一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術領域】，提供了一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白的制備方法，包括步驟a.選用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL(DE3)CGMCCNo.4953做為菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，還包括步驟：b.對發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進行洗滌、破碎對破碎所得菌體物質進行硫酸銨沉淀處理；d.對硫酸銨沉淀處理所得菌體物質進行層析純化處理對層析純化所得菌體物質進行脫鹽和緩沖液更換處理。同現有技術相比較，采用本制備方法，可以實現TRAIL融合蛋白的工業(yè)化生產，為TRAIL融合蛋白的實際應用提供可能。
【專利說明】一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領域，具體涉及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白的制備 方法。

【背景技術】
[0002] 1995年，Wiley SR等報道從人表達標簽序列文庫（EST, expressed sequence tag) 中篩選到一種編碼抗腫瘤蛋白的基因，該基因編碼的蛋白稱為腫瘤壞死因子相關凋亡配體 (tumor necrosis factor-relate d apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又稱凋亡素 2 配體（Apo2L)，屬于腫瘤壞死因子超家族（Wiley SR, et al.，Immunity3:673-682, 1995)。人 TRAIL基因位于染色體3q26,全長1769bp，共編碼281個氨基酸。TRAIL蛋白是一種II型跨 膜蛋白，分子量為32. 5KDa，理論等電點為7. 63,其中C末端114-281位氨基酸構成了 TRAIL 蛋白的胞外區(qū)，發(fā)揮主要功能。
[0003] 研究表明，TRAIL對多種惡性腫瘤具有抑制細胞生長和細胞毒作用， 而人體的正常細胞則對TRAIL誘導的凋亡耐受（Ashkenazi A, et al.，J Clin InvestKM: 155-162, 1999)。鑒于TRAIL蛋白在抗腫瘤領域的潛在臨床應用價值，TRAIL作 為抗腫瘤藥物的開發(fā)受到了越來越多的關注。
[0004] TRAIL雖然在體內外實驗以及臨床實驗中均顯示了顯著的抑制腫瘤細胞生長的作 用，但是半衰期比較短，人體內半衰期僅有40分鐘，嚴重影響了 TRAIL蛋白在體內的療效。
[0005] 本發(fā)明的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白，其包含：人源亮氨酸拉鏈結 構域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。與野生型 的TRAIL相比，TRAIL融合蛋白的穩(wěn)定性顯著增加，半衰期大幅延長，治療效果顯著提高，具 有廣泛的應用前景。
[0006] 目前，TRAIL蛋白的表達主要采用酵母和大腸桿菌兩種表達系統。酵母表達系統 成本較高且容易造成TRAIL蛋白的基團修飾；大腸桿菌表達系統表達的TRAIL蛋白大多為 包涵體，可溶性蛋白產量低，并且純化過程繁瑣復雜。因此，開發(fā)適用于規(guī)?；a的TRAIL 蛋白制備工藝，對TRAIL蛋白的臨床應用意義重大。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種在大腸桿菌中表達的TRAIL融合蛋白的制備方法，此種 制備方法實現了 TRAIL融合蛋白的工業(yè)化生產，為TRAIL融合蛋白的實際應用提供可能。
[0008] 本發(fā)明提供的TRAIL融合蛋白的制備方法，其特征在于包含以下步驟的層析純化 處理：
[0009] 1)發(fā)酵上清液，上親和層析柱，收集37. 5mmol/l咪唑洗脫目的峰；
[0010] 2)上陰離子交換層析柱，收集40%鹽濃度目的峰；
[0011] 3)上疏水層析柱，收集55%鹽濃度目的峰；
[0012] 4)上疏水層析柱，收集55%鹽濃度目的峰。
[0013] 本發(fā)明所述的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白包括：人源亮氨酸拉鏈結 構域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。
[0014] TRAIL (腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體）是一種在本【技術領域】內被熟知的蛋 白。TRAIL核苷酸序列GenBank登錄號NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作為死亡受體 DR4(TRAIL-RI)和死亡受體DR5(TRAIL-RII)的配體，與其結合誘導凋亡或細胞死亡。人源 TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，其胞外區(qū)是從N端開始的第41位至第281 位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No:7所示.
