一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，屬于酶制劑制備【技術領域】。以保藏編號為CCTCC?NO:M2013538的地衣芽孢桿菌（Βacillus?licheniformis）β-10-25為菌種，經菌種活化、液體種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)等步驟制備而成，制備的熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶8000-10000u/ml,是原始菌株的2.5倍；在50-70℃條件下具有較高酶活，最適反應溫度為65℃；適用反應pH值范圍為5.0；在室溫下保存6個月后酶活損失小于25%，4℃保存12個月后酶活損失小于20%。比現(xiàn)有的β-葡聚糖酶酶活力高，酶作用最適pH值范圍寬泛，熱穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性均較高，特別適合飼料酶的工業(yè)化需求。
【專利說明】一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術領域】，特別是一種高產熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌。
【背景技術】
[0002]β_葡聚糖是一種天然多糖，通常存在于特殊種類的細菌、酵母菌及真菌的細胞壁，或者高等植物種子的包被中。β-葡聚糖是構禾本植物細胞壁的一種結構性非淀粉多糖，在大麥、黑麥、高粱、大米及小米的胚乳細胞壁中含量尤其高。與一般糖類主要以α-1，4_糖苷鍵結合而成為線形分子不同的是，植物細胞壁中的β_葡聚糖是以混合的β- (1,3), (1，4)糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，因此葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，從而具有粘度大、親水性高、吸水膨脹力和持水性高的性質。當以大麥作為啤酒生產原料時，上述性質便會影響麥芽汁的過濾速度，降低固形物的浸出率，還會因凝膠沉淀作用而降低啤酒的品質；同時當含有β_葡聚糖的作物用作飼料時，會增加非反芻禽畜的腸液粘度，成為飼料的抗營養(yǎng)因子之一，降低飼料的利用率。
[0003]β -葡聚糖酶是高效、專一分解β -葡聚糖的主要酶，在啤酒和飼料的生產過程中添加該酶能有效的解決上述問題。在飼料工業(yè)中它能水解β -葡聚糖中的1-3或1-4糖苷鍵，使之降解為低分子糖，降解后的β -葡聚糖市區(qū)親屬性和粘性，不會在畜禽腸道中膨脹粘連，使得食糜的消化率以及飼料的能量利用率均得到提高。β -葡聚糖酶應用于啤酒生產中，可以轉移分解粘度很高的各種大麥葡聚糖，疏松大麥胚乳細胞壁，促進細胞內容物的外溢，提高原料利 用率，降低麥芽汁粘度，從而使啤酒產量增加，品質得以提升。
[0004]目前，美國、日本、丹麥、德國、澳大利亞、加拿大等國均已采用葡聚糖酶作為啤酒和飼料工業(yè)的主要酶制劑，而其在醫(yī)藥、紡織、廢水處理和日用化工、生物防治等其他方面的應用價值也逐漸顯現(xiàn)出來，前景十分廣闊。但是熱穩(wěn)定性差和酶活力低已經成為影響其應用效果的制約因素。
[0005]中國專利CN103013873A公開了一株產熱穩(wěn)定性β -葡聚糖酶的菌株，該發(fā)明首次提供了一株來源于溫泉的能夠生產β -1, 3-1，4-葡聚糖酶的高地芽孢桿菌，并克隆得到了該酶的基因，該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持90%的酶活力。
[0006]中國專利CN102719416A提供了一種提高β _1，3_1，4_葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，通過HNO2對β -1, 3-1，4-葡聚糖酶進行化學修飾，所得的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶T5tl值和t(1/2,60D 分別提高了 4.76%和62.1%。
[0007]之前，市場上高品質的β -葡聚糖酶幾乎被國外的酶制劑生產公司所壟斷，雖然近幾年我國所報道的微生物產葡聚糖酶的酶活力已達到甚至超過了國際水平，但是能夠獲得兼具高活性及熱穩(wěn)定性的β_葡聚糖酶及其生產菌株仍然是目前工業(yè)應用中亟待解決的一大問題。

【發(fā)明內容】
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶的制備方法。
[0009]本發(fā)明提供的產熱穩(wěn)定性好的β_葡聚糖酶的菌株具體為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) β-10-25。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院)，保藏號為 CCTCC NO:Μ2013538ο
[0010]所述地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) β-10-25 特點如下:
[0011 ] 所述菌株在固體平板上菌落為白色，邊緣不整齊，表面干燥不透明，鏡檢為革蘭氏陽性細菌，細胞形態(tài)呈短桿狀，芽孢中生，橢圓形，不膨大。
[0012]所述菌株生理生化特征:V-P試驗( + )，淀粉水解( + )，酪素水解( + )，明膠水解( + )，硝酸鹽還原( + )，吲哚試驗(_)，利用檸檬酸鹽( + )，硝酸還原( + )，甘露醇( + )，木糖(+ )。
[0013]一種熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0014](I)種子培養(yǎng)
[0015]將β -10-25斜面菌種經三級搖瓶發(fā)酵劑一級種子罐發(fā)酵；
[0016]所述種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉1%，NaCll %,ρΗ4.5-7.0,121-123°C滅菌 30_40min。
[0017](2)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0018]將一級種子罐發(fā)`酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35-45 °C，攪拌速度200-300r/min，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時恒溫培養(yǎng)15-20h ;此時，將一級種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)10-15h ;繼續(xù)將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時恒溫培養(yǎng)10-15h ;
[0019]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值4.5-7.0,121°C滅菌20min ；
[0020]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值3-7，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15-30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，pH3_7，121_123°C滅菌30_40min備用。
[0021]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0022]稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10_15份；麥冬10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOff功率下超聲萃取0.5~1.5h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0023]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0024]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果膠酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0025]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0026](3)發(fā)酵液經過濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。
[0027]經上述制備方法得到的β -葡聚糖酶液體酶活力為8000-10000u/ml。
[0028]有益效果:
[0029]1.本發(fā)明方法制備的葡聚糖酶酶活力高達8000-10000u/ml，是原始菌株的2.5倍；在50-701:條件下具有較高酶活，最適反應溫度為65°C;適用反應pH值范圍為5.0 ；在室溫下保存6個月后酶活損失小于25%，4°C保存12個月后酶活損失小于20%。制得的酶比現(xiàn)有的β_葡聚糖酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，熱穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性均較高，特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0030]2.本發(fā)明對地衣芽孢桿菌β -10-25培養(yǎng)基組成實施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，添加了具有調整和修復機體功能、增強機體的免疫功能、具有微生態(tài)調節(jié)功能的黃芪、黨參等，進一步增強了兩種微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機體功能性、傳代適應性和共同協(xié)作性，進而增強地衣芽孢桿菌β-10-25的代謝功能，使得本發(fā)明所產β -葡聚糖酶酶活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強、適于工業(yè)化生產。
