專利名稱：一種鑒定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物菌群構(gòu)成鑒定領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)，也稱為老面、老酵頭或面肥，就是上次作饅頭留下來的發(fā)酵面團(tuán)，以此作為主要發(fā)酵菌種，加入面粉和成面團(tuán)，過夜發(fā)酵，次日在面團(tuán)中添加面粉和適量堿，和面后成型醒發(fā)蒸制饅頭。傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)是多種微生物共生的微生態(tài)體系，是多種微生物糖化、發(fā)酵、酯化的協(xié)同作用，組織結(jié)構(gòu)更趨于柔軟細(xì)膩而富有彈性的口感，而且生成了醇、酯、醛、酚、酸、低分子糖、多肽、氨基酸等多種風(fēng)味物質(zhì)。國外面包的酸面團(tuán)與我國傳統(tǒng)發(fā)酵劑相似，但國外對(duì)于酸面團(tuán)已經(jīng)研究了很多年了，而我國傳統(tǒng)發(fā)酵劑的研究，特別是微生物的研究卻非常薄弱。國外對(duì)酸面團(tuán)微生物的研究表明，其菌種組成與地理位置也有著很大的聯(lián)系，除了起著發(fā)酵面團(tuán)的作用的酵母菌及 霉菌等真菌，另一類主要微生物是乳酸菌，乳酸菌利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生乳酸、醋酸、丙酸等有機(jī)酸，可與乳酸發(fā)酵中產(chǎn)生的醇、醛、酮等物質(zhì)相互作用，形成多種新的呈味物質(zhì)；除乳酸菌代謝的主要產(chǎn)物乳酸外，還能形成細(xì)菌素和類細(xì)菌素等抑菌類物質(zhì)，可延長產(chǎn)品的貨架期；同時(shí)還可以產(chǎn)生胞外多糖(EPS)，具有增稠、乳化及膠凝作用，乳酸菌本身對(duì)腸道粘膜的吸附，可以起到抗腫瘤，提高免疫的作用。國外研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌協(xié)同酵母發(fā)酵生產(chǎn)面包可產(chǎn)生良好的風(fēng)味、減少抗?fàn)I養(yǎng)因子、延長產(chǎn)品保質(zhì)期等。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是由Fischer和Lerman在1979年提出并用于檢測(cè)DNA突變的電泳技術(shù)，是利用片段之間GC含量不同，在不同變性濃度梯度下解鏈程度不同而將不同片段分離開來。DGGE分辨度高于瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，理論上可以檢測(cè)到單個(gè)核苷酸水平的差異，已被廣泛的應(yīng)用于分析環(huán)境微生物菌群結(jié)構(gòu)、腸道及口腔中微生物菌群多樣性的分析。目前，采用DGGE技術(shù)分析我國不同地區(qū)發(fā)酵酸面團(tuán)中微生物菌群多樣性的研究尚屬空白。國外面包的發(fā)酵劑即酸面團(tuán)與我國饅頭的老面有相似的制作原理和發(fā)酵工藝，但國外研究者已對(duì)酸面團(tuán)中具有代表性的菌種及其特性研究的比較透徹，有些已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，而我國有豐富的發(fā)酵劑資源，但對(duì)其認(rèn)識(shí)尚處于初級(jí)階段。因此，迫切需要揭示我國傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中微生物的菌群結(jié)構(gòu)及其種類，合理開發(fā)我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物資源。本發(fā)明中采用α -淀粉酶預(yù)處理樣品，構(gòu)建了以DGGE為基礎(chǔ)的技術(shù)方法，可以針對(duì)我國傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌的菌落組成及微生物鑒定，對(duì)開發(fā)我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源提供參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種鑒定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成的方法，用于分析發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成和種類，具有快速簡便、特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。一種鑒定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成的方法，包括:(I)將發(fā)酵酸面團(tuán)用淀粉酶酶解，得到酶解物；(2)從酶解物中提取細(xì)菌總基因組DNA ；(3 )以提取的細(xì)菌總基因組DNA為模板，利用帶有GC夾子的細(xì)菌通用引物341 f-GC與543r進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(4)以第一輪PCR擴(kuò)增后得到的陽性產(chǎn)物為模板，利用細(xì)菌通用引物341f與543r進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(5 )對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增和第二輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成。發(fā)酵酸面團(tuán)可以為傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)，即上次做饅頭留下來的發(fā)酵面團(tuán)。傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌種類多，先對(duì)其進(jìn)行酶解后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，可有效鑒定出細(xì)菌菌相組成。步驟(I)中，所述的酶解可以為:將發(fā)酵酸面團(tuán)加入淀粉酶溶液中，混勻，進(jìn)行酶解反應(yīng)。所述的淀粉酶可以為α -淀粉酶。發(fā)酵酸面團(tuán)中淀粉含量較高，在樣品熱處理時(shí)，淀粉易發(fā)生溶脹，包裹住發(fā)酵酸面團(tuán)中的微生物，從而影響微生物總基因組DNA的提取，α -淀粉酶能有效酶解發(fā)酵酸面團(tuán)中淀粉α -1, 4糖苷鍵，生成小分子糊精和其他低聚糖，增加面團(tuán)的流動(dòng)性，使酸面團(tuán)中微生物充分釋放于溶液中，以便有效提取全部微生物的總DNA。采用α-淀粉酶的特征是其能引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應(yīng)的消失，最終產(chǎn)物在分解直鏈淀粉時(shí)以葡 萄糖為主，此外，還有少量麥芽三糖及麥芽糖。為了獲得更好的酶解效果，所述的發(fā)酵酸面團(tuán)與淀粉酶的重量比優(yōu)選為
