專利名稱：姬松茸ssr分子標(biāo)記、其制備方法及在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及姬松茸SSR分子標(biāo)記、其制備方法及在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
姬松鸞拉丁學(xué)名Agaricus blazei Murri77，是一種珍稀食藥用菌,它在真菌分類學(xué)上屬于擔(dān)了菌門、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，原產(chǎn)于美國、巴西等地，人工栽培始于日本。1992年，福建省農(nóng)林科學(xué)院食用菌中心引進(jìn)了該菌種，并在國內(nèi)首次栽培成功(江枝和1993)，而后推廣到全國各地。該菇不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富，而目具有降血壓和抗癌的食療功效(戴玉成和楊祝良2008 ；Dai et al.2009 )。考慮到該菇的價值極高，自2001年起，我們利用Co6tl輻射誘變篩選姬松茸突變株并獲得一些具有一定程度性狀改變的菌株(江枝和等2003 ;江枝和等2004 ;翁伯琦等2007)，并予推廣。微衛(wèi)星(microsatellite)序列，又稱為簡單序列重復(fù)(simplesequence repeat,SSR)，是以少數(shù)幾個核苷酸(一般2-4個)為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。它均勻、隨機(jī)、廣泛地分布于真核生物基因組中，且 同種生物中微衛(wèi)星序列的兩側(cè)順序常較保守，其特異性引物擴(kuò)增具有良好的重復(fù)性和保真性。由于大多數(shù)微衛(wèi)星序列存在非轉(zhuǎn)錄區(qū)，變異頻率高，因而在品種間具廣泛位點變異。因此，真核生物基因組中微衛(wèi)星分了標(biāo)記的開發(fā)與利用成為一個熱點。目前對真菌微衛(wèi)星的研究主要集中在動植物病原菌，食用菌SSR分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用還非常少(張瑞穎等2010)，多用在香菇、草菇、靈芝屬上，如200710040319、201110146770、200810204544、200810204545、200810204550 等，在姬松茸目前還沒有開發(fā)使用的SSR分子標(biāo)記，無法利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行快速的菌株鑒別。目前已報道的主要開發(fā)食用菌SSR引物的途徑有3條:一是基于DNA序列數(shù)據(jù)設(shè)計開發(fā)SSR引物。這對于己經(jīng)擁有豐富EST或基因組DNA序列數(shù)據(jù)的食用菌是非?？旖莸耐緩健６腔贗SSR抑制PCR的方法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。其有過成功的報道，但也有報道稱利用該方法開發(fā)金針菇和黑木耳的SSR位點，結(jié)果非常不理想。可能是由于真菌基因組中SSR的分布密度相對較低，所以ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物并非完全是SSR之間的序列，這導(dǎo)致該方法獲得的序列中假陽性比較高(張瑞穎等2010)。三是近年來開發(fā)出的利用生物素標(biāo)記SSR探針，與基因組DNA片段雜交后，用抗生物素蛋白吸附雜交片段以富集含SSR序列的基因組片段的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供姬松茸SSR分子標(biāo)記、其制備方法及在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法，其克服了現(xiàn)有技術(shù)中暫無開發(fā)使用的姬松茸SSR分子標(biāo)記，無法利用SSR分子標(biāo)記對其進(jìn)行快速的菌株鑒別的問題，具有多態(tài)性穩(wěn)定、檢測快速、使用方便的特點。姬松茸SSR分子標(biāo)記引物的序列如下①引物A 5’ -CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和 5，-CGCCAGTTGT GCACAT-3，；②引物 B 5，-CGCATCTTGGGCTCCTT-3，和 5，-GGGGAAGCACGATCGIT-3’ ；③引物 C 5’ -CTCCCTATGACCAACAGCA-3’ 和 5’ -CCCCACGGAT TGCC-3’ ；④引物D 5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’ 和 5’ -GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3’。上述新開發(fā)出的姬松鸞SSR分子標(biāo)記填補(bǔ)了目前的姬松鸞SSR分子標(biāo)記的空白，使得利用SSR分子標(biāo)記對姬松茸進(jìn)行快速菌株鑒別成為可能。上述姬松茸SSR分子標(biāo)記的制備方法包括以下步驟:
⑴、CTAB法提取姬松茸基因組DNA:①、稱取0.1g姬松茸CcT輻射誘變菌株J2 J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中、加入液氮，迅速用電鉆搗碎，后加入600mlCTAB并于65°C水浴lh，并每20min反轉(zhuǎn)搖勻一次、加入等體積調(diào)制的氯仿-異戊醇，使步驟(I)②獲得的溶液與氯仿-異戊醇體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于_20°C放置20min，用以沉淀DNA 、步驟(I)④的溶液于12000rpm離心6min，去上清液后，加入75%乙醇清洗DNA于12000rpm離心2min后，再次去上清液；⑥、將步驟(I)⑤制得的DNA風(fēng)干后加入50 ill的TE緩沖液以溶解DNA備用；由于CTAB法對于不同作物的提取方法略有不同，上述方法是對傳統(tǒng)CTAB方法改良后的基因組DNA提取方法，使用該方法提取的姬松茸基因組DNA得率更高。⑵、利用鏈霉素磁珠富集與生物素標(biāo)記的探針雜交的技術(shù)分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列并對其測序；姬松茸遺傳背景知之甚少且基因組數(shù)據(jù)有限，直接利用DNA序列數(shù)據(jù)設(shè)計開發(fā)SSR引物的方法對姬松茸不適用。利用鏈霉素磁珠富集與生物素標(biāo)記的探針雜交的技術(shù)分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列并針對其序列設(shè)計SSR分子標(biāo)記引物是一條效率較高的途徑，對姬松茸最為適用。而且由于該方法制備的SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性穩(wěn)定的特點，還克服了基于ISSR抑制PCR的方法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記假陽性高的缺點。⑶、針對姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計，并用引物姬松茸基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增 ，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的電泳圖檢測菌株擴(kuò)增出的特異條帶，從而篩選出能夠通過擴(kuò)增出的特異條帶進(jìn)行姬松茸菌株鑒別的SSR分子標(biāo)記引物:①引物 A 5，-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3，和 5，-CGCCAGTTGTGCACAT-3 ’ ；
②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3’ 和 5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3’ ； ③弓丨物 C 5’ -CTCCCTATGACCAACAGCA-3’ 和 5’ -CCCCACGGATTGCC-3，；④弓丨物 D5’ -CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’ 和 5’ -GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3 ’。上述姬松茸SSR分子標(biāo)記在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法，該方法包括以下步驟:
(I)、用姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物①引物A 5，-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3，和 5， -CGCCAGTTGTGCACAT-3，； ②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3’ 和5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3’ ； ③引物 C 5， -CTCCCTATGACCAACAGCA-3，和5，-CCCCACGGATTGCC-3，；④引物 D 5，-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3，和 5，-GTGAGTCTGTGTGTGTGTGAGT-3’分別對姬松茸基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系為:25 yl的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶液Iii 1，10nmol/L引物I，其中上下游引物各I U I ,2.5mmol/L dNTP 2u I, 10XPCR buffer 2.5u I, Taq DNA 聚合酶 IU ;PCR 反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性7min ;隨后30個循環(huán)，每個循環(huán)94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s ;最后72°C延伸 IOmin ；
⑵、對步驟⑴所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色及拍照得到電泳圖片；
