專利名稱：滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的分子鑒定方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻種子純度的分子鑒定方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說屬于分子輔助育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本和最關(guān)鍵的生產(chǎn)資料，其純度的高低是衡量種子質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)，我國對不同作物種子純度進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。我國是世界上最大的雜交水稻種子生產(chǎn)國和消費(fèi)國，雜交水稻種植面積已占全國水稻種植總面積的60%以上，具有龐大的雜交水稻種子市場。雜交水稻種子的純度，直接關(guān)系到雜種優(yōu)勢的發(fā)揮，純度的下降將導(dǎo)致作物產(chǎn)量的明顯降低，保證種子純度，是確保雜交水稻增產(chǎn)的重要措施，也是雜交水稻種業(yè)的命脈。種子純度降低的主要原因:一是由于制種過程的種子生產(chǎn)、收獲、脫粒、加工、運(yùn)輸?shù)瘸绦蛑械姆侨藶橐蛩卦斐傻纳锘祀s和機(jī)械混雜，二是一些繁種單位或個(gè)人為了片面追求經(jīng)濟(jì)效益而忽視種子純度，甚至摻雜使假，人為因素導(dǎo)致種子純度降低。機(jī)械混雜指在良種繁育過程中的各環(huán)節(jié)中發(fā)生其它品種混雜。如:種、收、運(yùn)、脫、曬、藏的過程中，造成繁育的品種內(nèi)混有不同品種的種子；以及輪作的不合理和田間管理的不當(dāng)，前作和雜草種子的自然脫落，以及使用了未經(jīng)腐熟的廄肥和堆肥有可能混有作物種子和雜草種子等都會造成機(jī)械混雜。生物學(xué)混雜是指在良種繁育過程中，由于不同品種隔離不當(dāng)，而使其發(fā)生了天然雜交造成品種純度、典型性狀以及產(chǎn)量和品質(zhì)等降低，或是品種本身遺傳性發(fā)生變化和自然突變等導(dǎo)致品種的混雜。因此在水稻雜交種子銷售使用前，需對其純度和真實(shí)性進(jìn)行鑒定。

種子鑒定技術(shù)經(jīng)歷了由淺到深、由宏觀到微觀、由單一到多種技術(shù)相結(jié)合的過程。種子純度鑒定的主要方法有常規(guī)鑒定法、電泳鑒定法、分子生物學(xué)技術(shù)鑒定法。伴隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，鑒定雜交水稻種子純度的方法由傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記逐步發(fā)展到集形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA(Deoxyribonucleic Acid)分子標(biāo)記鑒定為一體的綜合鑒定技術(shù)體系。DNA分子標(biāo)記鑒定法與其它方法相比較，具有不受環(huán)境影響、多態(tài)性高、數(shù)量豐富、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用的標(biāo)記有RFLP(Restricted Fragment LengthPolymorphisms) > RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、SSR(Single SequenceRepeat)和 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)等，其中以 SSR 標(biāo)記在水稻雜交種子鑒定中具有較強(qiáng)的利用優(yōu)勢，它操作簡便、多態(tài)性高、重復(fù)性好、呈共顯性遺傳。利用SSR分子標(biāo)記對水稻，玉米等雜交品種種子純度鑒定的研究已有不少報(bào)道。栽培稻全基因組DNA序列測定的完成以及比較基因組學(xué)的深入研究，為水稻的理論研究和遺傳育種提供了大量的生物信息。栽培稻全基因組DNA序列測定的完成以及比較基因組學(xué)的深入研究，為水稻的理論研究和遺傳育種提供了大量的生物信息。Shen等(2004)利用粳稻Nipponbare和秈稻9311基因組序列構(gòu)建了水稻基因組水平的DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，其中包括了 I 703 176 個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)和 479 406個(gè)插入/缺失多態(tài)性(insert/deletion, InDel)。Nipponbare和9311序列間插入/缺失片段在25-75bp之間，易進(jìn)行分子檢測。