一種從米糠高溫粕中制備米糠多肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從米糠高溫粕中制備米糠多肽的方法，步驟如下：（1）堿提：將米糠高溫粕按照料液質(zhì)量比1:10～12加水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至11～11.5，于50℃堿提2h，離心得上清液，上清液pH值調(diào)至4.6，靜置1h，再次離心獲得米糠蛋白；（2）一次酶解：米糠蛋白加入適量水?dāng)嚢杈鶆颍{(diào)節(jié)pH至6.8～7.0，加熱至50℃至米糠蛋白全部溶解，加入適量風(fēng)味蛋白酶于50～55℃酶解2.5～3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8～7.0，滅酶離心獲得一次酶解上清液；（3）二次酶解：一次酶解上清液調(diào)pH值至堿性，加入堿性蛋白酶于50～60℃酶解2.5～3h，酶解過程中維持酶解液pH值呈堿性，滅酶離心獲得二次酶解上清液；（4）濃縮和干燥。該方法制備的米糠多肽氨基酸種類豐富，提取率高，雜質(zhì)含量低，溶解度高。
【專利說明】一種從米糠高溫粕中制備米糠多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備多肽的方法，具體的說是涉及一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]米糠高溫柏是米糠經(jīng)過高溫提油后的產(chǎn)物，因受高溫影響，其可溶性蛋白的含量減少，導(dǎo)致了其提取率的減小，且提取的蛋白中雜質(zhì)較多，即蛋白含量不高，另外，提取的蛋白溶解度不高，而蛋白質(zhì)的溶解度影響其能否在食品中得到廣泛應(yīng)用的重要因素之一。為充分利用米糠高溫柏資源，進(jìn)一步提高米糠蛋白溶解性，強(qiáng)化其功能特性，拓寬其在食品中的應(yīng)用，宜利用米糠高溫柏制備米糠多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法提取率低，且提取的多肽雜質(zhì)多及溶解度不高的不足，提供一種新的從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法。該方法利用風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶分步水解，制備氨基酸種類豐富和營養(yǎng)全面的米糠多肽，提取率高，獲 得的米糠多肽中雜質(zhì)含量低，溶解度高，能廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域中。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0006](I)堿提:將米糠高溫柏按照料液質(zhì)量比1:10~12加水?dāng)嚢杈鶆颍{(diào)節(jié)pH至11~11.5，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，所述上清液pH值調(diào)至4.6，靜置lh，再次離心，去除上清液獲得米糖蛋白；
[0007](2 )一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至6.8~
7.0，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入適量風(fēng)味蛋白酶于50~55°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8~7.0，酶解結(jié)束后滅酶，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液；
[0008](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調(diào)pH值至堿性，加入堿性蛋白酶于50~60°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值呈堿性,酶解完成后滅酶,然后離心去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0009](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液進(jìn)行脫鹽處理后，然后經(jīng)過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0010]作為優(yōu)選，步驟(2)中米糠蛋白(以干基計(jì))與水的質(zhì)量比為:1:2，風(fēng)味蛋白酶的添加量為米糠蛋白干基質(zhì)量的0.5%，風(fēng)味蛋白酶的活性為20000U/g。
[0011]作為優(yōu)選，步驟(3) 二次酶解中堿性蛋白酶的添加量為米糠蛋白干基質(zhì)量的0.28%，堿性蛋白酶的活性為20萬U/g。
[0012]更優(yōu)選，步驟(3)中二次酶解的溫度為54°C，pH為9.4，酶解時(shí)間為3.0h。pH對(duì)酶反應(yīng)的影響，主要表現(xiàn)對(duì)在酶活力的影響，過酸或過堿都會(huì)影響其活性，發(fā)明人經(jīng)過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)二次酶解的PH值從8到9.5時(shí)，酶解效率漸高，再增大pH值，其酶解效率反而降低，這表面堿性蛋白酶顯著的酶活性只發(fā)生在非常窄的PH值范圍內(nèi)，堿性蛋白酶和底物的蛋白質(zhì)都含有解離基團(tuán)，只有這些解離基團(tuán)處于特定的解離狀態(tài)時(shí)，堿性蛋白酶與底物蛋白才結(jié)合最快，生成產(chǎn)物的速度最快，體系的PH值直接影響著酶和底物蛋白質(zhì)分子的某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，只有在特定的PH值條件下，酶和底物蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才處于結(jié)合和轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的最佳解離狀態(tài)，本發(fā)明確定的最佳二次酶解pH值為9.4，此時(shí)堿性蛋白酶對(duì)米糠蛋白底物的酶解效率最高。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(2) —次酶解中滅酶溫度為90°C，時(shí)間為lOmin，離心的轉(zhuǎn)速為4000~4500rpm,離心時(shí)間為20~25min。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(3) 二次酶解中滅酶溫度為85，°C時(shí)間為lOmin，離心的轉(zhuǎn)速為4000~4500rpm,離心時(shí)間為10~15min。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