(3)、對PCR產(chǎn)物電泳圖片進(jìn)行條帶多態(tài)性分析，通過以下菌株的特異條帶對菌株品種進(jìn)行鑒別:①引物A:僅缺243bp條帶鑒別出菌株J22、J26、J29、J30 ;同時缺224、243bp條帶鑒別出菌株J3、J19、J38、J54 ；197bp條帶鑒別出菌株J29、J31 ;②引物B:318bp條帶鑒別出菌株J19 ;372bp條帶鑒別出菌株J45 ;389bp條帶鑒別出菌株J65 ;426bp條帶鑒別出菌株J51 ;③引物C:244bp條帶鑒別出菌株J14 ;④引物D:106bp條帶鑒別出菌株J19 ；201bp條帶鑒別出菌株J45。由于姬松茸SSR引物擴(kuò)增出的條帶具有很高的特異性，其反應(yīng)結(jié)果可以分為:不反應(yīng)、無區(qū)別以及有區(qū)別。通過用姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物需要鑒別的姬松茸菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的特異條帶達(dá)到快速鑒別菌株的目的。說明書附圖


圖1是姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物A對姬松茸Jl及Co6°輻射誘變J2 J66菌株的PCR擴(kuò)增 圖2是姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物B對姬松茸Jl及Co6°輻射誘變J2 J66菌株的PCR擴(kuò)增 圖3是姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物C對姬松茸Jl及Co6°輻射誘變J2 J66菌株的PCR擴(kuò)增 圖4是姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物D對姬松茸Jl及Co6°輻射誘變J2 J66菌株的PCR擴(kuò)增圖。
具體實施例方式一、材料與儀器:
姬松茸未誘變的原始菌株Jl:現(xiàn)福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所保藏中。姬松茸Co6°輻射變異菌株J2 J66，現(xiàn)福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所保藏中。其誘變條件為:鈷源活度1.12*1015 Bq，劑量為0.2-1.5kGy，吸收劑量率為11.36Gy/min。CTAB:中文名:十六烷基-三甲基-溴化銨，產(chǎn)自BBI公司，分析純；
氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、固定液(100 ml/L乙醇):北京化工廠，分析純； 姬松茸SSR分子標(biāo)記引物A、B、C、D:上海生工合成； dNTP >10 XPCR buffer > Taq DNA 聚合酶:康潤生物 GenStar ;
染色液(20 g/L AgNO3):北京化工廠，工業(yè)基準(zhǔn)含量99%以上；
顯色液(30 g/L Na2CO3):北京化工廠,優(yōu)級純；
定影液(100 mL/L HAc):北京化工廠，優(yōu)級純； eppendorf離心機(jī):型號5418 ；
PCR熱循環(huán)儀:Bio-Rad公司，型號C1000 ；
電泳儀=JUNYI公司；型號JY-SCZ6或JY-SCZ7。二、現(xiàn)提供實施例以詳細(xì)說明本發(fā)明的姬松茸SSR分子標(biāo)記、其制備方法及在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法。
1.姬松茸SSR分子標(biāo)記的制備方法如下:
⑴、CTAB法提取姬松茸基因組DNA:①、稱取0.1g姬松茸CcT輻射誘變菌株J2 J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中、加入液氮，迅速用電鉆搗碎后，加入600mlCTAB于65°C水浴lh，并每20min反轉(zhuǎn)搖勻一次、加入等體積調(diào)制的氯仿-異戊醇，使②中的溶液與其體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中；④、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于_20°C放置20min，以沉淀DNA 、于12000rpm離心6min，去上清液后，加入75%乙醇清洗DNA，于12000rpm離心2min后，去上清液； 、將⑤制得的DNA風(fēng)干后加入50 yl的TE緩沖液以溶解DNA備用；
⑵、利用鏈霉素磁珠富集與生物素標(biāo)記的探針雜交的技術(shù)分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列并對其測序:
①、調(diào)整確定所得姬松茸基因組DNA工作質(zhì)量濃度，使其為25mg/L；
②、限制性內(nèi)切酶酶切:用i&el和&0RI2種限制性內(nèi)切酶對姬松茸基因組DNA進(jìn)行復(fù)合酶切，40iU 酶切反應(yīng)體系中含 2iil #5eI(12U/u l),2u I feoRI(10U/u l),2u g DNA和4iU的IOX緩沖液。酶 切后反應(yīng)體系于85°C水浴IOmin滅活限制性內(nèi)切酶；
③、酶切產(chǎn)物與接頭連接:50ill反應(yīng)體系中含5 ill 10XT4 ligase buffer,2u I DNA連接酶，35iU基因組酶切產(chǎn)物，2 ill接頭(0.0lmmol/L)，接頭由&0RI末端單鏈寡核茸酸5’ -CTCGTAGACTGCGTACC-3’ 及 5’ -AATTGGTACGCAGTCTAC-3’ 退火結(jié)合的 Oligo A 以及 JfeeI末端單鏈寡核茸酸 5’ -GACGATGAGTCCTGAG-3’ 及 5’ -TACTCAGGACTCAT-3’ 退火結(jié)合的 OligoB組成。連接反應(yīng)16°C過夜，取出加熱至70°C，保溫lOmin，滅活連接酶活性；