[0031]3.本發(fā)明葡聚糖酶的制備方法中培養(yǎng)基的重要組成部分中草藥粉劑采用酶解工藝和水提醇沉工藝相結合，不僅顯著提高了各種中草藥的有效成分，增強了中草藥的作用效力，而且還為微生物發(fā)酵提供了難得的營養(yǎng)物質(如中藥多糖等)。添加具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，使得所得的β-葡聚糖酶具有更好的穩(wěn)定性和保存活性。
【具體實施方式】
[0032]下面通過具體的實施方案敘述`本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0033]實施例1
[0034]一種β -葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0035](I)液體種子擴大培養(yǎng)
[0036]①一級種子培養(yǎng):將活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0037]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0038]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0039]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41 °C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0040]所述種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCll %,ρΗ5.5，121°C 滅菌 35min。
[0041](2)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0042]將一級種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度250r/min，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間12h ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至37°C時恒溫培養(yǎng)18h ;此時，將一級種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)12h ;繼續(xù)將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至37°C時恒溫培養(yǎng)12h ；
[0043]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值5.5，121°C滅菌20min ；
[0044]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值5.5，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然后緩慢升溫至90°C保溫20min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，PH5.5，121°C滅菌35min備用。
[0045]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0046]稱取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；麥冬12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlW超聲萃取lh，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
`[0047]所述混合酶添加量為混合物料總重量的8%。
[0048]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶18份，果膠酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0049]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.2。
[0050](3)發(fā)酵液經過濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。
[0051]經上述制備方法得到的β -葡聚糖酶液體酶活力為10000u/ml。
[0052]實施例2
[0053]一種β -葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0054](I)液體種子擴大培養(yǎng)
[0055]①一級種子培養(yǎng):將活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0056]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0057]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0058]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41 °C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；[0059]所述種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，NaCll %,pH4.5,121°C滅菌 30min。
[0060](2)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0061]將一級種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌速度200r/min，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間IOh ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至35°C時恒溫培養(yǎng)15h ;此時，將一級種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)IOh ;繼續(xù)將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至35°C時恒溫培養(yǎng)IOh ；
[0062]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值4.5，121°C滅菌20min ；
[0063]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值4.5，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15min，然后緩慢升溫至90°C保溫15min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始PH4.5，121°C滅菌30min備用。
[0064]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0065]稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；麥冬10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度70°C 90°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOW功率下超聲萃取0.5h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0066]所述混合酶添加量 為混合物料總重量的5% ；
[0067]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，果膠酶10份，酸性蛋白酶10份，木瓜蛋白酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份；
[0068]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1。
[0069](3)發(fā)酵液經過濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。
[0070]經上述制備方法得到的β -葡聚糖酶液體酶活力為8000u/ml。
[0071]實施例3
[0072]一種β -葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0073](I)液體種子擴大培養(yǎng)
[0074]①一級種子培養(yǎng):將活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0075]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0076]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間15h ；
[0077]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41 °C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1: 1.5，罐壓.0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0078]所述種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，NaCll %,ρΗ7.0,121°C滅菌 35min。
