一種查找與桿狀病毒pcna相互作用蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，應(yīng)用分子克隆、DNA測(cè)序等手段克隆了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）PCNA基因的全長(zhǎng)DNA，并對(duì)其純化，耦連到親和層析柱，與質(zhì)譜連用查找互作蛋白。本發(fā)明可應(yīng)用于桿狀病毒PCNA互作蛋白的查找與功能研究。
【專利說明】—種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)相互作用的蛋白。
技術(shù)背景
[0002]桿狀病毒是一類專門寄生于節(jié)肢動(dòng)物的病原微生物。在桿狀病毒眾多成員中，研究和利用最多的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。桿狀病毒宿主域很狹窄，僅限于少數(shù)幾種節(jié)肢動(dòng)物，主要是昆蟲。桿狀病毒用于生物防治的突出優(yōu)點(diǎn)是:對(duì)人畜安全，不傷害天敵，對(duì)宿主致病性強(qiáng)，殺蟲的后效作用較持久，不污染環(huán)境，并有后效作用。但其過高的宿主特異性與緩慢的發(fā)病致死作用也在一定程度上影響了桿狀病毒的使用。通過基因工程構(gòu)建重組病毒，不僅可以克服桿狀病毒的固有缺點(diǎn)，也為擴(kuò)大病毒殺蟲功能提供了潛在可能。
[0003]增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)的相對(duì)分子質(zhì)量為29KD的酸性蛋白，它是一種表達(dá)水平隨著細(xì)胞周期波動(dòng)的高度保守的生長(zhǎng)調(diào)控蛋白，可圍繞DNA鏈組裝成三聚體滑動(dòng)夾?；瑒?dòng)夾PCNA能夠以一定的秩序與多種復(fù)制相關(guān)蛋白如SSB (single-stranded DNA binding protein)、RFC(復(fù)制因子 C)等結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 的復(fù)制、損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等事件的協(xié)同。因此，PCNA作為一個(gè)平臺(tái)與DNA代謝中的多種蛋白因子相互作用，對(duì)于了解病毒的DNA修復(fù)機(jī)制非常有意義，為進(jìn)一步研究和改造桿狀病毒奠定了重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)與PCNA起互作反應(yīng)的蛋白的鑒定及功能分析。
[0005]為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明應(yīng)用分子克隆、DNA測(cè)序等手段克隆了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)PCNA基因的全長(zhǎng)DNA，并對(duì)其純化，耦連到親和層析柱，與質(zhì)譜連用查找互作蛋白，具體技術(shù)方案如下:
一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于查找與AcMNPV即苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的PCNA即增殖細(xì)胞核抗原相互作用蛋白的方法，具體包含以下幾個(gè)步驟:
步驟一，克隆所述AcMNPV的PCNA基因連接到表達(dá)載體中；所述PCNA基因?yàn)镚enBankID=1403881 ；
步驟二,在大腸桿菌B121中表達(dá)PCNA蛋白，通過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱純化，得到PCNA高純蛋白；
步驟三,利用所述PCNA高純蛋白與CNBr-Activated Sepharose 4B稱連,制備PCNA親和層析柱；
步驟四，在所述AcMNPV病毒感染SF9細(xì)胞后，收集感染后的總蛋白，經(jīng)過PCNA親和層析柱洗脫，SDS-PAGE鑒定洗脫組分，質(zhì)譜鑒定與PCNA相互作用的蛋白。
[0006]所述的PCNA基因是用以下引物擴(kuò)增得到的:
正向?yàn)?5’ -CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAAITT-3’ ；
反向?yàn)?5’ -CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3。
[0007]步驟二中所述的純化，具體過程為:收集的經(jīng)超聲波裂解、高速離心后含表達(dá)了PCNA蛋白的上清,經(jīng)過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱分離純化出高純度的PCNA高純蛋白。
[0008]步驟三中所述親和層析柱的具體制備過程為:
過程一，如步驟二所述制備PCNA高純蛋白；
過程二，制備親和層析介質(zhì):耦連緩沖液，含有0.5M NaCl的pH8.3 0.1M NaC03 ;稱取CNBr-Activated Sepharose 4B凍干粉放置在ImM HCl中懸浮溶脹，放置大約30分鐘后，棄濾液，用約15倍膠體積的I mM HCl溶液沖洗干凈；加入PCNA的含量為2 mg/ml的耦連緩沖液，4°C，過夜；將反應(yīng)完洗滌過的凝膠懸浮到水中，加入IM乙醇胺，在常溫最少攪拌反應(yīng)2小時(shí)，以消除殘余活性基團(tuán)；用含有0.5M NaCl的0.1M PH為4.0的醋酸鹽緩沖液和含有
0.5M NaCl的0.1M PH為8的Tris-HCl緩沖液交替洗滌，重復(fù)洗滌3次即得親和層析柱。
[0009]步驟 四中所述的質(zhì)譜鑒定是指:將細(xì)胞總蛋白過PCNA親和層析柱后，跑SDS-PAGE凝膠電泳，復(fù)合物中的各個(gè)蛋白被分開，切膠、胰酶消化后，通過ABI 4800 MALDITOF/ TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，鑒定各片段的分子質(zhì)量，利用Mascot軟件搜索比對(duì)最新的NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫以鑒定目的蛋白，查找出與PCNA互相作用的蛋白。