[0016]( I)本發(fā)明先通過堿溶酸沉獲得米糠蛋白，然后進(jìn)一步通過雙酶法酶解米糠蛋白制備米糠多肽，工藝設(shè)計(jì)合理，反應(yīng)條件溫和，具有酶解效率高，米糠多肽產(chǎn)率高、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0017](2)本發(fā)明利用雙酶法制備的米糠多肽氨基酸種類豐富，含有17種氨基酸，除去色氨酸(檢測(cè)時(shí)被破壞)，還含有另外7中必需氨基酸，且其第一限制性氨基酸賴氨酸含量很好，占總氨基酸含量的7.2%， 蛋氨酸和半胱氨酸含量也占氨基酸總量的6.7%，營養(yǎng)價(jià)值十分豐富。
[0018](3)本發(fā)明利用雙酶法制備的米糠多肽的分子量主要集中在180Da~500Da之間，占全部米糠多肽的50.38%左右；分子量500Da~1000Da之間的多肽占全部米糠多肽的21.25%左右，米糠多肽的分子量小，吸收利用率高，進(jìn)一步強(qiáng)化了米糠多肽的營養(yǎng)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明，各實(shí)施例使用的儀器設(shè)備均系市購常規(guī)設(shè)備，各實(shí)施例所使用的試劑均系市購常規(guī)試劑。
[0020]堿性蛋白酶酶活:20萬U/g ;風(fēng)味蛋白酶酶活:20000U/g。
[0021]米糠多肽分子量測(cè)定方法:采用Waters600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測(cè)器、Empower工作站和GPC軟件)，對(duì)制備的米糠多肽的分子量分布進(jìn)行測(cè)定:色譜柱選用TSKgel2000SWXL300mmX7.8_，流動(dòng)相:乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1 (V/V)，檢測(cè)波長:220nm，流速:0.5mL/min ;柱溫:30°C，進(jìn)樣體積:10μ I。以細(xì)胞色素C (Mwl2500);桿菌酶(Mwl450);乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw451);乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mwl89)為分子量參照物。
[0022]( I)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0023]以上述4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)的IgMw遷移率圖，即分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立線性回歸方程。
[0024](2)米糠多肽分子量分布測(cè)定
[0025]采用HPLC測(cè)定其分子量分布，測(cè)定條件及樣品制備同上。測(cè)定出的分子質(zhì)量分布圖結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線用GPC軟件進(jìn)行分析，以不同分子量范圍內(nèi)的峰面積百分比為該分子量分布范圍內(nèi)多肽所占的百分比。
[0026]米糠多肽氨基酸含量測(cè)定:中國農(nóng)業(yè)科研院油料作物研究所測(cè)試中心。
[0027]實(shí)施例1~3所使用的原料:米糠高溫柏的蛋白質(zhì)含量79.56%，水分含量7.55%，灰分含量1.79%ο
[0028]實(shí)施例1:
[0029]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0030](1)堿提:將米糠高溫柏按照料液質(zhì)量比1:10加水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至11，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，離心的轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時(shí)間為25min，所述上清液pH值調(diào)至4.6,靜置Ih,再次以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心25min,去除上清液獲得米糠蛋白；
[0031 ] (2) 一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水?dāng)嚢杈鶆颍沟妹卓返鞍椎馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%，調(diào)節(jié)pH至6.8，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白質(zhì)量
.0.5%的風(fēng)味蛋白酶于50°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8，酶解結(jié)束后于90°C滅酶lOmin，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液，離心的轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時(shí)間為25min ；
[0032](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調(diào)pH值至9.0，加入米糠蛋白質(zhì)量
0.2%的堿性蛋白酶于50°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值9.0,酶解完成后于85°C滅酶lOmin，然后在轉(zhuǎn)速為4000rpm條件下離心IOmin去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0033](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液過陰陽離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽處理后，然后經(jīng)過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0034]實(shí)施例2:
[0035]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0036](1)堿提:將米糠高溫柏按照料液質(zhì)量比1:12加水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至11.5，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，離心的轉(zhuǎn)速為4500rpm，離心時(shí)間為20min，所述上清液pH值調(diào)至4.65，靜置lh，再次以4500rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，去除上清液獲得米糠蛋白；
[0037](2) 一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水?dāng)嚢杈鶆?，使得米糠蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%，調(diào)節(jié)pH至7.0，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白質(zhì)量
