一種嗜熱酯酶及其在降解PAEs中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種嗜熱酯酶及其在降解PAEs（鄰苯二甲酸酯）中的用途。該酯酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。在含水介質(zhì)中，在該酯酶或其融合蛋白的催化下，鄰苯二甲酸酯進(jìn)行水解反應(yīng)，形成鄰苯二甲單酸和醇，再形成鄰苯二甲酸和醇。本發(fā)明的酯酶能夠?qū)⑺芑瘎┏醪浇到?。該酶?duì)中低濃度的變性劑和有機(jī)溶劑具有一定抗性，熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)越，并且顯示了對(duì)多種PAEs底物的降解功能，該酶是文獻(xiàn)中報(bào)道的唯一一個(gè)從嗜熱微生物中克隆得到的，其優(yōu)良的性能使其在PAEs的純酶法降解中有著良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明無(wú)害化降解PAEs，降解反應(yīng)穩(wěn)定性好，反應(yīng)條件粗放，反應(yīng)速度快。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種嗜熱酯酶及其在降解PAEs中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種嗜熱酯酶及其在降解PAEs中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 各種各樣的化學(xué)合成物質(zhì)在人類(lèi)的生活中起著至關(guān)重要的作用，它們改善了人們 的生活，推動(dòng)了人類(lèi)社會(huì)文明的發(fā)展。但同時(shí)它們也污染了我們的地球，給我們的生存環(huán)境 帶來(lái)了極大的壓力。還有一些化合物，它們對(duì)于環(huán)境的危害是經(jīng)過(guò)多年的科學(xué)實(shí)驗(yàn)才驗(yàn)證 的，此時(shí)，其在自然界中的蓄積范圍和蓄積量已經(jīng)達(dá)到了嚴(yán)重的地步。鄰苯二甲酸酯（PAEs) 類(lèi)又稱(chēng)酞酸酯類(lèi)，是大約30種化合物的總稱(chēng)，在生活中廣泛使用，主要作為塑料制品的塑 化劑，它在很低濃度時(shí)即具有生殖毒性，且它進(jìn)入環(huán)境后，不易迅速降解，可在環(huán)境中蓄積 和通過(guò)生物鏈富集，PAEs已成為全球最普遍的污染物之一。
[0003] 目前一致認(rèn)為，PAEs降解最有效的途徑是微生物介導(dǎo)的生物降解，圍繞PAEs的生 物降解性研究主要應(yīng)集中在三個(gè)方面：一是研究不同生物的降解代謝途徑，二是分子機(jī)制 的研究，關(guān)注負(fù)責(zé)催化反應(yīng)的酶系、相關(guān)基因或操縱子結(jié)構(gòu)。三是篩選適合和馴化的特異菌 種及適宜的生物酶。
[0004] 酯水解酶在PAEs的無(wú)害化降解中起著重要的作用，有一些具有初步催化功能的 微生物被分離出來(lái)，但負(fù)責(zé)相關(guān)反應(yīng)的酶卻僅有數(shù)個(gè)得到表征。這些酶都是從生態(tài)環(huán)境單 一的中溫微生物中分離得到的，穩(wěn)定性差，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種鄰苯二甲酸酯的生物酶降解法，該方法 可以快速降解鄰苯二甲酸酯，并且反應(yīng)條件粗放，可以在高溫下進(jìn)行，在酶變性劑、有機(jī)溶 齊U、金屬離子等污染物的存在下，鄰苯二甲酸酯還是可以快速的徹底降解。
[0006] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種可以快速?gòu)氐捉到忄彵蕉姿狨サ孽ッ?，并且該酯酶熱穩(wěn)定 性高，對(duì)酶變性劑、有機(jī)溶劑、金屬離子耐受性好，催化活性高，從而可以將鄰苯二甲酸酯快 速?gòu)氐捉到獬舌彵蕉姿岷拖鄳?yīng)的醇。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：一種分離的酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二是：一種酯酶融合蛋白，其特征在于，所述的酯酶融合蛋白 是氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的酯酶添加一肽段后的融合蛋白，所述的肽段是表達(dá)親 和層析標(biāo)簽His-tag。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案之三是：一種分離的編碼所述的酯酶的核酸，其特征在于，其核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案之四是：一種包含所述的核酸的重組表達(dá)載體。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案之五是：一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，該重組轉(zhuǎn)化體包含 所述的重組表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案之六是：一種鄰苯二甲酸酯的生物酶降解法，其特征在于，包括 以下步驟，在含水介質(zhì)中，在氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶或其融合蛋白的催化 下，鄰苯二甲酸酯進(jìn)行水解反應(yīng)，形成鄰苯二甲單酸和醇，再形成鄰苯二甲酸和醇。
[0013] 本發(fā)明中，所述的酯酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。其是來(lái)源于嗜酸硫化 芽抱桿菌（Sulfobacillus acidophilus)的酯酶。
