一種以五倍子單寧為原料利用發(fā)酵分離耦合技術制備沒食子酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種以五倍子單寧為原料利用發(fā)酵分離耦合技術制備沒食子酸的方法。本發(fā)明目的在于提高底物五倍子單寧的生物轉化率，解決環(huán)境污染，產(chǎn)量損失等問題，為工業(yè)化研究提供基礎。本發(fā)明提供了一種以五倍子單寧為原料，通過液態(tài)發(fā)酵耦合膜分離技術制備沒食子酸的方法。包括酶種培養(yǎng)、發(fā)酵制酶、發(fā)酵制酸、菌體分離、膜分離、重結晶等步驟。本發(fā)明是沒食子酸生產(chǎn)的清潔工藝路線，采用發(fā)酵法代替?zhèn)鹘y(tǒng)酸水解，同時結合膜分離技術回收未反應的五倍子單寧。整個工藝成本低，不污染環(huán)境，底物轉化率提高至93%，沒食子酸收率增大了30%。
【專利說明】一種以五倍子單寧為原料利用發(fā)酵分離耦合技術制備沒食子酸的方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種利用液態(tài)發(fā)酵耦合膜過濾技術制備沒食子酸的新方法，采用液態(tài)發(fā)酵工藝取代傳統(tǒng)酸、堿水解工藝來完成沒食子酸的制備，再采用超濾分離技術進一步純化沒食子酸，回收未發(fā)酵的五倍子單寧，進一步發(fā)酵制備沒食子酸。
【背景技術】:
[0002]沒食子酸具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等作用，可出口創(chuàng)匯，深受國內(nèi)外許多消費者的喜愛，有良好的發(fā)展前景。
[0003]現(xiàn)有制備沒食子酸的工藝主要包括化學法和生物法。生物法中發(fā)酵法存在的主要問題是:生物酶的形成和單寧的水解反應周期長(3天以上)，底物五倍子單寧轉化不完全，殘留達15-20%。殘留的底物若不除去則會影響后續(xù)沒食子酸的濃縮分離。傳統(tǒng)分離底物和沒食子酸的方法為樹脂吸附法，但樹脂會吸附一部分沒食子酸，造成產(chǎn)量損失，而且樹脂的處理需消耗大量的酸堿試劑，會對環(huán)境造成二次污染。
[0004]目前國內(nèi)制備沒食子酸的原料五倍子單寧貨源緊張，提高底物轉化率和產(chǎn)品總收率，避免環(huán)境污染是急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
: [0005]本發(fā)明目的在于提高底物五倍子單寧的生物轉化率，解決環(huán)境污染，產(chǎn)量損失等問題，為工業(yè)化研究提供基礎。
[0006]經(jīng)過反復試驗，長期研究，對傳統(tǒng)的沒食子酸生產(chǎn)工藝進行了創(chuàng)新。將傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝拆分成兩個階段，即生物催化劑的制備(發(fā)酵制酶)和生物轉化(發(fā)酵制酸)。根據(jù)超濾膜片的物理化學性質(zhì)，結合沒食子酸和五倍子單寧分子量大小，將膜法分離與發(fā)酵耦合，篩選出合適的膜片，完成本發(fā)明。
[0007]—種以五倍子單寧為原料利用發(fā)酵分離耦合技術制備沒食子酸的方法，其特征在于:包括以下步驟:斜面培養(yǎng)制得單寧酶，以五倍子提取液為原料，用單寧酶進行發(fā)酵制酸；將發(fā)酵液離心或板框過濾得到?jīng)]食子酸發(fā)酵清液、調(diào)PH值至中性，將發(fā)酵液超濾、濃縮、干燥、重結晶制得沒食子酸。
[0008]得到?jīng)]食子酸發(fā)酵清液后，沒食子酸發(fā)酵清液透過0.22 μ m濾膜，進行預處理，在20-30°C，過濾后將清液倒入過濾裝置中的原料罐進行超濾；采用恒容滲濾的工作方式，選擇膜片截留分子量為l-5KDa的超濾膜，工作壓力為100-300psi ;循環(huán)超濾至滲透液體積為清液總體積的70-90%時，停止超濾，收集沒食子酸透過液。
[0009]進一步，向原料罐中加入與透過液體積相等的去離子水，保持清液總體積不變；繼續(xù)超濾，收集透過液，與之前的透過液合并，重復此過程4-8次。
[0010]此項沒食子酸制備方法可以按下述步驟進行:
