一種抗生素pc190723抗性基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗生素PC190723抗性基因，其特征在于：其核苷酸序列為：（1）、序列表中SEQIDNo.2中核苷酸序列；（2）、與（1）中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；（3）、對(duì)上述1）或2）所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；（4）、與（1）中所示的核苷酸序列編碼相同蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還提供上述抗性基因的應(yīng)用。當(dāng)超表達(dá)本發(fā)明的抗性基因時(shí)可以幫助放線菌（例如ArthrobacterstrainA3）生存在含有PC190723的培養(yǎng)基中。因此利用該抗生素抗性基因可以構(gòu)建出許多方便分子生物學(xué)研究與醫(yī)藥開(kāi)發(fā)使用的商業(yè)化載體，具有很好的推廣使用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—種抗生素PC190723抗性基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗生素PC190723抗性基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大多數(shù)細(xì)菌都以二分裂方式進(jìn)行分裂繁殖。在細(xì)菌細(xì)胞正常分裂時(shí)，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁在細(xì)菌中部?jī)?nèi)陷并在兩個(gè)新復(fù)制的染色體間形成環(huán)狀復(fù)合物，膜結(jié)構(gòu)的肽聚糖隨后水解將細(xì)胞一份為二。在這一過(guò)程中，F(xiàn)tsZ蛋白在GTP的參與下最早在細(xì)胞中部聚合成環(huán)狀骨架Z環(huán)，再與其他相關(guān)蛋白結(jié)合，從而引發(fā)并控制原核生物的細(xì)胞分裂過(guò)程。Z環(huán)位于細(xì)胞分裂處胞膜的內(nèi)表面，受到多種調(diào)控水平的調(diào)控，同時(shí)標(biāo)志著將來(lái)分裂的位置。
[0003]FtsZ是最保守的細(xì)菌分裂蛋白，幾乎存在于所有的細(xì)菌中。它由Rossmann折疊形成的N-端GTP酶區(qū)域和分支酸變位酶折疊的C-端GTP酶激活區(qū)域通過(guò)中心的螺旋H7和環(huán)T7相連接。FtsZ是人類微管蛋白的結(jié)構(gòu)相似物，有證據(jù)表明這兩種蛋白在進(jìn)化上具有相關(guān)性，不過(guò)只有10%-18%蛋白質(zhì)序列相似。人類微管蛋白已經(jīng)是用于抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)成熟祀點(diǎn)。然而，經(jīng)典的微管蛋白抑制劑如nocodazole和paclitaxel等不能顯著抑制 FtsZ聚合或GTP酶的活性。這表明，F(xiàn)tsZ和微管蛋白在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能等方面存在很大差異，有可能設(shè)計(jì)出選擇性抑制FtsZ而不抑制人類微管蛋白的化合物。同時(shí)FtsZ和人類微管蛋白的同源性也為設(shè)計(jì)選擇性抑制劑提供了有一個(gè)很好的切入點(diǎn)?；贔tsZ蛋白在細(xì)菌細(xì)胞分裂的重要作用，人們希望以它為靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)新型抗菌藥物。
[0004]隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及近期發(fā)展的細(xì)胞生物技術(shù)在細(xì)菌研究上的應(yīng)用，對(duì)于全新抗菌藥作用靶位點(diǎn)的研究取得了重要進(jìn)展。細(xì)胞分裂是細(xì)菌繁殖的基本過(guò)程，其中關(guān)鍵蛋白FtsZ作為一個(gè)具有潛力的藥物作用全新靶點(diǎn)，已有用于研發(fā)新型抗菌藥物的報(bào)道。
[0005]PC190723是一個(gè)于2008年報(bào)道的FtsZ抑制劑類抗生素。該抗生素是通過(guò)與FtsZ 結(jié)合抑制FtsZ聚合后的解聚過(guò)程，最終達(dá)到抑制細(xì)菌分裂的目的。該抗生素可以明顯抑制耐藥的金黃色葡萄球菌在小鼠體內(nèi)、體外的生長(zhǎng)，是一種新型有效的抗生素分子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建節(jié)桿菌超表達(dá)文庫(kù)，利用抗生素PC190723對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了一個(gè)該抗生素的抗性基因。當(dāng)超表達(dá)該抗性基因時(shí)可以幫助放線菌(例如 ArthrobacterstYain A3)生存在含有PC190723的培養(yǎng)基中。PC190723是細(xì)菌分裂過(guò)程中必須蛋白FtsZ的抑制劑，自2008發(fā)現(xiàn)至此尚未報(bào)道過(guò)該抗生素的抗性基因，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道該抗性基因。由于該抗性基因較短(900bp)，而對(duì)應(yīng)的抗生素較新，因此利用該抗生素抗性基因可以構(gòu)建出許多方便分子生物學(xué)研究與醫(yī)藥開(kāi)發(fā)使用的商業(yè)化載體。因而， 具有很好的推廣使用價(jià)值。
[0007]本發(fā)明提供一種抗生素PC190723抗性基因，其特征在于:其核苷酸序列為1)、序列表中SEQID N0.2中核苷酸序列；
2)、與(I)中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；
3)、對(duì)上述I)或2)所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；
4)、與(I)中所示的核苷酸序列編碼相同蛋白的核苷酸序列。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組蛋白，其由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼。