[0010]本發(fā)明具有有益效果。本發(fā)明應(yīng)用分子克隆、DNA測(cè)序等手段克隆了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒PCNA基因的全長(zhǎng)DNA，并對(duì)其純化，耦連到親和層析柱，與質(zhì)譜連用查找互作蛋白，能實(shí)現(xiàn)方便、快速、廉價(jià)的查找與桿狀病毒PCNA起互作反應(yīng)的蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明的PCNA蛋白表達(dá)的Western blot鑒定結(jié)果圖。
[0012]圖2為本發(fā)明洗脫組分的SDS-PAGE圖譜。
[0013]圖3為本發(fā)明洗脫的蛋白條帶胰酶水解肽指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
[0015]實(shí)驗(yàn)材料:
SDS、TEMED,丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺購自上海捷瑞生物有限公司JransStartFastPfu DNA Polymerase和pEASY-Blunt Zero載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清等化學(xué)試劑購自 GIBCO BRL 公司；N1-NTA Agarose 購自 QIAGEN ;CNBr_Activated Sepharose 4B 購自GE Healthcare Life Sciences ;其它試劑均為國產(chǎn),分析純。限制性內(nèi)切酶、大腸桿菌DH5a和BL21從Takara公司購買；AcMNPV病毒、Sf9細(xì)胞由江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院保存。
[0016]實(shí)施例一:苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒PCNA基因的克隆
根據(jù)AcMNPV的PCNA基因序列(GenBank ID:1403881)設(shè)計(jì)引物。PCR引物為: 正向:5’-CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAATTT-3’(下劃線為 BamH I 酶切位點(diǎn))
反向:5’-CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3’(下劃線為 Xho I 酶切位點(diǎn))
用全式金的TransStart FastPfu DNA Polymerase特異擴(kuò)增PCNA片段，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 S，58°C退火30 s，72°C延伸40 S，共25個(gè)循環(huán)，之后72°C再延伸8 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，切下800bp大小的片段，用上海捷瑞的凝膠回收試劑盒純化回收的擴(kuò)增片段。將目的片段連接到pEASY-Blunt zero載體上,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得陽性克隆后進(jìn)行測(cè)序。
[0017]用Takara的BamH I和Xho I酶切測(cè)序正確的克隆，回收約800bp大小的片段，連接到BamH I和Xho I酶切的原核表達(dá)載體pET_30a中，得到PCNA_30a融合蛋白表達(dá)載體。該蛋白載體可在大腸桿囷中表達(dá)His融合蛋白。
[0018]實(shí)施例二:PCNA蛋白的表達(dá)和純化
將PCNA-30a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。挑取鑒定正確的目的克隆接種于LB培養(yǎng)基中，37°C在搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基中，至菌液0D600為0.6時(shí)，直接向菌液中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。8小時(shí)后，收集誘導(dǎo)后的菌體并進(jìn)行處理，對(duì)處理后的菌體蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，將膠分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用鼠源抗His的單克隆抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，帶6 X His標(biāo)簽的His-PCNA的Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。
[0019]用IL含PCNA_30a融合蛋白表達(dá)載體的大腸桿菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后4000g離心15分鐘，按照試劑盒說明書，用N1-NTA柱純化帶組氨酸標(biāo)簽的PCNA，洗脫的蛋白如圖
2。收集洗脫下的各蛋白餾分，再經(jīng)過一次FPLC Mono Q離子交換層析柱純化。平衡液含25mM Tris-HCl，PH 8.0, 5 mM DTT , I mM PMSF 和 0.2 mM EDTA。上樣后用 0-1 M Nacl 線性梯度洗脫，流速為5mL/min。SDS-PAGE鑒定純化效果。
[0020]實(shí)施例三:PCNAf禹連 CNBr-Activated Sepharose 4B 柱子的制備
