專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶及其表達基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β-葡萄糖苷酶及其表達基因與應(yīng)用，特別是一種β-葡萄糖苷酶及其表達基因與利用該酶生產(chǎn)寡糖的方法，屬于生物技術(shù)和生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
寡糖是一種由2-10個單糖組成的低聚糖，其有著非常廣泛的應(yīng)用價值。如目前廣泛應(yīng)用于食品、保健品、飲料、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域。美國、日本、歐洲等地均有規(guī)?；a(chǎn)，我國低聚糖的開發(fā)和應(yīng)用起于90年代中期，近幾年發(fā)展迅猛。常見的寡糖包括麥芽低聚糖葡萄糖(α — I，4糖苷鍵結(jié)合)，龍膽二糖葡萄糖(β — I，6糖苷鍵結(jié)合)，低聚糖木糖(β —1，4糖苷鍵結(jié)合)等。目前制造龍膽二糖的技術(shù)方法主要包括以下兩種:1、從天然原料中提取，但這種方法提取產(chǎn)量低，價格昂貴，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。2、酶法生產(chǎn)龍膽二糖，不過目前酶法生產(chǎn)龍膽二糖存在著酶活性效率低下，酶生產(chǎn)費用高昂等不便因素。目前酶法生產(chǎn)寡糖，是將單糖作為底物，利用糖苷酶生產(chǎn)寡糖。如中國專利文獻CN101492661A(申請?zhí)?00910029055.4)公開了一種β -葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及用于龍膽低聚糖的制備，該發(fā)明由黑曲霉WX-07總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成β-葡萄糖苷酶基因(BGL)SEQID NO:1, BGL的CDNA以質(zhì)粒PPIC9K為表達載體，以畢赤酵母(P.PAST0RIS)為表達宿主，實現(xiàn)BGL基因在胞外的可溶性表達；BGL的⑶NA全長2523個核苷酸，編碼841個氨基酸，構(gòu)建的BGL/PPIC9K轉(zhuǎn)化P.PASTORIS KM71可表達BGL酶。BGL酶具有轉(zhuǎn)糖苷活性，能將葡萄糖轉(zhuǎn)糖苷生成龍膽低聚糖。但是該文獻公開的酶生產(chǎn)寡糖所用時間過長，產(chǎn)物得率過低，無法滿足生產(chǎn)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一`種葡萄糖苷酶及其表達基因的高效生產(chǎn)與利用該酶生產(chǎn)寡糖的方法。發(fā)明概述本發(fā)明通過對里氏木霉菌株中產(chǎn)生的葡萄糖苷酶進行相關(guān)改造，發(fā)現(xiàn)其改造后的β_葡萄糖苷酶的作用產(chǎn)物的產(chǎn)量提高了 3.3倍。而且與報道的同類技術(shù)相比，產(chǎn)生相同產(chǎn)量寡糖所需的時間縮短了 4.8倍，最終產(chǎn)物得率提高了 25%。發(fā)明詳述本發(fā)明技術(shù)方案如下:一種β -葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。一種β -葡萄糖苷酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示?！N重組表達載體,是將如SEQ ID N0.1所不核苷酸序列插入表達載體獲得。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述表達載體為ΡΕΤ-32Α表達載體。一種重組細胞，是將上述重組表達載體轉(zhuǎn)化入細胞中獲得。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
一種利用β -葡萄糖苷酶生產(chǎn)寡糖的方法，步驟如下:將核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的基因片段導(dǎo)入到ρΕΤ-32Α質(zhì)粒載體中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過親和層析色譜分離純化制得β_葡萄糖苷酶，然后將β -葡萄糖苷酶加入以葡萄糖為底物的反應(yīng)液中，在溫度為30度，pH為6.0的條件下反應(yīng)，獲得寡糖。有益效果1、利用本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶生產(chǎn)寡糖，與現(xiàn)有葡萄糖苷酶相比，反應(yīng)速度明顯加快。2、本發(fā)明所述的β -葡萄糖苷酶的最佳酶活溫度更接近常溫，在實際工業(yè)化生產(chǎn)中，有利于降低生產(chǎn)耗能。3、本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶在重組菌株中表達量高，純化過程簡單，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1親和層析純化蛋白結(jié)果SDS-PAGE圖譜；其中:M、marker, 1、大腸桿菌細胞破碎液,2、鎳親和層析柱洗脫峰,3、陰離子交換層析洗脫峰，4、陰離子交換層析洗脫峰。圖2薄層層析分析寡糖產(chǎn)物成分；
