一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，包括：步驟1，將鷹嘴豆蛋白粉與水混合制成3～8重量%的懸浮液；步驟2，調(diào)整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.0～7.5，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3000-4000U復(fù)合酶形成酶解體系；步驟3，酶解體系在45～50℃的溫度條件下反應(yīng)1.0～1.5h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至≥95℃滅酶10～15min，獲得酶解產(chǎn)物；步驟4，對酶解產(chǎn)物離心分離，用超濾膜對上清液進(jìn)行肽段截留，獲得分子量在2kDa-6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽。本發(fā)明的有益效果在于：生產(chǎn)成本較低、工藝操作簡單，同時可使酶解產(chǎn)物中抑菌肽段產(chǎn)量提高。
【專利說明】一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物蛋白提取【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]隨著廣大消費(fèi)者對食品傳統(tǒng)防腐劑抑菌效力、呈味特征及安全性的普遍認(rèn)識，安全性與穩(wěn)定性高、抑菌性與溶解性強(qiáng)并且抑菌范圍廣的天然防腐劑的發(fā)掘與開發(fā)引起了廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其是抑菌肽類防腐劑。將鷹嘴豆蛋白粉作為營養(yǎng)滋補(bǔ)及藥物配伍資源，已得到了廣大消費(fèi)者尤其是新疆少數(shù)民族居民的認(rèn)可，以安全性普遍認(rèn)知的鷹嘴豆蛋白作為肽源進(jìn)行抑菌肽開發(fā)，可為鷹嘴豆蛋白副產(chǎn)物的應(yīng)用及精深加工提供基礎(chǔ)依據(jù)，輔助于防腐類食品添加劑市場開拓與品質(zhì)升級。作為純天然食品配料的植物蛋白，其水解液富含多種氨基酸和肽，可為食品帶來不同的功能特征。
[0003]目前應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域的抑菌肽主要以乳酸鏈球菌素為主，日本、韓國將多聚賴氨酸作為食品添加劑用于食品貯藏保鮮?；谔烊环栏瘎┮志膹V譜性能考慮，多種抑菌肽的開發(fā)與應(yīng)用已得到廣大學(xué)者的普遍關(guān)注，采用化學(xué)合成及基因工程的方法實(shí)施抑菌肽的制備最為常見，然而由于化學(xué)合成高成本低效率、基因工程表達(dá)系統(tǒng)不確定等問題的存在，限制了食品添 加劑類抑菌肽在食品加工中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提出一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，以克服現(xiàn)有抑菌肽制備方法的不足，提高抑菌肽段的富集效果。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:一種鷹嘴豆(Cicerarietinum Linn.)抑菌肽的制備方法,包括以下步驟:
[0006]步驟I，將過50~65目篩的鷹嘴豆蛋白粉與水混合制成3~8重量％的鷹嘴豆蛋白粉懸浮液，于35 °C下靜置浸泡20~40min ；
[0007]步驟2，調(diào)整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.0~7.5，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3000-4000U復(fù)合酶形成酶解體系，所述復(fù)合酶為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合按重量比1:1~3混合形成的復(fù)合酶；
[0008]步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.0~1.5h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至> 95°C滅酶10~15min，獲得酶解產(chǎn)物；
[0009]步驟4，對所述酶解產(chǎn)物離心分離10~15min獲得上清液和未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa-6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽。
[0010]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進(jìn)一步，步驟2，調(diào)整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.3~7.0。
[0011]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進(jìn)一步，按每克鷹嘴豆蛋白加入粉3500-3800U復(fù)合酶形成酶解體系。[0012]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進(jìn)一步，所述復(fù)合酶為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合按重量比1:2混合形成的復(fù)合酶。
[0013]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進(jìn)一步，步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.2h。
[0014]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進(jìn)一步，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶12min，獲得酶解產(chǎn)物。
[0015]如上所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，進(jìn)一步，步驟4，對所述酶解產(chǎn)物離心分離的離心速度為1900~2200r/min。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]通過本發(fā)明方法制備抑菌肽，生產(chǎn)成本較低、工藝操作簡單、設(shè)備及人力投資小、重復(fù)性好，減少了水資源的浪費(fèi)與污染，同時可使酶解產(chǎn)物中抑菌肽段產(chǎn)量提高。通過本發(fā)明制得的抑菌肽不僅具有較為顯著的抑菌效果而且安全營養(yǎng)，為天然保鮮劑的開發(fā)提供可靠的基料或配料，可以提高我國防腐劑產(chǎn)品的重量和安全性，適應(yīng)天然食品添加劑市場發(fā)展的要求。此外，通過本發(fā)明方法制備的抑菌肽分子量分布集中，抑菌活性較強(qiáng)，食用安全性高。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0019]實(shí)施例1 [0020]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為7.2，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶3500U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.5h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶15min終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽15.lg。
[0021]實(shí)施例2
[0022]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為6.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶3500U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶4000U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，在45°C的溫度條件下密閉反應(yīng)
1.0h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽13.3g。
[0023]實(shí)施例3
[0024]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為7.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶4000U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，在48°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.5h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽17.6g。
