專利名稱：一種酶解羊乳酪蛋白制備ace抑制肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳源ACE抑制肽制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的逐漸提高，飲食中脂肪和熱量的比重也有了顯著的提高，隨著機(jī)械化、自動(dòng)化、信息化程度的提高，導(dǎo)致了體力活動(dòng)的減少，這些都引起了我國(guó)心腦血管疾病的發(fā)病率快速上升。心血管疾病以冠心病為主，冠心病又稱冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病，而高血壓是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，且血壓水平與心血管發(fā)病危險(xiǎn)呈正相關(guān)。2010年中國(guó)高血壓防治指南指出，我國(guó)人群高血壓患病率仍呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，每10個(gè)成人中就有2人患 高血壓；估計(jì)目前全國(guó)高血壓患者至少2億。高血壓是指在未使用降壓藥物的情況下，收縮壓彡HOmmHg和(或)舒張壓≥ 90mmHg。目前，常用于抗高血壓藥物治療的有6種主要的降壓藥物，它們分別是利尿劑、α -受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑和α -腎上腺素受體阻滯劑。這些降血壓藥物雖然有顯著的降壓效果，但卻存在一定的毒副作用，如引起咳嗽、過(guò)敏性血管水腫及腎功能不全加重等。有研究報(bào)道將食物蛋白質(zhì)進(jìn)行水解后形成的小分子多肽，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)抑制肽，具有顯著的降血壓作用，將它與普通降壓藥物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)毒副作用，并且對(duì)正常的血壓無(wú)影響。ACE抑制肽一般以無(wú)活性的形式存在于蛋白質(zhì)序列中，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)通過(guò)熱、酸堿的降解、酶制劑的水解或微生物的發(fā)酵等，無(wú)活性的蛋白質(zhì)中可以釋放出具有降壓作用的ACE抑制肽。ACE的制備方法主要有5種:化學(xué)降解法、酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和基因工程法，現(xiàn)在研究最多的是酶解法和微生物發(fā)酵法。相對(duì)于微生物發(fā)酵法，酶法反應(yīng)快速，制備ACE抑制肽抑制活性高，且原料廣泛，主要有乳類蛋白、植物類蛋白及動(dòng)物類蛋白，但目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳為原料，對(duì)羊乳尚未涉及到。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，制備的ACE抑制肽能夠?qū)Ω哐獕夯颊弋a(chǎn)生顯著的降壓作用，并且對(duì)正常的血壓無(wú)影響，具有無(wú)毒副作用、安全性高、易吸收的特點(diǎn)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，步驟如下:步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在35_75°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為0-1600rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到
4.2-5.0,使酪蛋白進(jìn)行沉淀,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍12-24h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在-55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定酪蛋白最大得率及條件；步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，分別用蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6種蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)l_8h，酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1: 10，用恒溫水浴箱及Imol/lNaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試不同種類的酶較優(yōu)的水解條件及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率；步驟4:在確定酶的種類及其較優(yōu)水解條件的基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，確定出該種類酶最佳的水解溫度、PH、水解時(shí)間、酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比；步驟5:在確定最佳水解條件的基礎(chǔ)上，檢測(cè)在不同超聲功率(0、90、180、225w)條件下對(duì)水解反應(yīng)的影響。本發(fā)明采用的一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，以羊奶粉為原料，選材純天然，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，不會(huì)引起乳糖不耐癥，更易消化吸收；酪蛋白是乳中含量最豐富的蛋白質(zhì)，含有人體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的氨基酸，當(dāng)乳中酪蛋白用酶消化時(shí)，可以產(chǎn)生大量ACE抑制肽。本發(fā)明通過(guò)酶解的方法制備的ACE抑制肽產(chǎn)品，條件溫和，對(duì)酪蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值破壞小，水解過(guò)程易控制，而且酶可以對(duì)酪蛋白進(jìn)行定位水解進(jìn)而產(chǎn)生人們所需要的特定肽類；超聲波對(duì)酶解過(guò)程的處理，給蛋白酶的構(gòu)象帶來(lái)一定程度的變化，適宜的聲場(chǎng)強(qiáng)度和頻率會(huì)使蛋白酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，使其折疊得更合理，更容易與酪蛋白結(jié)合生成中間產(chǎn)物，從而提高其催化活力，制備的ACE抑制肽產(chǎn)品具有用量小、無(wú)毒副作用、性質(zhì)溫和、生理功能強(qiáng)的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例一:步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在35°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.6，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在35°C，PH為4.6，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到9.23%。實(shí)施例二:步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍20h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在45°C，PH為4.5，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%；步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，用中性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)l_8h，酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10，用恒溫水浴箱及Imol/lNaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試中性蛋白酶較優(yōu)的水解及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，測(cè)得中性蛋白酶在50°C、PH7.0的條件下，水解1.5h時(shí)，其ACE抑制率較大，為79.43%。實(shí)施例三: 步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍24h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在45°C，PH為4.5，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%；步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase進(jìn)行水解反應(yīng)l_8h,酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10,用恒溫水浴箱及Imol/INaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試Alcalase較優(yōu)的水解條件及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，測(cè)得Alcalase在55°C、PH7.5的條件下、水解2h時(shí)，其ACE抑制率較大，為83.47% ；步驟4:在確定Alcalase及其較優(yōu)水解條件的基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化:將質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用恒溫水浴箱及Imol/lNaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，水解時(shí)間l-3h，每間隔0.5h將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，確定出Alcalase最佳的水解溫度為45°C、PH為6.5、水解時(shí)間為2.5h、酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為4:100，此時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大，為84.13%。實(shí)施例四:步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍24h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在45°C，PH為4.5，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%；步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase (酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10)進(jìn)行水解l_8h，用恒溫水浴箱及Imol/INaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試Alcalase較優(yōu)的水解條件及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，測(cè)得Alcalase在55°C、PH7.5的條件下，水解2h時(shí)，其ACE抑制率較大，為83.47% ；步驟4:在確定Alcalase及其較優(yōu)水解條件的基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化:將質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用恒溫水浴箱及Imol/lNaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，水解時(shí)間l_3h，每間隔0.5h將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，確定出Alcalase最佳的水解溫度為50°C、PH為8.0、水解時(shí)間為2.5h、酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為6:100時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大，為88.32% ；步驟5:將質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用恒溫水浴箱及Imol/lNaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度為50°C和PH為8.0，加入Alcalase(酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為6:100)在90w的超聲場(chǎng)中水解2.5h時(shí)，將水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率為 89.64%。