配置 5 mg/mL PCNA 溶于耦連緩沖液(含 0.5M NaCl 的 0.1M Na⑶3，PH 8.3)。ImM的HCl溶脹CNBr-Activated Sepharose 4B凍干粉。將含PCNA的耦連溶液和溶脹的CNBr-Activated Sepharose 4B混合2小時(shí)；加入pH8.0、1M的乙醇胺以消除殘余活性基團(tuán)，裝柱。用含有0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液(PH 4.5)和耦連緩沖液交替洗滌耦連介質(zhì)3次。
[0021]實(shí)施例四:質(zhì)譜鑒定與PCNA互相作用的蛋白
野生型的AcMNPV感染SF9細(xì)胞96小時(shí)后，收集細(xì)胞總蛋白。經(jīng)過超聲裂解、4°C下IOOOOg高速離心后，取上清，用細(xì)胞裂解液(20 mM Tris-Cl，ρΗ7.8，0.5 mM EGTA，I mMEDTA, I mM MgC12, 50 mM NaCl, 10%甘油，蛋白酶抑制劑)裂解。
[0022]將制備的細(xì)胞裂解物上柱。以含0.1%的Triton X-100的提取液洗脫，吸收峰回到基線后，用I M NaCl的提取液洗脫；吸收值回到基線后，改為PH5.0、50 mM的醋酸鈉洗脫。
[0023]將洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳，12%分離膠分離結(jié)合蛋白。用手術(shù)刀將膠均勻切割成多個(gè)條帶，每個(gè)條帶經(jīng)酶切消化后，通過ABI 4800 MALDI TOF/ TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，鑒定各片段的分子質(zhì)量，利用Mascot軟件搜索比對(duì)最新的NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫以鑒定目的蛋白，查找出與PCNA互相作用的蛋白，比對(duì)到多個(gè)蛋白，其中的肽指紋圖譜如圖3所示。
【權(quán)利要求】
1.一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于查找與AcMNPV即苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的PCNA即增殖細(xì)胞核抗原相互作用蛋白的方法，具體包含以下幾個(gè)步驟: 步驟一，克隆所述AcMNPV的PCNA基因連接到表達(dá)載體中；所述PCNA基因?yàn)镚enBankID =1403881 ； 步驟二,在大腸桿菌B121中表達(dá)PCNA蛋白，通過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱純化，得到PCNA高純蛋白； 步驟三,利用所述PCNA高純蛋白與CNBr-Activated Sepharose 4B稱連,制備PCNA親和層析柱； 步驟四，在所述AcMNPV病毒感染SF9細(xì)胞后，收集感染后的總蛋白，經(jīng)過PCNA親和層析柱洗脫，SDS-PAGE鑒定洗脫組分，質(zhì)譜鑒定與PCNA相互作用的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于所述的PCNA基因是用以下引物擴(kuò)增得到的:
正向?yàn)?5’ -CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAAITT-3’ ；
反向?yàn)?5’ -CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3。
3.如權(quán)利要求1所述的一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于步驟二中所述的純化，具體過程為:收集的經(jīng)超聲波裂解、高速離心后含表達(dá)了 PCNA蛋白的上清，經(jīng)過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱分離純化出高純度的PCNA聞純蛋白?！?br> 4.如權(quán)利要求1所述的一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于步驟三中所述親和層析柱的具體制備過程為: 過程一，如步驟二所述制備PCNA高純蛋白； 過程二，制備親和層析介質(zhì):耦連緩沖液，含有0.5M NaCl的pH8.3 0.1M NaC03 ;稱取CNBr-Activated Sepharose 4B凍干粉放置在ImM HCl中懸浮溶脹，放置大約30分鐘后，棄濾液，用約15倍膠體積的I mM HCl溶液沖洗干凈；加入PCNA的含量為2 mg/ml的耦連緩沖液，4°C，過夜；將反應(yīng)完洗滌過的凝膠懸浮到水中，加入IM乙醇胺，在常溫最少攪拌反應(yīng)2小時(shí)，以消除殘余活性基團(tuán)；用含有0.5M NaCl的0.1M PH為4.0的醋酸鹽緩沖液和含有0.5M NaCl的0.1M PH為8的Tris-HCl緩沖液交替洗滌，重復(fù)洗滌3次即得親和層析柱。
5.如權(quán)利要求1所述的一種查找與桿狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于步驟四中所述的質(zhì)譜鑒定是指:將細(xì)胞總蛋白過PCNA親和層析柱后，跑SDS-PAGE凝膠電泳，復(fù)合物中的各個(gè)蛋白被分開，切膠、胰酶消化后，通過ABI 4800 MALDI TOF/ TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，鑒定各片段的分子質(zhì)量，利用Mascot軟件搜索比對(duì)最新的NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫以鑒定目的蛋白，查找出與PCNA互相作用的蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/34GK103713037SQ201310696294
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】陳慧卿, 周亞竟, 唐琦, 李梅, 黃國平, 李國輝, 麥維軍, 張春霞 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)