[0079](2)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0080]將一級種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速度300r/min，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間15h ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至45°C時恒溫培養(yǎng)20h ;此時，將一級種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至45°C時恒溫培養(yǎng)15h ；
[0081]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值7.0,121°C滅菌20min ；
[0082]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值7，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，PH7.0,121°C滅菌40min備用。
[0083]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0084]稱取黃芪30份；黨參18份；柴胡15份；麥冬15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOW功率下超聲萃取1.5h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0085]所述混合酶添加量為混合物料總重量的10% ；
[0086]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，果膠酶15份，酸性蛋白酶15份，木瓜蛋白酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
[0087]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.5。
[0088](3)發(fā)酵液經過濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。
[0089]經上述制備方法得到的β -葡聚糖酶液體酶活力為8500u/ml。
【權利要求】
1.一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶由地衣芽孢桿菌(B acillus Iicheniformis) β -10-25通過發(fā)酵法制得,菌種保藏號為 CCTCC Ν0:Μ2013538ο
2.如權利要求1所述一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟: 地衣芽孢桿菌CCTCC Ν0:Μ2013538的斜面菌種活化培養(yǎng)獲得液體種子；將一級種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35-45°C，攪拌速度200-300r/min，通風量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至35-45°C時恒溫培養(yǎng)15-20h ;此時，將一級種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)10-15h ;繼續(xù)將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時恒溫培養(yǎng)10_15h ； 發(fā)酵液經過濾、濃縮、精濾、干燥得葡聚糖酶。
3.如權利要求2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.5 %，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %，ρΗ4.5-7.0。
4.如權利要求2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥劑粉30-50g,海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水1000mL, pH值4.5-7 ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值4.5-7,加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，PH4.5-7，備用。
5.如權利要求4所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下: 稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；麥冬10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶進行酶解，用乳酸調節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇的混合的質量比例為1:1-1.5，IlOW超聲萃取0.5~1.5h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
6.如權利要求5所述的一種熱穩(wěn)定性好的β_葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果膠酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
7.如權利要求2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β_葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟: (I)液體種子擴大培 養(yǎng) ①一級種子培養(yǎng):將活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間IOh ； ②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時間12h ； ④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41°C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V)l:1.5，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時間15h ； 所述種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，NaCll%, pH5.5，121°C 滅菌 35min ； (2)發(fā)酵罐發(fā)酵 將一級種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度250r/min，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間12h ;然后將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至37°C時恒溫培養(yǎng)18h ;此時，將一級種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)12h ;繼續(xù)將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補入發(fā)酵罐，待溫度升至37°C時恒溫培養(yǎng)12h ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值5.5，121°C滅菌20min ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值5.5,加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然后緩慢升溫至90°C保溫20min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，PH5.5，121°C滅菌35min備用；· 所述中草藥粉劑的制備方法如下: 稱取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；麥冬12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合酶進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlW超聲萃取lh，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；所述混合酶添加量為混合物料總重量的8% ； 所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶18份，果膠酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份；所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.2 ; (3)發(fā)酵液經過濾、濃縮、精濾、干燥得β-葡聚糖酶。 經上述制備方法得到的β_葡聚糖酶液體酶活力為10000u/ml。
【文檔編號】C12R1/10GK103820419SQ201310717215
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李洪兵, 張錦杰, 劉文明, 劉波, 封章平, 王永蘭 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司