[0015] 依照本發(fā)明，一種TRAIL融合蛋白從N端至C端具有如下序列：（1)人源亮氨酸拉 鏈序列；（2)根據情況可有一不多于10個氨基酸的連接區(qū)；（3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL 蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段，可以與死亡受體DR4(TRAIL-RI)或者死亡受 體 DR5 (TRAIL-RII)相結合。
[0016] 融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全長或者部分片段，長度足 以與死亡受體DR4 (TRAIL-RI)和死亡受體DR5 (TRAIL-RII)結合。優(yōu)選的是融合蛋白中的 TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外區(qū)，包含天然人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片 段。
[0017] 更加優(yōu)選的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一種TRAIL蛋白的可溶性片段，包含 TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜區(qū)以及胞內區(qū)。在一 種實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID No:2所示氨基酸 序列。
[0018] 作為優(yōu)選，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域為人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdxl 或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結構域。
[0019] 在本發(fā)明的具體實施例中，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域含有如SEQ ID No: 1 所示的氨基酸序列。
[0020] 在一種實施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序 列。
[0021] 在本發(fā)明的實施例中，具體提供一種重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分 子的大腸桿菌，所述大腸桿菌于2011年6月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4953。
[0022] 本發(fā)明的層析純化步驟1)中所述親和層析柱介質為Ni-NTA ;步驟2)中陰離子交 換柱介質為Q Sepharose Fast Flow;步驟3)中疏水層析柱介質為Butyl Sepharose4FF; 步驟4)中疏水層析柱介質為Phenyl Sepharose High Performance。
[0023] 本發(fā)明的層析純化中的發(fā)酵上清液通過以下步驟獲得：
[0024] ①選用工程菌 LZ-TRAIL95-pET25b-BL21 (DE3) CGMCC No. 4953 作為菌株進行發(fā)酵 培養(yǎng)；
[0025] ②對發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進行洗滌和破碎；
[0026] ③對破碎所得菌體物質進行硫酸銨沉淀處理。
[0027] 本發(fā)明對于工程菌發(fā)酵培養(yǎng)所得的菌體進行洗滌和破碎，具體步驟包括：在發(fā)酵 所得菌體中加入含有DTT和溶菌酶的Tris-Cl溶液；使用高速剪切機和高壓均質機破碎菌 體；經離心后分離獲得上清。DTT即DL-Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇，分子式為 C4HltlO2S2，分子量為 154. 25。
[0028] 發(fā)酵上清液經過層析純化步驟之后，還需要對層析處理所得菌體物質進行脫鹽和 緩沖液更換處理，具體步驟：
[0029] ①向層析純化后蛋白溶液中加入檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，混勻；
[0030] ②使用膜包進行流加超濾透析脫鹽并置換緩沖液。
[0031] 同現有技術相比較，采用本制備方法，可以實現TRAIL融合蛋白的工業(yè)化生產，為 TRAIL融合蛋白的實際應用提供可能。
[0032] 生物保藏說明
[0033] 菌株LZ-TRAIL95CS，分類命名：大腸埃希氏菌，Escherichia coli.于2011年6月 14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4953。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1顯示的是融合蛋白結構示意圖。
[0035] A-人源亮氨酸拉鏈結構域
[0036] B -連接區(qū)
[0037] C-TRAIL 胞外區(qū)
[0038] 圖2顯示的是LZ-TRAIL蛋白經Ni-NTA層析柱純化后的SDS-PAGE鑒定結果。
[0039] 泳道1 :蛋白電泳Marker ;
[0040] 泳道2 :Ni-NTA層析柱上樣樣品；
[0041] 泳道3 :層析流穿樣品；
[0042] 泳道4 :15%Buffer B洗脫蛋白峰El ;
[0043] 泳道5 :15%Buf f er B洗脫蛋白峰E2 ;
[0044] 泳道6 :100%Buf f er B洗脫蛋白峰E3
[0045] 箭頭所示為目標蛋白。
[0046] 圖3顯示的是LZ-TRAIL蛋白經Q S印harose Fast Flow層析柱純化后的SDS-PAGE 鑒定結果。
[0047] 泳道1 :蛋白電泳Marker ;
[0048] 泳道2 :Q Sepharose Fast Flow層析柱上樣樣品；
[0049] 泳道3 :層析流穿樣品；
[0050] 泳道4 :24%Buffer C洗脫蛋白峰El;
[0051] 泳道5 :40%Buffer C洗脫蛋白峰E2 ;
[0052] 泳道 6 :100%Buffer C 洗脫蛋白峰 E3。
[0053] 箭頭所示為目標蛋白。
[0054] 圖4顯示的是LZ-TRAIL蛋白經Butyl S印harose4FF層析柱純化后的SDS-PAGE 鑒定結果。
[0055] 泳道1 :蛋白電泳Marker ;
[0056] 泳道2 :Butyl Sepharose4FF層析柱上樣樣品；