0.5:1-1:1 ;更優(yōu)選為 1:1。所述的酶解溫度優(yōu)選為60_65°C，時(shí)間優(yōu)選為20_30min。該酶解條件下，淀粉酶對(duì)
發(fā)酵酸面團(tuán)的水解程度合適。所述的酶解反應(yīng)可以在水浴或金屬浴中進(jìn)行，優(yōu)選在金屬浴中進(jìn)行。金屬浴升溫速度較快，保溫效果好，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。步驟(2)中，可以采用細(xì)菌DNA試劑盒提取酸面團(tuán)酶解物中的細(xì)菌總基因組DNA。細(xì)菌DNA試劑盒可以選用細(xì)菌DNA OMEGA試劑盒，提取效果較好。提取細(xì)菌總基因組DNA后，可以將DNA的濃度調(diào)整為45_55ng/uL，再進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；優(yōu)選調(diào)整為50ng/uL。將DNA濃度調(diào)整為統(tǒng)一的固定值，這樣可以比較菌種在不同樣品內(nèi)的菌量，通過DGGE指紋圖譜中條帶的明暗，可以半定量地分析存在于發(fā)酵酸面團(tuán)中優(yōu)勢(shì)微生物的種類。步驟(3)中，第一輪PCR所用引物的正向引物341f_GC為引物341f帶上GC夾子(GC clamp)，引物341f的堿基序列如SEQ ID N0.1所示，GC夾子的堿基序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物543r的堿基序列如SEQ ID N0.3所示。細(xì)菌通用引物341f與543r可以擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)域，本發(fā)明選用的引物擴(kuò)增片段約為240bp ;其中，正向引物帶有GC夾子，GC夾子是指富含GC的一段DNA序列，一般為40-50個(gè)堿基對(duì)，含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列處，其解鏈溫度比AT的雙鍵要高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當(dāng)加了 GC夾子后，DNA片段中基本上每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。所述的第一輪PCR為降落PCR (Touchdown PCR)。降落PCR是主要用于避免非特異性PCR產(chǎn)物的出現(xiàn)，確保第一個(gè)引物一模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間，即特異行擴(kuò)增的反應(yīng)物之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時(shí)，特異產(chǎn)物在此時(shí)已經(jīng)有一個(gè)幾何數(shù)的起始優(yōu)勢(shì)，在剩余的反應(yīng)中，特異產(chǎn)物會(huì)競爭非特異產(chǎn)物，特異產(chǎn)物始終優(yōu)先擴(kuò)增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的擴(kuò)增產(chǎn)物。降落PCR的反應(yīng)體系可以為:25μ I的反應(yīng)體系組成如下:DNA模版2μ I,引物 341 f-GC 與 543r 的兩種引物各 0.5 μ 1，dNTPs2.5 μ 1，10 X buff er2.5 μ 1，Ex Taq 酶
0.125 μ 1，蒸餾水 16.875 μ I。降落PCR的反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性lmin，65°C引物復(fù)性lmin，72°C引物延伸lmin，循環(huán)20次，每循環(huán)一次，復(fù)性溫度降低0.5°C ;之后，94°C變性lmin，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)5次后72°C終延伸lOmin。由于存在于傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中的細(xì)菌種類較多，為了達(dá)到每一種細(xì)菌的解鏈溫度，采用該降落PCR反應(yīng)條件，可以最大程度地獲得各種細(xì)菌的PCR片段，便于DGGE分析。為了增加結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以在第一輪PCR擴(kuò)增中分別設(shè)置陽性對(duì)照(已知細(xì)菌)和陰性對(duì)照(水)，以避免出現(xiàn)PCR的假陽性擴(kuò)增。第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用1.8-2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。步驟(4)中，為了使存在于發(fā)酵酸面團(tuán)中的微量細(xì)菌的DNA含量達(dá)到DGGE分析的檢測(cè)限，因此，進(jìn)行所述的第二輪PCR用來進(jìn)一步增加細(xì)菌基因組DNA的含量。第二輪PCR所用引物為不帶GC夾子的細(xì)菌通用引物341f與543r。正向引物341f的堿基序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物543r的堿基序列如SEQ ID N0.3所示。