[0014] 本發(fā)明中，所述的酯酶可以從嗜酸硫化芽孢桿菌中分離獲得，也可以從重組表達(dá) 該酯酶的表達(dá)子中分離獲得，也可以人工合成獲得。
[0015] 本發(fā)明中，較佳的，所述的酯酶由包括以下步驟的方法制備而得：培養(yǎng)含有編碼氨 基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的酯酶的核酸的表達(dá)載體的大腸桿菌，從發(fā)酵液中得到重組 酯酶。
[0016] 本發(fā)明中，所述的編碼編碼氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的酯酶的核酸可以從 嗜酸硫化芽孢桿菌基因組中分離獲得，也可以從含有該SEQ ID No. 2所示的核酸的重組載 體中或者重組表達(dá)轉(zhuǎn)化提中分離獲得，也可以全人工合成獲得。
[0017] 本發(fā)明中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ ID No. 2的氨 基酸序列的核苷酸序列不僅僅局限于嗜酸硫化芽孢桿菌基因組中相應(yīng)的酯酶基因序列。本 發(fā)明的酯酶的編碼核苷酸序列也可以是編碼序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的其他 任何核苷酸序列。另外，還可以通過(guò)適當(dāng)引入替換、缺失或插入來(lái)提供一個(gè)多聚核苷酸的同 系物。較佳的，所述的編碼SEQ ID No. 2的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 其中，所述的多聚核苷酸的同系物也指啟動(dòng)子變體。在所述的核苷酸序列之前的 啟動(dòng)子或信號(hào)序列可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對(duì)啟 動(dòng)子的功能沒(méi)有負(fù)面影響。而且通過(guò)改變啟動(dòng)子的序列或甚至用來(lái)自不同種生物體的更有 效的啟動(dòng)子完全替換，可提1?目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。
[0019] 其中，所述的多聚核苷酸的同系物還指一種具有在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠與嗜酸硫化 芽孢桿菌基因組中相應(yīng)的酯酶基因序列的多聚核苷酸進(jìn)行雜交的堿基序列的多聚核苷 酸。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行雜交可根據(jù)"分子克隆"中描述的方式進(jìn)行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物學(xué)中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具體來(lái)說(shuō)，雜交可以按照如下步驟進(jìn)行，將一個(gè)載有被轉(zhuǎn)錄的待測(cè)DNA或RNA分 子的膜與一個(gè)標(biāo)記探針在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交。雜交緩沖液的組成為〇. lwt%SDS、5wt% 硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑以及2?8XSSC。20XSSC為3M氯化鈉和0. 3M的 檸檬酸組成的溶液。雜交溫度為50?70° C。在培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)或過(guò)夜后，用清洗緩沖液清 洗膜。清洗溫度為室溫，更優(yōu)選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成為6XSSC+0. lwt%SDS溶液， 更優(yōu)選為5XSSC+0. lwt% SDS。當(dāng)用這種清洗緩沖液清洗完膜后，就可以通過(guò)在DNA或RNA 分子內(nèi)被雜交的探針上的標(biāo)記來(lái)識(shí)別DNA或RNA分子。
[0020] 本發(fā)明所述的表達(dá)載體可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶的核酸連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領(lǐng)域常 規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒(大腸桿菌中合適載體有PLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、 pUC19、pKC30、pR印4、pHS 1、pHS2、pMBL等)、粘粒（pHZ 132 )、噬菌體或病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒 載體，腺病毒載體）等所述質(zhì)粒代表一小部分的可能質(zhì)粒，其他質(zhì)粒為技術(shù)人員公知。本發(fā) 明所述重組載體較佳地采用pET28a質(zhì)粒。較佳地，可通過(guò)下述方法制得本發(fā)明的重組表達(dá) 載體：將上游引物：5 ' -GGAATTCCATATGCCACTTGATCCGCGGGTTGAAC-3 '，下游引物：5 ' -CCCAAG CTTTCATGGCTCTTCAAACCGGGTTCTTATA-3'，模板為嗜酸硫化芽孢桿菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增所 得的擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a用限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切，形成互補(bǔ)的 粘性末端，生成含有本發(fā)明的酯酶編碼核酸片段的重組表達(dá)載體pET28a-10332。