具體實施例方式下面通過實施 例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的闡述，應(yīng)該說明的是，本說明的保護范圍不僅限于此。里氏木霉(trichoderma reesei)QM6a購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品保藏中心,菌種保藏號ATCC N0.13631 ；Pet-32A質(zhì)粒載體購自Novagen公司。實施例1:(I)里氏木霉QM6a總RNA的提取:里氏木霉QM6a菌株在加有2wt%微晶纖維素的MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，用濾紙過濾收集菌絲。將收集的菌絲放入預(yù)冷的研缽中研磨，其中研磨時加入一定的液氮。將研磨成的菌絲粉末移至1.5ml離心管中，并加入Iml RNAiso (購自生工生物工程有限公司B6402-1)于振蕩器中震蕩均勻，室溫放5min。然后12000rpm離心lOmin。然后將上清吸到干凈的1.5ml離心管中。然后加入160 μ I氯仿,震蕩15s混勻，室溫放置5min, 12000rpm, 4度離心5min。然后吸上清至新的1.5ml離心管。然后再加入800 μ I異丙醇，上下顛倒5次。室溫放置lOmin，12000rpm，4度離心lOmin。棄上清。加入Iml預(yù)冷的75%乙醇清洗RNA，震蕩后7500rpm離心5min。加入50 μ I DEPC處理過的水，溶解RNA。麗培養(yǎng)基組分如下:硫酸銨3g，磷酸二氫鉀4.5g，硫酸鎂0.18g，二水氯化鈣
0.24g尿素1.5g，1000X微量元素(七水硫酸鐵5g/L，一水硫酸錳1.6g/L，七水硫酸鋅
1.4g/L，氯化鈷 2g/L) 30 μ 1，用水補足至IJ 300ml。(2) β -葡萄糖苷酶編碼基因的克隆:
以里氏木霉QM6a總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA (購自takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒 BK1201):①基因組DNA的去除反應(yīng)按以下比例配制反應(yīng)液:5 XgDNA Eraser Buffer 2 μ IgDNA EraserI μ ITotal RNA0.5 μ gRNAase Free ddH20up tolO μ I將上述反應(yīng)液在42度條件下反應(yīng)2min。

②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按以下比例配制反應(yīng)液:5XPrimeScript Buffer24 μ IPrimeScript RT Enzyme Mix I I μ IRT Primer M ixI μ I步驟①配制的反應(yīng)液10 μ IRNase Free ddH20up to20 μ I將上述反應(yīng)液在37度反應(yīng)15min，接著在85度反應(yīng)5s。以F，R為上下游引物擴增出bgl基因:引物F: CCGGAATTCATGCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC ；引物R: CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC ；PCR 反應(yīng)在 50μ I 體系中進行:2XPCR Buffer25 μ l,2mM dNTPslOyl，引物Fl.5 μ 1，引物Rl.5 μ 1，模板DNAl μ 1，KOD FX聚合酶I μ 1，加雙蒸水補足到50 μ I。PCR反應(yīng)體系:在94度變性2min后開始循環(huán)，然后98度變性10s，60度退火30s，68度延伸90s，共35個循環(huán)后，再于68度延伸lOmin，擴增得到PCR片段，割膠回收，回收片段連接在PET32A質(zhì)粒載體上，連接位置在質(zhì)粒載體的多克隆位點EcoRl和HindIII之間。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10個小時后提取質(zhì)粒。(3) β-葡萄糖苷酶基因的改造將上述重組質(zhì)粒中的葡萄糖苷酶基因進行定點突變，突變位點為I177S，I174S。首先突變位點I177S。以F1，R1為反向引物進行定點突變(試劑盒來源于東洋紡公司 KOD-PLUS-Mutagenesis Kitl67300),序列如下:Fl:AGCTATGGATATGCCACCGGCAGCAACGC ；Rl:GGCCTGAATCCAGGGTTCGTTGATGGTG ；①反向PCR按以下比例配制PCR反應(yīng)液:IOXBuffer5 μ I2mM dNTPs5 μ IFl1.5μ IRl1.5μ I
重組質(zhì)粒(PET32A-BGL)I μ IKOD-PLUS-Mutagenesis Kit I μ IddH20up to50 μ IPCR反應(yīng)體系:在94度變性2min后開始循環(huán)，然后98度變性10s，65度退火30s，68度延伸7min,共5個循環(huán)。②DPN I對模板質(zhì)粒的消化在上述反應(yīng)后的反應(yīng)液中加入I μ IDPN I，在37°C條件下反應(yīng)I個小時；③PCR產(chǎn)物的自身環(huán)化 按以下比例配制反應(yīng)液Ligation high 5 μ IddH207 μ I②中的反應(yīng)液 2μ1T4KinaseI μ I將上述反應(yīng)液在16度條件下反應(yīng)I小時反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10個小時后提取質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進行序列測定。