一種有效快速提取海洋微藻rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法，其步驟如下：將液氮研磨后的微藻樣品加入到溫度為60-65℃的十六烷基三甲基溴化銨和β-巰基乙醇的混合提取液中，再在60-65℃加熱；加熱結(jié)束后再加入氯仿、異戊醇混合液，混合后離心；取上清液后再次加入氯仿、異戊醇混合液；混合后離心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80℃條件下沉淀，再離心去除上清液，將沉淀用75％的乙醇洗滌1-2次，待乙醇揮發(fā)完全后加入DEPC水溶解完成提取；其中β-巰基乙醇是在使用的時(shí)候才與十六烷基三甲基溴化銨混合制成混合提取液。本發(fā)明克服了海洋微藻含鹽量高和所含糖類物質(zhì)較多對(duì)提取植物RNA的影響，較市場(chǎng)上的植物RNA提取試劑盒提取效果更好，不出現(xiàn)雜帶，操作步驟簡(jiǎn)便、快速、效果好。
【專利說(shuō)明】一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻開(kāi)發(fā)利用【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種有效快速的提取海洋微藻【背景技術(shù)】
[0002]海洋微藻是水體生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者，占海洋生物物種的40.86%，有體積小、數(shù)量大、細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、生物量大、光合效率高、適應(yīng)力強(qiáng)、不受氣候限制、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此受到了人們的廣泛關(guān)注。微藻中所含有的微藻油脂、多糖、色素等在水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、能源、醫(yī)藥、保健品、化工和環(huán)保等方面具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此開(kāi)發(fā)和利用海洋微藻具有重要的意義。而且，微藻中含有大量與有效活性成分相關(guān)的基因，因此提取其RNA,再反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因的方法對(duì)于研究相關(guān)基因提供了有效途徑。但由于海洋微藻含鹽量高和糖類物質(zhì)較多等特點(diǎn)，采用提取動(dòng)物RNA和陸生植物RNA的試劑盒效果不夠理想。因此，開(kāi)發(fā)出一種快速高效提取海洋微藻RNA的新方法是十分必要的。
[0003]目前市場(chǎng)上還沒(méi)有專門(mén)針對(duì)海洋微藻的RNA提取試劑盒，而采用已有的植物RNA提取試劑盒的提取效果并不好。原因可能是由于海洋微藻含鹽量高和所含糖類物質(zhì)較多，從而影響其RNA的提取效果。且現(xiàn)有的方法大都操作步驟繁瑣、需要時(shí)間較長(zhǎng)、價(jià)格較高，而且電泳結(jié)果中有雜帶。因此，有必要提供一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)并且效果好的提取海洋微藻RNA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法，使提取微藻RNA步驟簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0005]本發(fā)明的提取海洋微藻RNA的方法，其步驟如下:將液氮研磨后的微藻樣品加入到溫度為60-65°C的十六烷基`三甲基溴化銨和β -巰基乙醇的混合提取液中，再在60-65°C加熱；加熱結(jié)束后再加入氯仿、異戊醇混合液，混合后離心；取上清液后再次加入氯仿、異戊醇混合液；混合后離心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80°C條件下沉淀，再離心去除上清液，將沉淀用75 %的乙醇洗滌1-2次，待乙醇揮發(fā)完全后加入DEPC水溶解完成提取；其中β-巰基乙醇是在使用的時(shí)候才與十六烷基三甲基溴化銨混合制成混合提取液。
[0006]上述混合提取液中十六烷基三甲基溴化銨和β -巰基乙醇體積比為60:1。
[0007]上述的氯仿、異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0008]本發(fā)明克服了海洋微藻含鹽量高和所含糖類物質(zhì)較多對(duì)提取植物RNA的影響，較市場(chǎng)上的植物RNA提取試劑盒提取效果更好，不出現(xiàn)雜帶，操作步驟簡(jiǎn)便、快速、效果好。