權(quán)利要求
1.一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在35-75°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為0-1600rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.2-5.0,使酪蛋白進(jìn)行沉淀,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍12-24h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在-55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定酪蛋白最大得率及條件； 步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，分別用蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6種蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)l_8h，酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1 NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試不同種類的酶較優(yōu)的水解條件及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率； 步驟4:在確定酶的種類及其較優(yōu)水解條件的基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，確定出該種類酶最佳的水解溫度、PH、水解時(shí)間、酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比； 步驟5:在確定最佳水解條件的基礎(chǔ)上，檢測(cè)在不同超聲功率(0、90、180、225w)條件下對(duì)水解反應(yīng)的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例I: 9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在35°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.6，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在35°C，PH為4.6，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到9.23%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍20h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在45°C，PH為4.5，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%；步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，用中性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)l_8h，酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試中性蛋白酶較優(yōu)的水解及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，測(cè)得中性蛋白酶在50°C、PH7.0的條件下，水解1.5h時(shí)，其ACE抑制率較大，為79.43%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例I: 9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍24h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在45°C，PH為4.5，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%； 步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase進(jìn)行水解反應(yīng)l_8h，酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試Alcalase較優(yōu)的水解條件及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間 隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，測(cè)得Alcalase在55°C、PH7.5的條件下、水解2h時(shí)，其ACE抑制率較大，為83.47% ； 步驟4:在確定Alcalase及其較優(yōu)水解條件的基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化:將質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1 NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，水解時(shí)間l_3h，每間隔0.5h將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，確定出Alcalase最佳的水解溫度為45°C、PH為6.5、水解時(shí)間為2.5h、酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為4:100，此時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大，為84.13%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，將得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_(kāi)40°C預(yù)凍24h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定得到當(dāng)脫脂乳在45°C，PH為4.5，攪拌速度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%； 步驟3:將上述步驟所得酪蛋白凍干粉制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase進(jìn)行水解l_8h，酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為1:10，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1 NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，測(cè)試Alcalase較優(yōu)的水解條件及在該條件下達(dá)到的ACE抑制率，每間隔Ih將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，測(cè)得Alcalase在55°C、PH7.5的條件下，水解2h時(shí)，其ACE抑制率較大，為 83.47% ； 步驟4:在確定Alcalase及其較優(yōu)水解條件的基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化:將質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1 NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度和PH，水解時(shí)間l_3h，每間隔0.5h將5ml水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率，確定出Alcalase最佳的水解溫度為50°C、PH為8.0、水解時(shí)間為 2.5h、酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為6:100時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大，為88.32% ； 步驟5:將質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用恒溫水浴箱及l(fā)mol/1 NaOH溶液分別調(diào)整酪蛋白溶液的溫度為50°C和PH為8.0，加入Alcalase(酶與酪蛋白溶液的質(zhì)量比為6:100)在90w的超聲場(chǎng)中水解2.5h時(shí)，將水解液在90°C水浴中保持IOmin使酶失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制率為89.64%。
全文摘要
一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，將復(fù)原羊乳離心脫脂，得到脫脂乳，并用等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白，將酪蛋白沉淀進(jìn)行冷凍干燥，將得到的酪蛋白凍干粉進(jìn)行溶解制成酪蛋白溶液，通過(guò)加入不同種類的酶進(jìn)行水解，對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化后，用超聲波對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行處理，提高了其催化活力，使水解反應(yīng)進(jìn)行更徹底，得到的小分子ACE抑制肽能夠?qū)Ω哐獕夯颊弋a(chǎn)生顯著的降壓作用，并且對(duì)正常的血壓無(wú)影響，具有無(wú)毒副作用、安全性高、易吸收的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/06GK103215333SQ20131013235
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者陳合, 王娟, 舒國(guó)偉 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)