[0011](I)酶種培養(yǎng):配制產(chǎn)單寧酶菌株的種子培養(yǎng)基，滅菌待用。從斜面保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌種接入到種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:溫度為25-40°C，初始pH為4-7，轉速為100-300rmp，培養(yǎng)時間為8_16h，此時細胞干重為6_12g/L。
[0012](2)發(fā)酵制酶:配制發(fā)酵制酶培養(yǎng)基，滅菌待用。將培養(yǎng)好的種子液泵入到發(fā)酵罐中，接種體積為發(fā)酵體積的5-15%，維持發(fā)酵罐內(nèi)溫度在25-35°C，pH在4.0-6.0 ;控制通氣量為 l-4vvm，轉速為 100-250rpm，發(fā)酵 18h_30h。
[0013](3)發(fā)酵制酸:配制發(fā)酵制酸培養(yǎng)基滅菌待用，將發(fā)酵制酶階段的發(fā)酵液泵入到發(fā)酵罐中，接種體積為發(fā)酵體積的5-15%，維持發(fā)酵罐內(nèi)溫度25-35°C，pH在4.0-6.0 ;在發(fā)控制通氣量為l_4vvm,轉速為300-500rpm, 20h-40h后發(fā)酵結束；收集發(fā)酵液,離心或板框過濾，得到?jīng)]食子酸發(fā)酵清液。調(diào)至PH值為中性。
[0014](4)沒食子酸與五倍子單寧的膜分離:對(3)中的發(fā)酵液進行預處理，用0.22μπι濾膜過濾后，將發(fā)酵液在20-30°C恒溫下，充入過濾裝置。優(yōu)選截留分子量為l_5KDa的超濾膜，工作壓力為100-300psi，對發(fā)酵液進行恒容超濾。超濾至滲透液體積為原發(fā)酵液總體積的70-90%時，停止超濾，收集沒食子酸透過液。
[0015]向原料罐中加入去離子水，保持原發(fā)酵液總體積不變，繼續(xù)超濾。重復此過程4-8次后，收集原料罐里剩余的液體(未發(fā)酵的底物)，重新進行發(fā)酵。
[0016]整個過程生產(chǎn)成本低，底物轉化率從75-85%提高至93%，沒食子酸總收率80_90%，比傳統(tǒng)發(fā)酵法提高了 30%，無需使用酸堿再生劑，實現(xiàn)了高效、無污染的目標。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1本發(fā)明流程示意圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施實例對本發(fā)明進行進一步的描述，但下述實例并非用來限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實施實例1.在發(fā)酵罐中制備沒食子酸
[0020]搖瓶種子培養(yǎng)基在115°C的條件下蒸汽滅菌30min。待搖瓶內(nèi)種子培養(yǎng)基的溫度降至30-35°C時，從斜面培養(yǎng)基上挑取2環(huán)發(fā)酵菌種接入到搖瓶中進行種子培養(yǎng)。
[0021]斜面培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g，NaN0s3g, KC10.5g，MgS04.7H200.5g，F(xiàn)eSO4.H2O0.01g, K2PO4Ig,瓊脂 2%。加 IL 去離子水溶解，調(diào) pH 至 6.0。
[0022]種子培養(yǎng)基成分為:硫酸銨Ig/L, KH2PO41g/L, MgS047H200.5g/L, ZnSO40.3g/L，酵母膏 0.5g/L,鹿糖 10g/L，單寧酸 100g/Lo
[0023]發(fā)酵制酶過程:將發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵制酶培養(yǎng)基在115°C的條件下蒸汽滅菌30min。待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基的溫度降至30-35°C，將種子液接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%(v/v)，控制通氣量為2vvm，轉速為100-250rpm，30°C進一步培養(yǎng)24h，此時細胞干重可以達到10g/L。