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面對(duì)本發(fā)明快速高效的提取海洋微藻RNA的方法做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0010]首先所有試劑瓶均需進(jìn)行DEPC與超純水的混合溶液進(jìn)行滅菌，兩者的體積比為1:1000，滅菌條件為37°C搖床中滅菌24h，目的是去除環(huán)境中的RNA酶，防止提取的目的RNA被降解；其次在1.5ml離心管中加入600 μ I十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和ΙΟμΙβ-巰基乙醇，β-巰基乙醇必須現(xiàn)用現(xiàn)加，原因是巰基乙醇是一種還原劑，可降低氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷，若提前加入則沒(méi)有還原作用，在60-65°C的水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱。與此同時(shí)將離心好的新鮮藻體放入液氮中，待藻體可以固體狀態(tài)取出后，倒出研磨，研磨過(guò)程保持一直有液氮，研磨過(guò)程防止進(jìn)濺而造成樣品損失。將研磨后的微藻樣品放入預(yù)熱好的離心管中，加熱lOmin，每隔2min搖勻I次；再加入等體積的氯仿/異戊醇(24:I)，渦旋混合后，在4°C條件下進(jìn)行離心(12000rpm，IOmin);取上清液再次加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，渦旋混合后，在4°C條件下進(jìn)行離心(12000rpm，IOmin);取上清液放入新的離心管中，加入IOmol / L的LiCl，使其終濃度為2mol / L ;放入_80°C條件下沉淀lh，在4°C條件下進(jìn)行離心(12000rpm, 30min),去除上清液,用75%的乙醇洗漆2次,帶其揮發(fā)完全后加入30 μ IDEPC水溶解10-20min ;測(cè)定其純度，準(zhǔn)備進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。整個(gè)過(guò)程樣品應(yīng)始終在碎冰中，操作者帶口罩和手套，防止RNA降解。
[0011]實(shí)施例1
[0012]首先在1.5ml離心管中用移液槍加入600 μ I十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和10μ 1β-巰基乙醇，在60-65°C的水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱；其次離心0.5g新鮮藻體(球等鞭金藻、綠色巴夫藻、小球藻、杜氏鹽藻以及三角褐指藻)放入液氮中，待藻體可以固體狀態(tài)取出后，倒出研磨，將研磨后的微藻樣品放入預(yù)熱好的離心管中，加熱IOmin ;用移液槍再加入610 μ I的氯仿/異戊醇(24:1)，渦旋混合后，在4°C條件下進(jìn)行離心(12000rpm，IOmin);取上清液500 μ I再次加入500 μ I的氯仿/異戊醇(24:1)，渦旋混合后，在4°C條件下進(jìn)行離心(12000rpm, IOmin);取上清液400 μ I放入新的離心管中，加入100 μ I的IOmol / L的LiCl，使其終濃度為2mol / L ;放入_80°C條件下沉淀lh，在4°C條件下進(jìn)行離心(12000rpm，30min)，去除上清液，用75 %的乙醇洗滌2次，帶其揮發(fā)完全后加入30 μ IDEPC水溶解10-20min，完成RNA的提取。
[0013]采用NanoDrop2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA純度和濃度，RNA純度為 1.868，濃度為 1070ng/y I。
[0014]一般RNA純度均保持在1.8-2.0的有效區(qū)間范圍內(nèi)。若實(shí)驗(yàn)開(kāi)始未在水浴鍋中進(jìn)行加熱，其純度往往偏高在2.1左右并且RNA的濃度與加熱后相比較而言要降低50%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法，其步驟如下:將液氮研磨后的微藻樣品加入到溫度為60-65°C的十六烷基三甲基溴化銨和β -巰基乙醇的混合提取液中，再60-65°C加熱；加熱結(jié)束后再加入氯仿、異戊醇混合液，混合后離心；取上清液后再次加入氯仿、異戊醇混合液；混合后離心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80°C條件下沉淀，再離心去除上清液，將沉淀用75%的乙醇洗滌1-2次，待乙醇揮發(fā)完全后加入DEPC水溶解完成提??；其中β-巰基乙醇是在使用的時(shí)候才與十六烷基三甲基溴化銨混合制成混合提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合提取液中十六烷基三甲基溴化銨和β -巰基乙醇的體積比為60:1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的氯仿、異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為 24 =10
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103602667SQ201310590700
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】苗強(qiáng) 申請(qǐng)人:威海市宇王集團(tuán)有限公司