[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組菌，其含有權(quán)利要求2所述的重組蛋白。
[0010]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述的抗性基因、重組蛋白或重組菌在含抗生素 PC190723的培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
[0011]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為權(quán)利要求1所述的抗性基因在放線菌中表達(dá)后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中存活。
[0012]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為權(quán)利要求2所述的重組蛋白在放線菌中表達(dá)后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中存活。
[0013]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為權(quán)利要求3所述的重組菌能在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中存活。
[0014]優(yōu)選地，所述放線菌為節(jié)桿菌A3。
[0015]本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建`節(jié)桿菌超表達(dá)文庫(kù)，利用抗生素PC190723對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了一個(gè)該抗生素的抗性基因。當(dāng)超表達(dá)該抗性基因時(shí)可以幫助放線菌(例如 ArthrobacterstYain A3)生存在含有PC190723的培養(yǎng)基中。PC190723是細(xì)菌分裂過(guò)程中必須蛋白FtsZ的抑制劑，自2008發(fā)現(xiàn)至此尚未報(bào)道過(guò)該抗生素的抗性基因，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道該抗性基因。由于該抗性基因較短(900bp)，而對(duì)應(yīng)的抗生素較新，因此利用該抗生素抗性基因可以構(gòu)建出許多方便分子生物學(xué)研究與醫(yī)藥開(kāi)發(fā)使用的商業(yè)化載體。因而， 具有很好的推廣使用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面的實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0017]下述實(shí)施例中所用的方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0018]限制性內(nèi)切酶1、及麗TI，堿性磷酸酶，T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司； 節(jié)桿菌超表達(dá)載體pART2由Freiburg University的Cristinel Sandu教授惠贈(zèng)； 節(jié)桿菌 Arthrobacter strain A3 為市售；
DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。
[0019]實(shí)施例1節(jié)桿菌超表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建 1、節(jié)桿菌基因組隨機(jī)酶切
利用限制性內(nèi)切酶I IOU對(duì)75 i! g節(jié)桿菌總DNA在進(jìn)行隨機(jī)酶切15分鐘(50 U I 的體系為:NEBufferl.1 IOX h UNEB SauJAl I u I, DNA 44y L，反應(yīng)溫度為 37°C )，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離獲得大小在0.75-2kb隨機(jī)切碎的DNA片段，并通過(guò)DNA凝膠回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行濃縮回收。[0020]2、節(jié)桿菌超表達(dá)文庫(kù)質(zhì)粒的構(gòu)建
利用限制性內(nèi)切酶及麗TI IOU對(duì)25 ii g節(jié)桿菌超表達(dá)載體pART2進(jìn)行酶切2h (50 U I的體系為:NEBuffer3.1 IOX 5 u L，BamHl lul, DNA 44 u L,反應(yīng)溫度為 37°C )，并通過(guò)堿性磷酸酶對(duì)DNA進(jìn)行去磷酸化處理lOmin，防止載體在下面的連接過(guò)程中發(fā)生自連。通過(guò)DNA 凝膠回收試劑盒對(duì)切開(kāi)的載體進(jìn)行回收。
[0021]利用T4 DNA連接酶IOOU對(duì)步驟I中獲得的節(jié)桿菌基因組隨機(jī)酶切片段與步驟2 中制備獲得的線性載體進(jìn)行連接，16°C過(guò)夜。
[0022]將連接產(chǎn)物通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中。電擊條件為:2500V、 25UF.200Q以及2mm電擊杯。涂布在含有卡那霉素(20 y g/ml)的LB平板上，37°C下培養(yǎng)。
[0023]3、抗生素PC190723抗性基因的篩選
將步驟2中獲得的超表達(dá)文庫(kù)質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到節(jié)桿菌電擊感受態(tài)(將節(jié)桿菌 Arthrobacter strain A3 在 LB 平板中于 20°C下養(yǎng)到 0D600=0.6 時(shí),用 4°C 的 10% 甘油洗 3 次，重懸即可制得節(jié)桿菌電擊感受態(tài)。)中。電擊條件為:2500V、25uF、800Q以及2mm電擊杯。涂布在含有卡那霉素(140ii g/ml)、PC190723 (I y g/ml)的LB平板上20oC篩選培養(yǎng)。
[0024]從可在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的節(jié)桿菌中提取質(zhì)粒并測(cè)序，測(cè)序得到的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中 SEQ ID N0.1，共 987bp。