④、連接產(chǎn)物PCR擴(kuò)增:分別以組成OligoA、01igo B的單鏈寡核苷酸為引物連接產(chǎn)物進(jìn)行抑制性PCR擴(kuò)增，用2%涼脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。IOOiU PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中含IOu I IOXEx 緩沖液，8 ii I 的 4 種 dNTP (2.5mmol/L) ,6u lMgC12 (25mmol/L),8 u I弓丨物(0.0lmmol/L), 4 連接產(chǎn)物和0.5 Ex Taq (5U/u 1)0反應(yīng)程序:94 °C預(yù)變性5min ;隨后30個循環(huán)，每個循環(huán)94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s ;最后72°C延仲 7min ；
⑤、磁珠富集微衛(wèi)星片段:按照Invitrogen提供的鏈霉素磁珠使用說明進(jìn)行操作，其中改進(jìn)步驟如下:⑴洗滌磁珠:取有活性的磁珠，用500 ill的0.5 X SSC緩沖液洗滌3次，然后以100 ill的0.5 X SSC緩沖液懸浮磁珠。⑵磁珠與探針結(jié)合:在磁珠懸浮液中加入10 u I探針(liimol/L)，搖勻后室溫放置lOmin。磁場中吸走上清，用300 的0.1XSSC緩沖液洗磁珠4次，洗脫未結(jié)合的探針后，形成為結(jié)合在鏈霉素磁珠上的生物素標(biāo)記的(AG)15、(CT) 15、(AC) 15、(GT) 15探針。⑶雜交:將步驟④的擴(kuò)增產(chǎn)物加入上述磁珠與微衛(wèi)星探針結(jié)合物中，68°C雜交lh。⑷洗脫:雜交結(jié)束后，將混合物置于室溫冷卻5min，在磁場中吸走上清液，用400iil 0.1 X SSC緩沖液洗滌磁珠4次，洗脫未雜交上的DNA片段。(5)收集富集的DNA片段。按說明書將磁珠懸浮于95%的甲酞胺中(加入占體積約5%的10mmol/L EDTA調(diào)節(jié)pH為8.2)，于65°C中出來5min，在磁場中吸取含有釋放出來的DNA片段的上清液，用氯仿-異丙醇法沉淀DNA片段，溶于100 u ITE緩沖液中放置冰箱備用；
⑥、PCR產(chǎn)物克隆與轉(zhuǎn)化:吸取上述DNA片段富集液IU I作為模板，分別以組成Oligo
A、Oligo B的單鏈寡核苷酸為引物進(jìn)行抑制性PCR擴(kuò)增。利用pMD-18T將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a中。經(jīng)培養(yǎng)挑取陽性克隆于含抗生素氨卡青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過夜。以引物(AG)15、(CT)15, (AC)15, (GT)15和通用引物M13對陽性克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。取5 ill PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取有PCR產(chǎn)物的克隆進(jìn)行測序。⑶、針對姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計，即對分離得到的微衛(wèi)星SSR序列進(jìn)行分析，除去重復(fù)或無效的微衛(wèi)星序列，選取微衛(wèi)星重復(fù)序列的兩端的堿基序列設(shè)計出姬松茸SSR分子標(biāo)記引物。并用該引物姬松茸基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的電泳圖檢測菌株擴(kuò)增出的特異條帶，從而篩選出能夠通過擴(kuò)增出的特異條帶進(jìn)行姬松茸菌株鑒別的SSR分子標(biāo)記引物:①引物 A 5，-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3，和 5，-CGCCAGTTGTGCACAT-3，；
②引物 B 5，-CGCATCTTGGGCTCCTT-3，和 5，-GGGGAAGCACGATCGTT-3，；③引物 C 5，-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’ 和 5，-CCCCACGGATTGCC-3，；④引物 D5’ -CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’ 和 5’ -GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3 ’。2.姬松茸SSR分子標(biāo)記在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法如下:
(I)、用姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物①引物A 5，-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3，和 5， -CGCCAGTTGTGCACAT-3，； ②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3’ 和5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3’ ； ③引物 C 5， -CTCCCTATGACCAACAGCA-3，和5，-CCCCACGGATTGCC-3，；④引物 D 5，-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3，和 5，-GTGAGTCTGTGTGTGTGTGAGT-3’分別對姬松茸基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系為25 yl的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶液Iii 1，10nmol/L引物1，其中上下游引物各Iy I ,2.5mmol/L dNTP 2u I, IOXPCR buffer 2.5 u I, Taq DNA 聚合酶 IU ;PCR 反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性7min ;隨后30個循環(huán)，每個循環(huán)94°C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s ;最后72°C延伸 IOmin ；
⑵、對步驟⑴所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，得到電泳圖片。具體操作程序為:①、配制聚丙烯酰胺凝膠，吸取7 iU的PCR產(chǎn)物和I y I的上樣緩沖液，充分混勻上樣。上樣完畢后用140V電壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距凝膠下邊Icm 2cm時，結(jié)束電泳。②、電泳結(jié)束后，關(guān)閉電泳儀，拿出玻璃板并用藥匙柄小心撬開，移走上層玻璃板，將附有凝膠的玻璃板以凝膠面朝下浸入已準(zhǔn)備好的放有雙蒸水的干凈的瓷盤中，凝膠即落下，或輕輕用藥匙柄把膠剝開一角，凝膠即可落入盤內(nèi)；③、凝膠的固定:倒掉瓷盤中的水，加入固定液(100 ml/L乙醇)，在搖床上緩緩搖動15 min;倒掉瓷盤中的固定液，再用雙蒸水洗2次；④、凝膠的染色:倒掉瓷盤中的水，加入染色液(20g/L AgNO3),在搖床上緩緩搖動染色20 min;⑤、洗膠:倒掉瓷盤中的染色液，用雙蒸水洗2次,共計Imin;⑥、凝膠的顯影:加少量顯色液(30g/L Na2CO3)沖洗15 S，再加一定體積顯色液，輕搖瓷盤直到看到清晰的條帶，一般為5 6min，時間不要過長，否則背景會過深；⑦、終止顯影:倒掉瓷盤中的顯影液，迅速倒入定影液(100 ml/L HAc),緩緩搖動2 3min;⑧、電泳圖的獲得:倒掉瓷盤中的定影液，用雙蒸水洗2次，每次2min，將凝膠放在空氣中干燥，可用數(shù)碼相機(jī)或凝膠成像儀攝像，獲得電泳圖。 ⑶、對PCR產(chǎn)物電泳圖片進(jìn)行條帶分析，通過姬松茸菌株的特異條帶進(jìn)行菌株品種的鑒別，具體如下:
姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物:①引物A 5’ -CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和 5， -CGCCAGTTGTGCACAT-3，； ②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3，和5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3，； ③引物 C 5， -CTCCCTATGACCAACAGCA-3’ 和5，-CCCCACGGATTGCC-3，；④引物 D 5，-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3，和 5，-GTGAGTCTGTGTGTGTGTGAGT-3’對姬松茸Jl及Co60輻射誘變J2 J66菌株的PCR擴(kuò)增圖請見附圖1
4，具體加樣順序請見下表:
權(quán)利要求
1.姬松茸SSR分子標(biāo)記，其特征在于:該分子標(biāo)記引物的序列如下①引物 A 5， -CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’ 和 5， -CGCCAGTTGTGCACAT-3，； ②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3，和 5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3’ ； ③引物 C 5，-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’ 和 5，-CCCCACGGATTGCC-3，；④引物 D.5’ -CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’ 和 5’ -GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3 ’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬松茸SSR分子標(biāo)記的制備方法，其特征在于:其包括以下步驟， ⑴、CTAB法提取姬松茸基因組DNA:①、稱取0.1g姬松茸Co6°輻射誘變菌株J2 J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中、加入液氮，迅速用電鉆搗碎，后加入600mlCTAB并于65°C水浴lh，并每20min反轉(zhuǎn)搖勻一次、加入等體積調(diào)制的氯仿-異戊醇，使步驟(I)②獲得的溶液與氯仿-異戊醇體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于_20°C放置20min 