[0021] 本發(fā)明中，所述的含有編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶的核酸的表達(dá) 載體的大腸桿菌，可通過(guò)將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌中制得。所述的 大腸桿菌優(yōu)選大腸埃希氏菌（E. coli)BL21(DE3)或大腸埃希氏菌（E. coli)DH5a，更優(yōu)選 (E. coli)BL21 (DE3)。將本發(fā)明前述重組表達(dá)載體pET28a-10332通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化 至E. coli BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即表達(dá)轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/ pET28 - 10332〇
[0022] 其中，所述的表達(dá)轉(zhuǎn)化體由常規(guī)方法培養(yǎng)，較佳的培養(yǎng)方法包括以下步驟：以1% 的接種量將表達(dá)轉(zhuǎn)化體BL21 (DE3)/ρΕΤ28 - 10332接入LB發(fā)酵液中，37°C、200rpm下培養(yǎng) 至菌體0D6QQ達(dá)到0. 4?0. 6之間時(shí)加入終濃度為ImM的IPTG繼續(xù)在25?37°C、160? 220rpm，誘導(dǎo)表達(dá)12h之后，S卩可。
[0023] 本發(fā)明由發(fā)酵液中獲得表達(dá)產(chǎn)物--氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶。較 佳的將發(fā)酵液固液分離取濕菌體，破碎細(xì)胞后，取上清液，用表達(dá)序列標(biāo)簽親和層析分離純 化得到SEQ ID NO. 1所示的酯酶。
[0024] 本發(fā)明中，所述的融合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶添加一肽段 后的融合蛋白，只要該融合蛋白還是具有酯酶活性即可。所述的添加的一肽段可以是本領(lǐng) 域常規(guī)的肽段，優(yōu)選表達(dá)親和層析標(biāo)簽(如His-tag)或者外分泌信號(hào)肽。所述的表達(dá)親和 層析標(biāo)簽His-tag是本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的是6個(gè)組氨酸。
[0025] 本發(fā)明中，所述的鄰苯二甲酸酯是如式（I )所示的化合物。鄰苯二甲酸酯在本 發(fā)明所述的酯酶的催化作用下水解，先形成如式（II)所示的鄰苯二甲酸單酯，再形成如式 (ΠΙ)所示的鄰苯二甲酸。
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種酯酶融合蛋白，其特征在于，所述的酯酶融合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示的酯酶添加一肽段后的融合蛋白，所述的肽段是表達(dá)親和層析標(biāo)簽His-tag。
3. -種分離的編碼權(quán)利要求1所述的酯酶的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一種包含如權(quán)利要求2所述的核酸的重組表達(dá)載體。
5. -種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，該重組轉(zhuǎn)化體包含如權(quán)利要求4所述的重組表 達(dá)載體。
6. -種鄰苯二甲酸酯的生物酶降解法，其特征在于，包括以下步驟，在含水介質(zhì)中，在 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶或其融合蛋白的催化下，鄰苯二甲酸酯進(jìn)行水解反 應(yīng)，形成鄰苯二甲單酸和醇，再形成鄰苯二甲酸和醇。
7. 如權(quán)利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述的鄰苯二甲酸酯是如式（I ) 所示的化合物，鄰苯二甲單酸是如式（II)所示的化合物，鄰苯二甲酸是如式(III)所示的化 合物，
其中，&和R2分別或同時(shí)代表C2-C10直鏈烷基。
8. 如權(quán)利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述含水介質(zhì)為磷酸緩沖液、 Tris-HCl緩沖液、巴比妥鈉緩沖液或者硼酸-硼砂緩沖液。
9. 如權(quán)利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述的含水介質(zhì)還含有能夠溶解 鄰苯二甲酸酯的有機(jī)溶劑，所述的有機(jī)溶劑和含水介質(zhì)的體積比為1:1000-1: 9。
10. 如權(quán)利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述水解反應(yīng)的反應(yīng)溫度是 37-60°C，所述水解反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間是1分鐘-24小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104152425SQ201310178873
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月14日
【發(fā)明者】范翔, 張曉彥, 李騁遠(yuǎn), 邢帥, 許建和 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)