后接種于斜面，甘油液封，于-20°C下，保存?zhèn)溆谩?br> [0021]2、凝膠測試板的制備
向液體培養(yǎng)基中，分別加入凝膠劑，加熱溶解配制一定濃度的凝膠劑溶液，冷卻后，向其中分別加入受試化合物防污劑，制成含受試化合物的凝膠溶液，均勻涂布在玻璃板上。上述的一定濃度的凝膠劑溶液是指凝膠劑濃度范圍為I %~30%的溶液(重量百分?jǐn)?shù))。上述的含受試化合物的凝膠溶液是指濃度范圍I mg/mL~400 mg/mL受試化合物的凝膠溶液。
[0022]向Zobell 2216 E液體培養(yǎng)基中，加入瓊脂粉，加熱溶解配制成瓊脂濃度為1%的瓊脂凝膠溶液，冷卻至50~60°C，待用。取5份上述的瓊脂凝膠溶液分別加入TBT0、CPT、ZPT、DCDMA、Diuron五種受試化合物，制成受試化合物濃度為I mg/mL的5種瓊脂凝膠溶液，均勻涂布在規(guī)格為IOOX IOOmm玻璃板上，晾干，形成光滑平整的凝膠表面。以不加受試化合物的瓊脂凝膠溶液制做的凝膠測試板作為空白對照。
[0023]3、凝膠測試板在接種受試生物海水中的培養(yǎng)
在規(guī)格為630X 370X500mm玻璃缸中，加入IOL無菌海水，以及培養(yǎng)10小時后的受試菌懸液各lmL，保持溫度25°C，培養(yǎng)至指數(shù)生長期后，將瓊脂凝膠測試板置入玻璃缸海水中，連續(xù)培養(yǎng)24h。
4、OD值的測定與防污效果評價
將瓊脂凝膠測試板取出，用液體培養(yǎng)基淋洗，用液體培養(yǎng)基定容至50 mL容量瓶中，測定OD值或吸光度值。
[0024]24h抑菌率的計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法，其特征是:以分離自海洋的海洋細(xì)菌為受試生物，將凝膠劑加入到細(xì)菌液體培養(yǎng)基中加熱溶解、冷卻后，將受試化合物均勻分散在凝膠溶液中，然后將含受試化合物凝膠溶液均勻涂布玻璃板上制成凝膠測試板；將凝膠測試板置于接種受試生物的海水中，連續(xù)培養(yǎng)后，將凝膠測試板取出、淋洗，定容于容量瓶中，測試OD值或吸光度值，將OD值或吸光度值換算成抑菌率，通過比較抑菌率的大小評價受試化合物的防污性能； 所述的比較抑菌率為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法，其特征是:所述的培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基分離自海水或海洋沉積物或浸海設(shè)施浸海部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法，其特征是:所述的液體培養(yǎng)基選自Zobell 2216E培養(yǎng)基、海洋弧菌用TCBS培養(yǎng)基、分離放線菌用高氏合成I號培養(yǎng)基、腐殖酸培養(yǎng)基、天門冬素培養(yǎng)基、精氨酸培養(yǎng)基、上述的改良型培養(yǎng)基的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速簡易篩選評價海洋防污劑的方法，其特征是:所述的凝膠劑是瓊脂、明膠、魚膠、卡拉膠`中的一種或幾種。
【文檔編號】C12Q1/02GK103710419SQ201310725873
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】徐煥志, 孫靜亞, 沈明 申請人:浙江海洋學(xué)院