挑選出突變正確的質(zhì)粒。以上述突變位點I177S突變正確的質(zhì)粒為模板，突變I174S位點，設(shè)計反向PCR弓I物F2和R2，按上述同樣的方法挑選出突變正確的質(zhì)粒。F2:AGTCAGGCCAGCTATGGATATGCCACCGR2:CCAGGGTTCGTTGATGGTGATCCAGTTCT制得的β -葡萄糖苷酶表達基因經(jīng)華大基因生物工程公司測序驗證，核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。接著將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中。將得到的含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD6tltl為0.6時加入千分之一含量為IOOmM的IPTG，16度條件下誘導(dǎo)16個小時。然后在7000rpm條件下離心，收集菌體，用pH為6.0，50mM PBS緩沖液洗滌菌體兩遍。通過超聲破碎后，用鎳離子親和層析和陰離子交換色譜的方式純化出目的蛋白，然后分別將破碎后的液體、鎳離子親和層析后的洗脫峰溶液及陰離子交換色譜純化后的洗脫峰溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，結(jié)果如圖1所示，將其與反應(yīng)液按每Iml反應(yīng)液添加0.35mg的酶量進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為30°C,pH為6.0,反應(yīng)液成分為IOml體系中加入40%葡萄糖,500 μ I疊氮化鈉，ImL的ρΗ6.0的50mM磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液。反應(yīng)10小時后，樣品沸水浴IOmin滅酶活。然后通過HPLC和薄層層析(圖2)鑒定產(chǎn)物濃度和種類。其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。實施例2:將純化出來的β -葡萄糖苷酶和野生型β -葡萄糖苷酶分別取100 μ I加入到含5mM的p-nitrophenyl glucoside的50mM的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液中(加入10%甘油)，pH為7.4，溫度為30°C，反應(yīng)30分鐘。用10%碳酸氫鈉150 μ I終止反應(yīng)。取適量的體積在420nm光波長處測定OD值，得出其水解酶活。使用Bradford試劑盒(上海生工生物工程SK3041-1)測定其蛋白質(zhì)濃度。酶活定義如下:每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生ImM pNP為一個酶活單位(U)。結(jié)果如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種β -葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種β -葡萄糖苷酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一種重組表達載體，是將如SEQ ID N0.1所不核苷酸序列插入表達載體獲得。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達載體為ΡΕΤ-32Α表達載體。
5.一種重組細胞，是將權(quán)利要求3或4所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化入細胞中獲得。
6.如權(quán)利要求5所述的重組 細胞，其特征在于，所述細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。
7.一種利用葡萄糖苷酶生產(chǎn)寡糖的方法，其特征在于，步驟如下: 將核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的基因片段導(dǎo)入到ΡΕΤ-32Α質(zhì)粒載體中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過親和層析色譜分離純化制得β_葡萄糖苷酶，然后將β_葡萄糖苷酶加入以葡萄糖為底物的反應(yīng)液中，在溫度為30度，pH為6.0的條件下反應(yīng)，獲得寡糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-葡萄糖苷酶及其表達基因與應(yīng)用。一種β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；該β-葡萄糖苷酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用本發(fā)明所述的β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)寡糖，與現(xiàn)有β-葡萄糖苷酶相比，反應(yīng)速度明顯加快，β-葡萄糖苷酶的最佳酶活溫度更接近常溫，在實際工業(yè)化生產(chǎn)中，有利于降低生產(chǎn)耗能，并且本發(fā)明所述的β-葡萄糖苷酶在重組菌株中表達量高，純化過程簡單，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/70GK103160483SQ20131012510
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者方詡, 高天龍, 王明鈺, 劉奎美 申請人:山東大學(xué)