、步驟(I)④的溶液于12000rpm離心6min，去上清液后，加入75%乙醇清洗DNA于12000rpm離心2min后，再次去上清液； 、將步驟(I) ⑤制得的DNA風(fēng)干后加入50 ill的TE緩沖液； ⑵、利用鏈霉素磁珠富集與生物素標(biāo)記的探針雜交的技術(shù)分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列并對其測序； ⑶、針對姬松茸基因組DNA的SSR微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計，并用引物姬松茸基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的電泳圖檢測菌株擴(kuò)增出的特異條帶，從而篩選出能夠通過擴(kuò)增出的特異條帶進(jìn)行姬松茸菌株鑒別的SSR分子標(biāo)記引物:①引物 A 5，-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3，和 5，-CGCCAGTTGTGCACAT-3 ’ ；②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3’ 和 5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3，； ③引物 C 5’ -CTCCCTATGACCAACAGCA-3’ 和 5’ -CCCCACGGATTGCC-3’ ；④引物 D5’ -CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’ 和 5’ -GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3 ’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬松茸SSR分子標(biāo)記在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法，其特征在于:其包括以下步驟， ⑴、用所述姬松茸特異SSR分子標(biāo)記引物①引物A 5’ -CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和 5， -CGCCAGTTGTGCACAT-3，； ②引物 B 5， -CGCATCTTGGGCTCCTT-3’ 和.5， -GGGGAAGCACGATCGTT-3’ ； ③引物 C 5， -CTCCCTATGACCAACAGCA-3，和.5， -CCCCACGGATTGCC-3，；④引物 D 5， -CCGCACTCTCCTCCAGTT-3，和 5， -GTGAGTCTGTGTGTGTGTGAGT-3’分別對姬松茸基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系為:25 U I的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶液I ii 1，10nmol/L引物1，其中上下游引物各Iy I ,.12.5mmol/L dNTP 2u I, 10XPCR buffer 2.5u I, Taq DNA 聚合酶 IU ；PCR 反應(yīng)程序為:.94°C預(yù)變性7min ;隨后30個循環(huán)，每個循環(huán)94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s ;最后 72°C延伸 IOmin ； ⑵、對步驟⑴所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，得到電泳圖片； ⑶、對PCR產(chǎn)物電泳圖片進(jìn)行條帶分析，通過以下菌株的特異條帶對菌株品種進(jìn)行鑒別:①引物A:僅缺243bp條帶鑒別出菌株J22、J26、J29、J30 ;同時缺224、243bp條帶鑒別出菌株J3、J19、J38、J54 ;197bp條帶鑒別出菌株J29、J31 ;②引物B:318bp條帶鑒別出菌株J19 ；372bp條帶鑒別出菌株J45 ；389bp條帶鑒別出菌株J65 ；426bp條帶鑒別出菌株J51 ；③引物C:244bp條帶 鑒別出菌株J14 ;④引物D:106bp條帶鑒別出菌株J19 ；201bp條帶鑒別出菌株J45。
全文摘要
本發(fā)明公開了姬松茸SSR分子標(biāo)記及其在鑒別姬松茸菌株上的應(yīng)用方法，姬松茸SSR分子標(biāo)記為①引物A5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’；②引物B5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’；③引物C5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGTGTGTGTGTGAGT-3’。其克服了現(xiàn)有技術(shù)中暫無開發(fā)使用的姬松茸SSR分子標(biāo)記，無法利用SSR分子標(biāo)記對其進(jìn)行快速的菌株鑒別的問題，具有多態(tài)性穩(wěn)定、檢測快速、使用方便的特點。
文檔編號C12N15/11GK103215263SQ201310158060
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月2日
發(fā)明者劉朋虎, 陳堅, 肖淑霞, 陳愛華, 顏孫安, 翁伯琦, 雷錦桂, 王義祥, 鄭少玲, 江枝和 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所