一種用于鵝性別鑒定的引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鵝性別鑒定的引物對、試劑盒及方法。本發(fā)明提供的用于檢測性別鑒定的引物對序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示；通過引物對鵝血液基因組DNA上CHD基因在Z、W染色體上不同拷貝內含子，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據帶型對鵝性進行鑒定：一條帶為公鵝；兩條帶為母鵝。本發(fā)明僅需普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術就可以對鵝性別進行簡單、準確的鑒定。
【專利說明】一種用于鵝性別鑒定的引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學【技術領域】，具體涉及一種鵝性別鑒定的引物、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]由于公母個體間生長速度，生長性能等種質特性的不同，在現代養(yǎng)禽業(yè)中大多進行早期性別鑒定。目前傳統(tǒng)的性別鑒定除了金銀色羽、快慢羽等方法外，主要通過翻肛鑒另O。但翻肛鑒別由于需要在雛禽出生24h內進行鑒定，且勞動強度大、需要專業(yè)人員才能進行鑒定，此外還存在一定的誤鑒率。公母鵝外形外貌差異較小，根據外形對鵝進行公母鑒定難度較大，對實驗采樣和生產都有一定的影響，因此通過采取鵝羽毛、血液等，通過分子生物學手段進行性別鑒定具有重要意義。
[0003]雄性禽類性染色體為ZZ型，雌性染色體為ZW型，這樣就能通過擴增W染色體上特異性序列而進行雌雄鑒別。目前位于性染色體上的性連鎖基因主要有CHD1、ATP5A1及假基因序列EE0.6、Xho I等。禽類CHD基因，即染色體螺旋蛋白基因，在大多數非平胸鳥類中具有兩個同源拷貝CHD-Z和CHD-W，CHD-Z為Z染色體連鎖，CHD-W為W染色體連鎖。CHD基因內含子在雌雄個體之間差異較大，通過設計特異性引物進行PCR擴增之后，再對PCR產物進行電泳檢測，在母鵝個體上可見兩條長度不同的條帶，而在公鵝上僅有一條帶。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一種簡單、準確、快速的鵝性別鑒定的引物對。該引物對為:
[0005]上游引物CHD-F:5，-ggtggcttaatgaggtagca-3，, SEQ ID N0.1 ；
[0006]下游引物CHD-R:5，-aggatggaaatgagtgca-3，, SEQ ID N0.2。
[0007]本發(fā)明的目的之二是一種鵝性別鑒定的PCR試劑盒。
[0008]本發(fā)明提供的鵝性別鑒定的PCR試劑盒，由所述引物對、雙蒸水、PCR緩沖液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶組成。
[0009]本發(fā)明的目的之三是一種鵝性別鑒定的方法。
[0010]本發(fā)明提供一種利用上述引物鑒別鵝性別的方法，其特征在:以CHD-F/CHD-R為引物，以鵝血液基因為模板進行PCR擴增，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。當產物條帶產物出現485bp和330bp兩個條帶時為母鵝，當產物條帶產物出現485bp —個條帶時為公鵝。
[0011 ] 上述方法所述PCR擴增體系具體組成如下:
[0012]20 μ I 反應體系:10 X PCR Buffer2.0 μ L，Mg2+2.2 μ L, dNTP Mixture0.8 μ L, TaqDNA 聚合酶(5υ/μ L)0.2μ L，上、下游引物各 1.0 μ L，鵝 DNA 模板 l.0yL, ddH2011.8μ L。
[0013]上述方法所述PCR擴增程序具體組成如下:
[0014]反應條件:95°C預變性5min ;95°C變性 30s，55.9°C退火 30s，72°C延伸 30s，33 個循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C保存。
[0015]本發(fā)明根據CHD基因在Z、W染色體上不同拷貝內含子差異，設計特異性引物，根據PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳根據帶型對鵝性別進行簡便、準確的鑒定。本發(fā)明只需普通PCR儀及瓊脂糖凝膠電泳設備即能完成鵝性別鑒定工作，避免采用傳統(tǒng)方法耗時、耗力等缺點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實施例2的已知性別鵝的PCR擴增產物的部分電泳圖(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)；
