用于生產(chǎn)(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酮還原酶突變體，其源于開菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefir)的野生型酮還原酶，能將4-氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，具有A94S，F(xiàn)147V，L199P，A202V中的一個或多個突變。本發(fā)明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了2-20倍，利用該酶可生物催化將4-氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯；反應(yīng)條件溫和，對設(shè)備要求低，生產(chǎn)過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產(chǎn)他汀類藥物關(guān)鍵中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯無副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便；此外反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保。
【專利說明】
用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酮還原酶突變體及其在他汀類藥物中間體生產(chǎn)中的應(yīng)用，特別涉及一種源于開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的酮還原酶突變體及其在手性
(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯生產(chǎn)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]阿托伐他汀鈣(商品名LIPIT0R由輝瑞公司銷售)、羅蘇伐他汀鈣(商品名CREST0R由阿斯利康公司銷售)以及匹伐他汀(商標(biāo)名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本銷售)，是重要的降膽固醇他汀類藥物。而手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯是這些重要的他汀類藥物的關(guān)鍵的手性中間體。國內(nèi)2009年該中間體的產(chǎn)量為400噸，預(yù)計未來幾年內(nèi)，國內(nèi)產(chǎn)量將達(dá)到1000噸以上，直接經(jīng)濟(jì)效益在數(shù)億元。在已知的制備這些手性中間體的諸多途徑中，包括化學(xué)法和酶法，都具有很多缺點。由于化學(xué)法合成過程條件苛刻，副反應(yīng)多，產(chǎn)品分離純化難度大，得率低，成本高，使其難以成為用于商品規(guī)模合成的理想方法。采用酶法制備及手性(S) -4-氯-3-羥基-丁酸乙酯需要使用具有立體選擇性的酮還原酶，但現(xiàn)有的野生型酮還原酶催化活性很較低，使用10g/L粗酶粉20小時僅可轉(zhuǎn)化lg/L的酮底物，也使其難以成為用于商品規(guī)模合成的理想方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種酶催化活性高的酮還原酶及其制備方法。
[0004]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)中天然存在的野生型酮還原酶，能將4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)轉(zhuǎn)化為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)。本公開內(nèi)容的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)包括在一定位置突變的酮還原酶與開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)產(chǎn)生的野生型酮還原酶(SEQ ID NO:2)相比表現(xiàn)出增加的催化活性?！耙吧屯€原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型KRED酮還原酶”指由源自開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶基因SEQ ID NO:1編碼的，并具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮還原酶。該酶可將4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯?！耙吧汀敝概c自然中所發(fā)現(xiàn)的一樣的材料或物質(zhì)的形式。例如野生型的蛋白質(zhì)或核酸序列是可以從自然界中的分離并且未經(jīng)過人為修飾的，在生物體中存在的原始序列形式?！霸黾拥拇呋钚浴敝冈隗w外或體內(nèi)試驗中所測量的與野生型酮還原酶相比，表現(xiàn)出使底物(例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向產(chǎn)物(例如S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯)轉(zhuǎn)化率增加的酮還原酶。
[0005]本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)(S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體，其特征在于，其是源于開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶,其中，突變是在親本酮還原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失I個或多個氨基酸，或者在親本酮還原酶的氨基酸序列的一個或兩個末端添加或刪除I個或多個氨基酸，且與使用親本酮還原酶相t匕，其酮還原酶活性增強2-20倍。
[0006]進(jìn)一步地，所述突變體具有下述的一個或多個氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三聯(lián)體表示:字母-數(shù)字-字母，其中數(shù)字表示突變氨基酸的位置，數(shù)字前的字母對應(yīng)突變設(shè)計的氨基酸，數(shù)字后的字母表示用于置換數(shù)字前氨基酸的氨基酸:A94S，F(xiàn)147V,L199P, A202V。
[0007]本發(fā)明提供的酮還原酶突變體,其源于開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶，表現(xiàn)出使底物(例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向產(chǎn)物(例如S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯)轉(zhuǎn)化率增加的酮還原酶。所述酮還原酶突變體,與SEQ ID N0.2的野生型酮還原酶相比表現(xiàn)出更強的催化活性。酮還原酶突變體和編碼這種突變體的多核苷酸可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法制備。突變體可以通過使編碼該酶的體外重組、多核苷酸誘變、DNA改組、易錯PCR和定向進(jìn)化方法等獲得。
[0008]進(jìn)一步地，所述突變體包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列。