[0025]實(shí)施例4
[0026]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為8.0，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶3800U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.0h,反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽5.2g。
[0027]實(shí)施例5
[0028]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為5.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶4000U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，在45°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.5h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體 系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽1.3g。
[0029]實(shí)施例6
[0030]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為7.0，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶4500U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為2:1的復(fù)合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.0h,反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽4.lg。
[0031]實(shí)施例7
[0032]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與950g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為7.0，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶5300U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:3的復(fù)合酶)，在48°C的溫度條件下密閉反應(yīng)2.0h,反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽7.4g。
[0033]實(shí)施例8
[0034]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉50g與850g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為7.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶3800U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:3的復(fù)合酶)，在50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)2.0h,反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽3.Sg。
[0035]實(shí)施例9
[0036]將過60目篩的鷹嘴豆脫脂蛋白粉60g與1000g水混合制成蛋白粉懸浮液，35°C下靜置浸泡30min ;攪拌調(diào)整混合溶液的pH值為8.5，每克鷹嘴豆蛋白粉加入復(fù)合酶4500U(為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合重量比為1:2的復(fù)合酶)，在55°C的溫度條件下密閉反應(yīng)2.0h,反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶IOmin終止反應(yīng)；在2000r/min的條件下離心分離，獲得上清液并棄除未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽5.7g。
[0037]效果例
[0038]實(shí)驗(yàn)過程如下:將實(shí)施例1-9中制得的鷹嘴豆抑菌肽用蒸餾水溶解，分別配制成0mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL 的系列濃度樣品溶液。將各樣品溶液100 μ L、Luria-Be rtani培養(yǎng)基30 μ L和濃度為5Χ 103CFU/mL菌液70 μ L (菌液分別為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或幽門螺桿菌中的一種)分別加入到培養(yǎng)皿中，在振蕩器充分混勻，每次處理重復(fù)3次，然后在37°C恒溫條件下培養(yǎng)18h。以抑菌肽濃度為橫坐標(biāo)，相對抑制率為縱坐標(biāo)，利用Origins.0軟件制作直線回歸方程計算半抑制濃度(IC5tl)。
[0039]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:抑菌肽均可有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及幽門螺桿菌，對金黃色葡萄球菌的半抑制濃度(IC5tl)為290 μ g/mL、對大腸桿菌的半抑制濃度(IC5tl)為680 μ g/mL、對幽門螺桿菌的半抑制濃度(IC5tl)為710 μ g/mL。
[0040]對上述實(shí)施例所得的不同條件下的2kDa_6kDa肽段產(chǎn)率對照分析，可充分論證采用此種酶水解法制備鷹嘴豆特定分子量分布的抑菌肽的科學(xué)性、簡捷性及可行性，為天然保鮮劑的開發(fā)提供可靠的基料或配料，可以提高我國防腐劑產(chǎn)品的重量和安全性，適應(yīng)天然食品添加劑市場發(fā)展的要求。
[0041]以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，包括以下步驟: 步驟1，將過50~65目篩的鷹嘴豆蛋白粉與水混合制成3~8重量％的鷹嘴豆蛋白粉懸浮液，靜置浸泡20~40min ； 步驟2，調(diào)整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.0~7.5，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3000-4000U復(fù)合酶形成酶解體系，所述復(fù)合酶為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合按重量比1:1~3混合形成的復(fù)合酶； 步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.0~1.5h，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至> 95°C滅酶10~15min，獲得酶解產(chǎn)物； 步驟4，對所述酶解產(chǎn)物離心分離10~15min獲得上清液和未水解蛋白沉淀，用截留量分別為6kDa和2kDa的超濾膜對上清液進(jìn)行不同分子量肽段截留，獲得分子量在2kDa_6kDa之間的肽段體系；對肽段體系進(jìn)行噴霧干燥得到鷹嘴豆抑菌肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，步驟2，調(diào)整鷹嘴豆蛋白粉懸浮液的pH值為6.3~7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，按每克鷹嘴豆蛋白粉加入3500-3800U復(fù)合酶形成酶解體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合酶為胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合按重量比1:2混合形成的復(fù)合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，步驟3，所述酶解體系在45~50°C的溫度條件下密閉反應(yīng)1.2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，反應(yīng)結(jié)束后立即將酶解體系溫度升高至95°C滅酶12min，獲得酶解產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆抑菌肽的制備方法，其特征在于，步驟4，對所述酶解產(chǎn)物離心分離的離心速度為1900~2200r/min。
【文檔編號】C12P21/06GK103525891SQ201310515764
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】田洪磊, 詹萍, 程衛(wèi)東, 朱新榮, 顏海燕 申請人:石河子大學(xué)