引物341f/543r 可擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA V3 區(qū)。第二輪PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性4min，然后在95°C變性lmin，55°C引物復(fù)性lmin，72°C引物延伸lmin，循環(huán)4次，72°C終延伸lOmin。步驟(5)中，所述的分析可以包括如下步驟:合并第一輪PCR擴(kuò)增和第二輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物并純化，然后進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分離，將得到的擴(kuò)增條帶進(jìn)行染色、純化、克隆測(cè)序，之后與標(biāo)準(zhǔn)菌序列比對(duì)，判定細(xì)菌種類。變性梯度凝膠電泳分辨率高，可以有效鑒定出發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成。優(yōu)選地，所述的變性梯度凝膠電泳的變性梯度為30%_60%，電泳電壓為48-52V，電泳時(shí)間為12_13h ;更優(yōu)選地，電泳電壓為50V，電泳時(shí)間為13h。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低壓長時(shí)間電泳，可使不同DNA片段有效解鏈，達(dá)到更好的分離效果。所述的染色可以采用SYBR Green I染色。本發(fā)明采用α -淀粉酶酶解后的樣品進(jìn)行總基因組DNA提取，采用細(xì)菌通用引物16S rDNA V3區(qū)341f與543r進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行DGGE凝膠電泳分離鑒定，從分子水平對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成進(jìn)行了鑒定，同時(shí)能實(shí)現(xiàn)半定量分析，具有穩(wěn)定、高效、成本低的特點(diǎn)，為開發(fā)我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源提供參考。


圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2為五個(gè)不同地區(qū)發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌PCR-DGGE指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例在本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑盒廠商所建議的條件。實(shí)施例1按照如圖1所示的技術(shù)流程進(jìn)行操作，具體為:(I)取五個(gè)來自我國不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)，編號(hào)為Hn-87、Sx_91、Gs_107、Hf-112和Hr-122，分別取發(fā)酵酸面團(tuán)200mg于1.5mL離心管中，加入lmL20%a-淀粉酶溶液，震蕩混勻。(2)將混合液置于65°C金屬浴中加熱酶解20min，在12000Xg條件下離心5min，
棄沉淀，取上清，得到酶解物。(3)采用細(xì)菌DNA OMEGA試劑盒·提取酶解物中細(xì)菌總基因組DNA。(4) Nandrop2000檢測(cè)提取的DNA的濃度，并調(diào)整DNA濃度為50ng/uL。(5)將調(diào)整后的DNA溶液進(jìn)行降落PCR (Touchdown PCR,第一輪PCR)擴(kuò)增；引物為帶有GC夾子的細(xì)菌通用引物16S rDNA V3區(qū)341f與543r ；341f:5，-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，, 543r:5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，，GC 夾子:5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCC CCGCCCG-3，。25 μ I的反應(yīng)體系組成如下:DNA模板2 μ 1，引物341f_GC和542r的兩種引物各
0.5 μ 1，dNTPs2.5 μ 1，10Xbuffer2.5 μ 1，Ex Taq 酶 0.125 μ 1，雙蒸水 16.875 μ I。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性lmin，65 °C引物復(fù)性lmin，72°C引物延伸lmin，循環(huán)20次，每循環(huán)一次，復(fù)性溫度降低0.5 °C ;之后，94°C變性lmin，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)5次后72°C終延伸IOmin0(6)將PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，將陽性結(jié)果再次進(jìn)行Reconditioning PCR 反應(yīng)(第二輪 PCR 擴(kuò)增)，引物為不帶GC夾子的細(xì)菌通用引物341f: 5’ -CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，543r:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 4min，然后在 95°C變性 lmin，55°C 引物復(fù)性lmin，72°C引物延伸lmin，循環(huán)4次，72°C終延伸lOmin。(7)合并步驟(5)和步驟(6)的PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物純化后，進(jìn)行DGGE凝膠電泳，上樣量為15μ 1，加入7μ I loading buffer，變性梯度為30%_60% (膠濃度)，50V條件下電泳13h ;電泳結(jié)束后用SYBR Green I染色lh。(8)將DGGE膠在紫外燈下進(jìn)行切割條帶，并用超純水浸沒，4°C條件下過夜。(9)用不帶GC夾子的引物對(duì)上述浸液進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行片段驗(yàn)證后，進(jìn)行克隆測(cè)序。(10)測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行驗(yàn)證，鑒定目的微生物的種類。圖2為五個(gè)不同地區(qū)發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌PCR-DGGE指紋圖譜。根據(jù)克隆測(cè)序、NCBI比對(duì)結(jié)果五種樣品的細(xì)菌菌相組成結(jié)果見表I和表2，表明本實(shí)施例方法可以快速鑒別出發(fā)酵酸面團(tuán)中的細(xì)菌菌相組成。