0.5%的風(fēng)味蛋白酶于55°C酶解2.5h，酶解過程中維持酶解液pH值7.0，酶解結(jié)束后于90°C滅酶lOmin，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液，離心的轉(zhuǎn)速為4500rpm，離心時(shí)間為20min ；
[0038](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調(diào)pH值至10.0，加入米糠蛋白質(zhì)量0.3%的堿性蛋白酶于60°C酶解2.5h，酶解過程中維持酶解液pH值10.0,酶解完成后于85°C滅酶lOmin，然后在轉(zhuǎn)速為4500rpm條件下離心15min去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0039](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液過陰陽離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽處理后，然后經(jīng)過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0040]實(shí)施例3:
[0041]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0042](1)堿提:將米糠高溫柏按照料液質(zhì)量比1:11加水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至11.2，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，離心的轉(zhuǎn)速為4200rpm，離心時(shí)間為22min，所述上清液pH值調(diào)至4.62，靜置lh，再次以4200rpm的轉(zhuǎn)速離心21min，去除上清液獲得米糠蛋白；
[0043](2) 一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水?dāng)嚢杈鶆?，使得米糠蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%，調(diào)節(jié)pH至6.9，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白質(zhì)量
0.5%的風(fēng)味蛋白酶于52°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.9，酶解結(jié)束后于90°C滅酶lOmin，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液，離心的轉(zhuǎn)速為4200rpm，離心時(shí)間為25min ；
[0044](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調(diào)pH值至9.4，加入米糠蛋白質(zhì)量
0.28%的堿性蛋白酶于54°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值9.4，酶解完成后于85°C滅酶lOmin，然后在轉(zhuǎn)速為4300rpm條件下離心12min去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0045](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液過陰陽離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽處理后，然后經(jīng)過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0046]實(shí)施例1~3制得的米糠多肽的分子量分布見表1。
[0047]表1米糠多肽的分子量分布
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟: (O堿提:將米糠高溫柏按照料液質(zhì)量比1:10~12加水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)pH至11~11.5，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，所述上清液pH值調(diào)至4.6，靜置lh，再次離心，去除上清液獲得米糖蛋白； (2)—次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水?dāng)嚢杈鶆颍{(diào)節(jié)pH至6.8~7.0，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入適量風(fēng)味蛋白酶于50~55°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8~7.0，酶解結(jié)束后滅酶，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液； (3)二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調(diào)pH值至堿性，加入堿性蛋白酶于50~60°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值呈堿性，酶解完成后滅酶，然后離心去除沉淀，獲得二次酶解上清液； (4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液進(jìn)行脫鹽處理后，然后經(jīng)過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(2)中米糖蛋白(以干基計(jì))與水的質(zhì)量比為:1:2,風(fēng)味蛋白酶的添加量為米糖蛋白干基質(zhì)量的0.5%，風(fēng)味蛋白酶的活性為20000U/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(3) 二次酶解中堿性蛋白酶的添加量為米糠蛋白干基質(zhì)量的0.2~0.3%，堿性蛋白酶的活性為20萬U/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(3)中二次酶解的溫度為54°C，pH為9.4、加酶量為0.28%，酶解時(shí)間為3.0h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(2) —次酶解中滅酶溫度為90°C，時(shí)間為lOmin，離心的轉(zhuǎn)速為4000~4500rpm，離心時(shí)間為20~25min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(3) 二次酶解中滅酶溫度為85°C，時(shí)間為lOmin，離心的轉(zhuǎn)速為4000~4500rpm，離心時(shí)間為10~15min。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103627767SQ201310634437
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】何東平, 姚行權(quán), 胡傳榮, 姚行江, 張世宏, 鄒翀, 尤夢(mèng)圓, 吳建寶, 劉京偉 申請(qǐng)人:衢州劉家香食品有限公司