[0009]全長突變的酮還原酶對于保持酶的催化活性并不是必需的。相應(yīng)地，應(yīng)考慮酮還原酶突變體的截短的類似物和有催化活性的片段。例如，在一些實施方案中，C端或N端的數(shù)個氨基酸可以被刪去。任何特定的截短的類似物或片段可以利用相應(yīng)的試驗來評估催化活性。同樣的，額外的氨基酸殘基可以被添加到一個或兩個末端而不影響催化活性。額外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，額外氨基酸序列可以被用來幫助純化，做為標(biāo)記，或執(zhí)行一些其它的功能。因此，本公開內(nèi)容的酮還原酶突變體可以是融合蛋白的形式，其中酮還原酶突變體(或其片段)諸如通過助溶標(biāo)簽(如SUMO蛋白)、純化標(biāo)簽(如結(jié)合金屬的His標(biāo)簽)和細(xì)菌定位信號(如分泌信號)的實例而非限制的方式被融合到其它蛋白質(zhì)。
[0010]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述突變體的編碼基因。
[0011]進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的編碼基因，其序列包含SEQ ID N0.3所述的DNA分子。其已經(jīng)過序列優(yōu)化以適于在大腸桿菌中表達(dá)。在一些實施方案中，多核苷酸包括被優(yōu)化用于在特定類型的宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。用于各種不同類型的微生物的密碼子的使用和偏好性是已知的，因為其是用于在這些微生物的表達(dá)特定的氨基酸的優(yōu)化的密碼子。
[0012]本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，其序列優(yōu)選自SEQ ID N0.5，比pET系列及pQE系列表達(dá)載體相比其具有更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋磉_(dá)控制。在一些實施方案中，控制序列包括啟動子、前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子等。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞，指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子包括但不限于從噬菌體T5、噬菌體T7、噬菌體lambda、大腸桿菌lacUV5操縱子、大腸桿菌trp操縱子、大腸桿菌tac操縱子等。
[0013]本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，優(yōu)選自大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的一種。表達(dá)酮還原酶突變體的表達(dá)載體可以包含允許載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者載體在細(xì)菌中獨立于基因組自主復(fù)制的元件。為整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可以通過重組工程使載體整合到基因組中。
[0014]本發(fā)明提供一種制備酮還原酶突變體的方法，其特征在于包括以下步驟:(a)構(gòu)建表達(dá)酮還原酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細(xì)胞，表達(dá)載體以及酮還原酶突變體基因；(b)培養(yǎng)并誘導(dǎo)所述基因工程菌；(C)破碎所述基因工程菌、收集粗酶液并進(jìn)行酶活檢測。
[0015]所述步驟(a)為將來自開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的編碼野生型酮還原酶的多核苷酸(SEQ ID NO: I)根據(jù)菌株DHl密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化后，通過全基因合成的方式獲得。將優(yōu)化后的編碼酮還原酶的多核苷酸克隆到表達(dá)載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)野生型酮還原酶的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為:
F:5’ ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGACTGATCGTTTAAAAGGCAAAG 3’ ；
R:5’ AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTGAGCAGTGTATCCACCATCG 3’。
[0016]用同樣的方法將編碼酮還原酶突變體的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表達(dá)載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)酮還原酶突變體的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。
[0017]所述步驟(b)為挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌單菌落接種于1ml高壓滅菌后的第一培養(yǎng)基中，30°C，250rpm過夜培養(yǎng)；次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌后的第二培養(yǎng)基中，于30°C中培養(yǎng)至菌體OD 5_6，立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng)lh，加入IPTG至終濃度0.1mM，并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)15h。
[0018]所述第一培養(yǎng)基為:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L,氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L,七水硫酸鎂0.493 g/L,六水氯化鐵0.027 g/L,甘油5g/L,葡萄糖0.8g/L,滅菌后添加氨節(jié)青霉素至100mg/L。
[0019]所述第二培養(yǎng)基為:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵 0.027 g/L,甘油 5g/L，葡萄糖 0.3g/L。
[0020]本發(fā)明具有積極的效果:(1)本發(fā)明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了 2-20倍，利用該酶可將4-氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化生成
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯；(2)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，對設(shè)備要求低，生產(chǎn)過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產(chǎn)他汀類藥物關(guān)鍵中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯無副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便；(3)反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保。