表IDGGE指紋圖譜中條帶鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鑒定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成的方法，包括: (1)將發(fā)酵酸面團(tuán)用淀粉酶酶解，得到酶解物； (2)從酶解物中提取細(xì)菌總基因組DNA； (3)以提取的細(xì)菌總基因組DNA為模板，利用帶有GC夾子的細(xì)菌通用引物341f-GC與543r進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增； (4)以第一輪PCR擴(kuò)增后得到的陽性產(chǎn)物為模板，利用細(xì)菌通用引物341f與5431■進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增； (5 )對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增和第二輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的淀粉酶為α-淀粉酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的發(fā)酵酸面團(tuán)與淀粉酶的重量比為0.5:1-1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的酶解溫度為60-65°C，時(shí)間為20-30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，提取細(xì)菌總基因組DNA后，將DNA的濃度調(diào)整為45-55ng/uL，再進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的第一輪PCR為降落PCR。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，降落PCR的反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性lmin，65°C引物復(fù)性lmin，72°C引物延伸lmin，循環(huán)20次，每循環(huán)一次，復(fù)性溫度降低0.5 0C ;之后，94°C變性Imin，55 O復(fù)性lmin，72°C延伸Imin，循環(huán)5次后72 °C終延伸IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，第二輪PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性4min，然后在95°C變性lmin，55°C引物復(fù)性lmin，72°C引物延伸lmin，循環(huán)4次，72°C終延伸lOmin。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的分析包括如下步驟:合并第一輪PCR擴(kuò)增和第二輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物并純化，然后進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分離，將得到的擴(kuò)增條帶進(jìn)行染色、純化、克隆測(cè)序，之后與標(biāo)準(zhǔn)菌序列比對(duì)，判定細(xì)菌種類。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的變性梯度凝膠電泳的變性梯度為30%-60%，電泳電壓為48-52V，電泳時(shí)間為12_13h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成的方法，包括將發(fā)酵酸面團(tuán)用淀粉酶酶解，得到酶解物；從酶解物中提取細(xì)菌總基因組DNA；以提取的細(xì)菌總基因組DNA為模板，利用帶有GC夾子的細(xì)菌通用引物341f-GC與543r進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；以第一輪PCR擴(kuò)增后得到的陽性產(chǎn)物為模板，利用細(xì)菌通用引物341f與543r進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增和第二輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成。本發(fā)明對(duì)發(fā)酵酸面團(tuán)先進(jìn)行酶解后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過變性梯度凝膠電泳分離，從分子水平對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中細(xì)菌菌相組成進(jìn)行了鑒定，具有穩(wěn)定、高效、成本低的特點(diǎn)，為開發(fā)我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物資源提供參考。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103224985SQ201310152558
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者何國慶, 張國華, 柯樂芹, 何捷, 朱永勝, 朱立穎, 王欣 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)