馮芳君等比較了水稻InDel和SSR標(biāo)記多態(tài)性，認(rèn)為InDel標(biāo)記具有數(shù)量多、穩(wěn)定性強(qiáng)及易于檢測的優(yōu)點(diǎn)。盧寶榮等利用秈稻和粳稻特異InDel位點(diǎn)進(jìn)行秈粳分化驗(yàn)證，確定了與秈粳遺傳分化密切相關(guān)的34個(gè)InDel位點(diǎn)，構(gòu)建了 “InDel分子指數(shù)法”進(jìn)行秈粳性鑒定。在玉米、黃瓜上也有利用InDel標(biāo)記準(zhǔn)確鑒定雜交種子純度的報(bào)道。國家對雜交水稻DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)研究十分重視。2007年全國農(nóng)技中心頒布GB/T20396-2006《三系雜交水稻及親本真實(shí)性和品種純度鑒定DNA分析方法》，同期頒布了 NY/T1433-2007《水稻品種鑒定DNA指紋方法》，為雜交水稻種子純度的分子檢測提供了依據(jù)。滇型雜交粳稻滇雜31 (榆密15AX南34)是云南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻作研究所用育性穩(wěn)定的滇I型不育系榆密15A和優(yōu)質(zhì)抗病的恢復(fù)系南34配組育成的一個(gè)中熟三系雜交粳稻組合。該組合雜種優(yōu)勢強(qiáng)、豐產(chǎn)性好、高抗稻瘟病、米質(zhì)優(yōu)、食味好、適應(yīng)性廣，于2002年7月通過云南省農(nóng)作物品種審定，目前在云南、四川、貴州、湖南、廣西等省區(qū)廣泛種植，獲得了顯著的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。滇型雜交粳稻滇雜31種子不純主要是由機(jī)械混雜和生物學(xué)混雜引起的，混雜的類型主要有不育系、保持系、異品種、不育系育性回復(fù)的可育株等。國內(nèi)外對雜交秈稻種子利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行純度鑒定的研究較多，但在雜交粳稻種子純度鑒定的報(bào)道甚少，主要采用的是我們目前普遍使用的田間種植鑒定方法(將當(dāng)年生產(chǎn)的雜交種子送往中國海南省，從幼苗至成熟期間根據(jù)植株形態(tài)特征和生育特性的差異，鑒別雜株的方法。鑒定的主要性狀有:株高、株型、莖粗和莖色、葉形和葉色、葉耳顏色和茸毛、穗形和穗色、芒的有無、芒的長短和顏色、粒形和粒色、抗病性和生長特性等)，該方法需要等到成熟期才能看到結(jié)果，所需時(shí)間周期長、工作量大，易受環(huán)境因素影響，成本高。目前還沒有一種分子純度鑒定技術(shù)能準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的鑒定滇型雜交粳稻滇雜31種子純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能準(zhǔn)確、快速、高效地對滇型雜交粳稻滇雜31種子純度及雜株混雜類型進(jìn)行分子鑒定的方法及其專用引物。本發(fā)明的技術(shù)方案是:1.滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的分子鑒定方法，包括以下步驟:(I)以滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子為對照材料，取對照材料和200粒以上的待鑒定水稻種子于20°C 35°C條件下發(fā)芽；(2)發(fā)芽后水培7 10天，分別取所述的對照材料的葉片為對照樣品和待鑒定水稻的葉片為待鑒定樣品，每個(gè)樣品分成4等份，4等份分別加入試劑1、試劑2、試劑3、試劑4后，按常規(guī)PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的試劑1、試劑2、試劑3和試劑4均是在相同的常規(guī)PCR反應(yīng)體系分別加入不同的引物，試劑I為常規(guī)PCR反應(yīng)體系加入DZ31-1引物，試劑2為常規(guī)PCR 反應(yīng)體系加入DZ31-2引物，試劑3為常規(guī)PCR反應(yīng)體系加入DZ31-3引物，試劑4為常規(guī)PCR反應(yīng)體系加入DZ31-4引物；常規(guī)PCR反應(yīng)體系是采用15 μ I反應(yīng)體系，其中:ddH20 10.86 μ 1，擴(kuò)增模板DNA為打取的樣品葉片，IOXPCR buffer 1.50 μ l,25mM MgCl2 1.14 μ 1,2.5mM dNTP mixture