[0017]圖2為本發(fā)明實施例2的未知性別鵝的PCR擴增產物的部分電泳圖(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)。
【具體實施方式】
[0018]以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0019]實施例1
[0020]利用CHD基因在Z、W染色體上不同拷貝內含子差異，設計一對特異性引物CHD-F和CHD-R ;所述引物序列為:
[0021]上游引物CHD-F:5’ -ggtggcttaatgaggtagca-3'；
[0022]下游引物CHD-R:5，-aggatggaaatgagtgca-3'。
[0023]本發(fā)明的鵝性別鑒定方法通過以下實施例2進行描述:
[0024]實施例2
[0025]采用酚-氯仿萃取法提取鵝血液基因組:
[0026]取10 μ L鵝血液加500 μ L細胞裂解液，加入10 μ L10%SDS和10 μ L10%蛋白酶K，55°C水浴過夜；加入500 μ L Tris飽和酚，上下顛倒混勻20min ；12000r/minl0min,小心吸取上層水相于新Ep管中；加入等體積酚、氯仿、異戊醇(25:24:1)混合液，上下顛倒混勻20min ; 12000r/minl0min,小心吸取上層水相于新1.5mL指形管中；加入等體積氯仿、異戍醇(24:1)混合液,上下顛倒混勻20min ;加入2倍體積無水乙醇,橫向震蕩3min ；12000r/min10min,管底可見白色DNA沉淀；加lmL70%乙醇，洗漆DNA沉淀；8000r/min5min,倒掉乙醇，待乙醇完全蒸發(fā)后，加入100 μ L雙蒸水，室溫溶解，測定核酸濃度，稀釋為100ng/yL，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]鵝CHD基因PCR擴增:
[0028]鵝CHD基因PCR擴增體系和程序具體組成如下:
[0029]反應體系為20 μ L: 10 X PCR Buffer2.0 μ L，Mg2+2.2 μ L, dNT P Mixture0.8 μ L,Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L，上、下游引物各 1.0 μ L，DNA 模板 1.0 μ L，ddH2011.8 μ L。反應條件:95°C預變性5min ;95°C變性30s，55.9°C退火30s，72°C延伸30s，33個循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C保存。
[0030]瓊脂糖檢測PCR擴增產物:
[0031 ] 取5 μ LPCR擴增產物通過1.5%(質量百分含量)瓊脂糖凝膠110V電壓電泳25min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照對PCR擴增產物進行鑒定。根據帶型就判斷性別:一條帶為公鵝；兩條帶為母鵝。圖1為已知性別鵝的PCR擴增產物的部分電泳圖，其中一條帶為雄性個體，兩條帶為雌性個體，共檢測30只，雌雄個體各半，最終結果顯示鑒定準確率為100% ;圖2為未知性別鵝的PCR擴增產物的部分電泳圖，共檢測30個個體，根據本發(fā)明專利方法鑒定結果與解剖鑒定或專業(yè)人員翻肛鑒別結果 一致。
【權利要求】
1.一種用于鵝性別鑒定的引物對，其序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
2.一種鵝性別鑒定的PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒包括權利要求1所述的引物對、雙蒸水、PCR緩沖液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶。
3. 一種鑒定鵝性別鑒定的方法，其特征在于:用權利要求1所述的引物對，以鵝血液基因為模板進行PCR擴增，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物；當擴增產物條帶出現485bp和330bp兩個條帶時為母鵝，當產物條帶產物出現485bp —個條帶時為公鵝。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468825SQ201310479378
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權日:2013年10月14日
【發(fā)明者】龔道清, 張宜輝, 張蕊, 張軍, 宋政, 朱振鵬 申請人:揚州大學