[0024]發(fā)酵制酶培養(yǎng)基成分為:硫酸銨lg/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H200.5g/L，ZnSO40.3g/L，酵母膏0.5g/L,鹿糖lOg/L,五倍子單寧100g/L。
[0025]發(fā)酵制酸過程:將發(fā)酵制酶過程培養(yǎng)好的發(fā)酵液泵入到發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵制酸，接種量為10% (v/v)，維持發(fā)酵罐內(nèi)溫度30°C ;流加lOmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定在
4.5，通氣量2vvm，轉速為350rpm，發(fā)酵28h。由于五倍子單寧在高溫下會水解，因此五倍子單寧應在滅菌后加入。
[0026]發(fā)酵制酸培養(yǎng)基成分為:硫酸銨I g/L, KH2PO41 g/L, MgS047H200.5g/L, ZnSO40.3g/L，酵母膏0.5g/L，單寧酸100g/L。
[0027]對所得發(fā)酵液進行測定，此時五倍子單寧轉化率在80%。
[0028]實施實例2.膜法回收五倍子單寧
[0029]將離心或過濾后的發(fā)酵液加10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0。對發(fā)酵液進行預處理，過0.22 μ m濾膜，過濾后將發(fā)酵液在25 °C恒溫下，充入過濾裝置。
[0030]沒食子酸和五倍子單寧的相對分子質(zhì)量分別是170、1700g/mol,選用超濾膜,米用恒容滲濾的工作方式，工作壓力為lOOpsi，轉速400rpm對其進行分離。每次操作至滲透液體積為料液總體積的90%時，停止超濾，收集透過液。
[0031]向原料罐中加入與透過液體積相等的去離子水，保持發(fā)酵液總體積不變。繼續(xù)超濾，收集透過液，與之前的透過液合并，待測，重復此過程4-5次。
[0032]選用IKDa超濾膜進行操作，沒食子酸可以完全與未發(fā)酵的五倍子單寧分離開來；
[0033]選用3KDa超濾膜操作時，97%沒食子酸能夠得到分離；
[0034]選用5KDa超濾膜分離過濾后，94%的沒食子酸能夠得到分離。
[0035]回收發(fā)酵未轉化的五倍子單寧，進一步循環(huán)發(fā)酵，五倍子單寧的轉化率從80%提高至93%。
[0036]膜分離后沒食子酸存在于透過液部分，濃縮結晶，得到的沒食子酸，產(chǎn)品總收率提高至86%。
【權利要求】
1.一種以五倍子單寧為原料利用發(fā)酵分離耦合技術制備沒食子酸的方法，其特征在于:包括以下步驟:斜面培養(yǎng)制得單寧酶，以五倍子提取液為原料，用單寧酶進行發(fā)酵制酸；將發(fā)酵液離心或板框過濾得到?jīng)]食子酸發(fā)酵清液、調(diào)PH值至中性，將發(fā)酵液超濾、濃縮、干燥、重結晶制得沒食子酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:得到?jīng)]食子酸發(fā)酵清液后，沒食子酸發(fā)酵清液透過0.22 μ m濾膜，進行預處理，在20-30°C，過濾后將清液倒入過濾裝置中的原料罐進行超濾；采用恒容滲濾的工作方式，選擇膜片截留分子量為l_5KDa的超濾膜，工作壓力為100-300psi ;循環(huán)超濾至滲透液體積為清液總體積的70-90%時，停止超濾，收集沒食子酸透過液。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:向原料罐中加入與透過液體積相等的去離子水，保持清液總體積不變；繼續(xù)超濾，收集透過液，與之前的透過液合并，重復此過程4-8 次。`
【文檔編號】C12P7/42GK103589758SQ201310557351
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權日:2013年11月12日
【發(fā)明者】袁其朋, 陳琦, 姚旭, 張基明, 胡敬, 王石發(fā), 李迅, 谷文 申請人:遵義市倍緣化工有限責任公司