[0025]實(shí)施例2抗生素PC190723抗性基因(aap)功能的驗(yàn)證
1、抗生素PC190723抗性基因編碼區(qū)
通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)序列表中SEQ ID N0.1的序列中存在一個(gè)開(kāi)放閱讀框:第 87-986位核苷酸為開(kāi)放閱讀框區(qū)，即抗生素PC190723抗性基因(aap)，核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID N0.2，開(kāi)放閱讀框區(qū)核苷酸編碼的蛋白序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID N0.，3。
[0026]2、抗生素PC190723抗性基因(aap)功能的驗(yàn)證
根據(jù)開(kāi)放閱讀框區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，利用引物Pl:5’ AAGGATCCGGTGATGAATACCCATGCCGC 3’ 與 P2:5’ AATCTAGACTAGCTCCGGCGTCGTACGGG 3’ 以節(jié)桿菌A3基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 u L: Proof DNA聚合酶2 y L，
IXProof buffer 2.5 u L, 25 mmol/L MgCl2 3 u L, 10 mmol/L dNTP 0.5 u L, DNA 模板 2uL,引物各lOpmol，其余為水。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2 min ;98°C變性10 S，68。。 延伸30 S，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。
[0027]通過(guò)BamHl與Xba I對(duì)PCR產(chǎn)物和pART2分別進(jìn)行雙酶切(50 的體系為: NEBuffer2.1 10X 5u L, NEB BamHI I u I, NEB XbaI I u I, DNA 43 y L，反應(yīng)溫度為 37 °C )。
[0028]利用T4 DNA連接酶連接上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物(20 的體系為:NEB T4DNA Ligase Reaction Buffer 10X 2 u L, NEB T4 DNA Ligasel u I,連接產(chǎn)物 13 u L,載體 4yL，反應(yīng)溫度為20°C，反應(yīng)時(shí)間16 H)。將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，電擊條件為:2500V、25iiF、200Q以及2mm電擊杯，篩選獲得正確的連接克隆，提取質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化至節(jié)桿菌A3中。電擊條件為:2500V、25iiF、800Q以及2mm電擊杯。涂布在含有卡那霉素(140ii g/ml)、PC190723 (I y g/ml)的LB平板上20°C篩選培養(yǎng)。將在該篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的單克隆菌(即含抗生素PC190723抗性基因(aap)的節(jié)桿菌)以及僅帶有pART2質(zhì)粒的節(jié)桿菌(陰性對(duì)照)分別接種到含有卡那霉素(140ii g/ml)、PC190723 (lu g/ml)的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)只有含抗生素PC190723抗性基因(aap)的節(jié)桿菌可以在含有 PC190723 (I u g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中存活。
[0029]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 〈120〉一種抗生素PC190723抗性基因及其應(yīng)用 〈160〉 I
<170> PatentIn version 3.3
〈210〉 I
〈211〉 987
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
【權(quán)利要求】
1.一種抗生素PC190723抗性基因，其特征在于:其核苷酸序列為(1)、序列表中SEQID N0.2中核苷酸序列；(2)、與(1)中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(3)、對(duì)上述1)或2)所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；(4)、與(1)中所示的核苷酸序列編碼相同蛋白的核苷酸序列。
2.重組蛋白，其由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼。
3.重組菌，其含有權(quán)利要求2所述的重組蛋白。
4.權(quán)利要求1所述的抗性基因、權(quán)利要求2所述的重組蛋白或權(quán)利要求3所述的重組菌在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為權(quán)利要求1所述的抗性基因在放線菌中表達(dá)后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中存活。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為權(quán)利要求2所述的重組蛋白在放線菌中表達(dá)后，重組放線菌能在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中存活。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為權(quán)利要求3所述的重組菌能在含抗生素PC190723的培養(yǎng)基中存活。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述放線菌為節(jié)桿菌A3。
【文檔編號(hào)】C12N15/31GK103555736SQ201310518999
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】陳熙明, 張昺林, 張威, 張滿效, 陳拓, 劉光琇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所