1.20 μ 1，50 μ M 上游引物 0.10 μ 1，50 μ M 下游引物 0.10μ 1，5U.μ L-1Taq 0.10 μ I ；所述的常規(guī)PCR反應(yīng)程序是預(yù)變性1:98 °C 2min,預(yù)變性2:96 V 2min ；變性940C 20s、退火 56°C 20s、延伸 72°C 30s, 35 個(gè)循環(huán)；延伸 72°C 7min ;10°C保存。(3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用含EtBr 0.1 μ g/ml的2%瓊脂糖凝膠電泳分離；(4)在紫外透射儀上檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳結(jié)果，依據(jù)電泳結(jié)果，按如下①至④步的鑒別即鑒定出滇型雜交粳稻滇雜31種子中雜株數(shù)量:①用DZ31-1引物擴(kuò)增后(圖1A)，滇型雜交粳稻滇雜31的雜交種分子量為442bp和521bp，基因型為雜合型(雙帶)，其它類型分子量的為雜株；②用DZ31-2引物擴(kuò)增后(圖1B和圖2)，滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為346bp，其它類型分子量的為雜株；③用DZ31-3引物擴(kuò)增后(圖1C)，滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為428bp，其它類型分子量的為雜株；④用DZ31-4引物擴(kuò)增后(圖1D)，滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為350bp，其它類型分子量的為雜株；

所述的DZ31 -1引物由上游引物DA31 -1-F和下游引物DA31 -1-R組成，上游引物DA31-1-F的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，下游引物DA31-1-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示;所述的DZ31-2引物由上游引物DZ31-2-F和下游引物DZ31-2-R組成，上游引物DZ31-2-F的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，下游引物DZ31-2-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R組成，上游引物DZ31-3-F的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，下游引物DZ31-3-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述的DZ31-4引物由上游引物DZ31-4-F和下游引物DZ31-4-R組成，上游引物DZ31-4-F的堿基序列如序列表中SEQ IDNO:7所示，下游引物DZ31-4-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。2.一種滇型雜交粳稻滇雜31種子中雜株的混雜類型的分子鑒定方法:按照滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的分子鑒定方法中所述的方法進(jìn)行，并在步驟(I)增加4個(gè)對照材料于20°C 35°C發(fā)芽，水培7 10天，所述的4個(gè)對照分別為母本保持系榆密15B種子、父本恢復(fù)系南34種子、母本育性回復(fù)株榆密15A可育株種子、秈稻種子；以及在步驟(4)按如下①至④步的鑒別及相互對比即鑒定出滇型雜交粳稻滇雜31種子中雜株的混雜類型:①DZ31-1引物用于鑒定保持系混雜(圖1A)，擴(kuò)增后滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為442bp和521bp，基因型為雜合型(雙帶)，PCR產(chǎn)物分子量為442bp是母本保持系榆密15B混雜，PCR產(chǎn)物分子量為521bp是父本恢復(fù)系南34、或母本育性回復(fù)株榆密15A可育株、或秈稻混雜，；②DZ31-2引物用于鑒定除父母本以外的其它粳稻混雜(圖1B和圖2)，擴(kuò)增后滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為346bp，PCR產(chǎn)物分子量為425bp是其它粳稻材料混雜；③DZ31-3引物用于鑒定秈稻或是秈粳雜交種子混雜(圖1C)，擴(kuò)增后滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為428bp，PCR產(chǎn)物分子量為384bp為秈稻混雜，384bp和428bp均有的是秈粳雜交種混雜；