【具體實施方式】
[0021]實施例1構(gòu)建野生型及酮還原酶突變體工程菌
將來自開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的編碼野生型酮還原酶的多核苷酸(SEQID NO:1)根據(jù)菌株DHl密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化后(見Puigb6 P, Guzman E, RomeuA, Garcia-Vallve S.0PTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage ofDNA sequences.Nucleic Acids Res.2007)，通過基于PCR的全基因合成方式(PCR-basedgene synthesis method)進(jìn)行基因合成。將優(yōu)化后的編碼酮還原酶的多核苷酸克隆到表達(dá)載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)野生型酮還原酶的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為:
F:5’ ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGACTGATCGTTTAAAAGGCAAAG 3’ ；
R:5’ AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTGAGCAGTGTATCCACCATCG 3’。
[0022]類似的，將編碼酮還原酶突變體的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表達(dá)載體(SEQID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)酮還原酶突變體的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHl中。
[0023]實施例2酮還原酶的制備
挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌DHl單菌落接種于1ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L,氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，滅菌后添加氨芐青霉素至100mg/L。30°C，250rpm過夜培養(yǎng)。次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。滅菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30°C中培養(yǎng)至菌體OD 5-6，立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng)lh。加入IPTG至終濃度0.1mM,并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)15h。
[0024]培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于4°C，6000g下離心20min最終得到濕菌體3.6g。然后將沉淀用蒸餾水清洗兩次，收集菌體。再次用蒸餾水重懸，在超聲破碎儀下破碎至澄清。破碎后于4°C，12000g下離心30min，收集上清，預(yù)冷至_70°C后用冷凍干燥機制備凍干粉。最終得到粗酶凍干粉0.39g。
[0025]實施例3酮還原酶活性的測定
由于NADPH在340nm處有吸收峰，而NADP在340nm處無吸收峰，故可通過檢測反應(yīng)過程中NADPH吸光值的變化，而計算酮還原酶的活性。酮還原酶活力測定體系為:取10ul適量濃度的酶液加入到終濃度為10mM pH7.0三乙醇胺緩沖液，lg/L NADP，50%異丙醇，ImM硫酸鎂反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)。在加入酶液前，需先將反應(yīng)體系充分混勻后置于25°C水浴中。將實施2中制備的酮還原酶干粉按適當(dāng)?shù)谋壤♂尯螅?0ul加入反應(yīng)體系中，混勻后于340nm處檢測每分鐘的吸光度變化值。參照NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酮還原酶的酶活。單位酶活(U)定義為每分鐘生成lymol NADP所需要的酶量。用同樣方法檢測野生型酮還原酶的酶活。對于相同質(zhì)量的蛋白，改進(jìn)后的酮還原酶突變體比野生型酮還原酶酶活提升了 18倍。
[0026]以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.用于生產(chǎn)(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體，其特征在于，其是源于開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶,其中，突變是在親本酮還原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1個或多個氨基酸，或者在親本酮還原酶的氨基酸序列的一個或兩個末端添加或刪除1個或多個氨基酸，且與使用親本酮還原酶相比，其酮還原酶活性增強2-20倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體，其特征在于，所述突變體具有下述的一個或多個氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三聯(lián)體表示:字母-數(shù)字-字母，其中數(shù)字表示突變氨基酸的位置，數(shù)字前的字母對應(yīng)突變設(shè)計的氨基酸，數(shù)字后的字母表示用于置換數(shù)字前氨基酸的氨基酸:A94S，F(xiàn)147V，L199P，A202V。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體，其特征在于，所述突變體包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體的編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于，其包含SEQID N0.3所述的序列。
6.含有權(quán)利要求4所述的編碼基因的重組質(zhì)粒。
7.一種重組質(zhì)粒，其特征在于:包含SEQ ID N0.5的序列。
8.含有權(quán)利要求6所述重組質(zhì)?；驒?quán)利要求7所述重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-3任一項所述的用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體在生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯中的應(yīng)用。
10.一種生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述方法以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，在權(quán)利要求1-3任一項所述的突變體的催化作用下，得到(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯。
【文檔編號】C12R1/225GK104342412SQ201310345823
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】丁雪峰 申請人:南京朗恩生物科技有限公司