④DZ31-4引物用于在DZ31-1的基礎(chǔ)上鑒定雜株中的母本育性回復(fù)的可育株和恢復(fù)系混雜(圖1D)，擴(kuò)增后350bp是父本恢復(fù)系南34混雜，PCR產(chǎn)物分子量為780bp是母本育性回復(fù)株榆密15A可育株混雜。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的一組專用引物:DZ31-1引物，DZ31-2引物，DZ31-3引物和DZ31-4引物，鑒定滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的準(zhǔn)確性高，準(zhǔn)確率為99%以上，而且鑒定一個(gè)雜交種群體用時(shí)不超過15天，鑒定材料只需發(fā)芽，PCR反應(yīng)及電泳即可，達(dá)到了準(zhǔn)確、快速、高效。本發(fā)明方法簡單易行，鑒定不受季節(jié)的限制，避免了田間形態(tài)鑒定的繁瑣程序，鑒別方法經(jīng)濟(jì)，鑒定一粒種子是否為真雜種需人民幣約1.0 2.0元，鑒定成本低。本發(fā)明除了鑒定雜交種子純度外，還對混雜株的真實(shí)性進(jìn)行了鑒定，確定雜株的混雜類型，能有效指導(dǎo)在生產(chǎn)過程中減少母本保持系、母本育性回復(fù)株、秈稻以及秈粳雜交種混雜發(fā)生，為制備高純度的雜交種子提供理論支持。


圖1是隨機(jī)抽取的人為混雜樣品種子純度的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖1中圖A、圖B、圖C、圖D中:M:Marker ;泳道1_5為對照材料；泳道1:母本保持系榆密15B ;泳道2:父本恢復(fù)系南34 ;泳道3:母本育 性回復(fù)株榆密15A可育株；泳道4:秈稻9311 ;泳道5:滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子；泳道6-14是隨機(jī)抽取的在滇型雜交粳稻滇雜31種子中人為混雜了母本保持系榆密15B種子、父本恢復(fù)系南34種子、母本育性回復(fù)株榆密15A可育株種子和秈粳雜交種種子的人為混雜樣品種子單株。圖A是用DZ31-1作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜；圖B是用DZ31-2作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜；圖C是用DZ31-3作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜；圖D是用DZ31-4作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜。圖2是用DZ31-2作引物，區(qū)分滇型雜交粳稻滇雜31親本材料與其它粳稻材料的瓊脂糖凝膠電泳圖。MiMarker ;泳道1:粳稻材料黎榆B ;泳道2:滇型雜交粳稻滇雜31母本榆密15B，泳道3:粳稻材料合系42B ;泳道4:滇型雜交粳稻滇雜31的父本南34 ;泳道5:粳稻材料C418 ;泳道6:粳稻材料安山稻。滇型雜交粳稻滇雜31母本和父本經(jīng)DZ31-2作引物PCR擴(kuò)增后分子量為346bp，其它粳稻材料黎榆B、合系42B、C418和安山稻PCR產(chǎn)物分子量為425bp，利用父母本材料與其它粳稻材料經(jīng)PCR擴(kuò)增后分子量的差異，因此用DZ31-2作引物可以用于滇型雜交粳稻滇雜31混雜類型中其它粳稻混雜鑒定。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例采用人為混雜樣品用以證明本發(fā)明方法及其專用引物對滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子純度鑒定的準(zhǔn)確性。用大田制種的滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子為樣品，分別采用常規(guī)的田間形態(tài)鑒定方法和本發(fā)明方法鑒定種子純度，比較兩種方法鑒定結(jié)果，進(jìn)一步考察本發(fā)明方法的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確性。實(shí)施例1人為混雜樣品種子純度試驗(yàn)(I)人為混雜種子的發(fā)芽:母本保持系榆密15B(Yumil5B)種子5粒，父本恢復(fù)系南34 (N34)種子5粒，母本育性回復(fù)株榆密15A可育株種子(Yumil5A_Rf) 5粒，秈粳雜交種種子5粒，以上材料人為混入套袋雜交制種的滇型雜交粳稻滇雜31種子80粒中，共計(jì)100粒種子作為待鑒定水稻材料即人為混雜樣品，人為混雜樣品中各種材料于20-35°C發(fā)芽。(2)5個(gè)對照材料的發(fā)芽:分別取母本保持系榆密15B(Yumil5B)種子5粒為對照1，父本恢復(fù)系南34(N34)種子5粒為對照2，母本育性回復(fù)株榆密15A可育株種子(Yumil5A-Rf)5粒為對照3，秈稻9311種子5粒為對照4，套袋雜交制種的滇型雜交粳稻滇雜31種子5粒為對照5，各種對照材料于20-35°C發(fā)芽。(3)發(fā)芽后水培7 10天采用一種葉片PCR快速取樣裝置(所述的一種葉片PCR快速取樣裝置的專利號為ZL200920111961.4，
公開日:2010.06.23，
發(fā)明者李東宣, 陳麗娟, 李娟 , 文建成, 董陳文華, 朱騫, 張小玲, 呂永剛, 黃大軍, 李成云, 朱有勇 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)