[0057] 泳道3 :層析流穿樣品；
[0058] 泳道4 :45%Buffer A洗脫蛋白峰El ;
[0059] 泳道 5 :100%Buf f er A 洗脫蛋白峰 E2。
[0060] 箭頭所示為目標蛋白。
[0061] 圖 5 顯不的是 LZ-TRAIL 蛋白經 Phenyl Sepharose High Performance 層析柱純 化后的SDS-PAGE鑒定結果。
[0062] 泳道1 :蛋白電泳Marker ;
[0063] 泳道 2 :Phenyl Sepharose High Performance 層析柱上樣樣品；
[0064] 泳道3 :層析流穿樣品；
[0065] 泳道4 :45%Buffer A洗脫蛋白峰El ;
[0066] 泳道 5 :100%Buf f er A 洗脫蛋白峰 E2。
[0067] 箭頭所示為目標蛋白。
[0068] 圖6顯示的是LZ-TRAIL蛋白純化后的SEC-HPLC (214nm)鑒定結果。
[0069] 圖7顯示乳腺癌細胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的腫瘤生長曲線。
[0070] 圖8顯示乳腺癌細胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的體重變化曲線。
[0071] 圖9顯示的是融合蛋白和人源TRAIL蛋白給藥后小鼠體內血藥濃度變化曲線。 圖10顯示的是C18反相色譜柱檢測圖譜

【具體實施方式】
[0072] 本發(fā)明公開了一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL)融合蛋白的制備工 藝。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的產品、方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā) 明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應 用本發(fā)明技術。
[0073] 本發(fā)明的目的是提供一種TRAIL融合蛋白的制備方法。
[0074] 所述的TRAIL融合蛋白包括：人源亮氨酸拉鏈結構域；人源TRAIL蛋白、人源 TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。
[0075] TRAIL (腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體）是一種在本【技術領域】內被熟知的蛋 白。TRAIL核苷酸序列GenBank登錄號NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作為死亡受體 DR4(TRAIL-RI)和死亡受體DR5(TRAIL-RII)的配體，與其結合誘導凋亡或細胞死亡。人源 TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，其胞外區(qū)是從N端開始的第41位至第281 位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。
[0076] 所述TRAIL融合蛋白從N端至C端具有如下序列：（1)人源亮氨酸拉鏈序列； (2)根據情況可有一不多于10個氨基酸的連接區(qū)；（3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白 胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段，可以與死亡受體DR4(TRAIL-RI)或者死亡受體 DR5 (TRAIL-RII)相結合。
[0077] 融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全長或者部分片段，長度足 以與死亡受體DR4 (TRAIL-RI)和死亡受體DR5 (TRAIL-RII)結合。優(yōu)選的是融合蛋白中的 TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外區(qū)，包含天然人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分 片段。更加優(yōu)選的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一種TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL 蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜區(qū)以及胞內區(qū)。在一種實 施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID No:2所示氨基酸序列。 [0078] 作為優(yōu)選，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域為人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdxl 或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結構域。
[0079] 在本發(fā)明的一個實施例中，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域含有如SEQ ID No: 1 所示的氨基酸序列。
[0080] 在另一個實施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID No:3所示的氨基酸 序列。
[0081] 上述TRAIL融合蛋白會形成由3個分子組成的寡聚體，這種寡聚體的形成是通過 亮氨酸拉鏈結構域進行加強的。
[0082] 在一個實施方案中，所述融合蛋白的DNA分子含有SEQ ID No:4所示的核苷酸序 列。
[0083] 在本發(fā)明的實施例中，具體提供一種重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分 子的大腸桿菌，所述大腸桿菌于2011年6月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4953。
[0084] 在一實施方案中，TRAIL融合蛋白制備的具體步驟為：
[0085] 1)選用工程菌 LZ-TRAIL95-pET25b-BL (DE3) CGMCC No. 4953 做為菌株進行發(fā)酵 培養(yǎng)。
[0086] 2)將發(fā)酵菌體溶于Buffer A (20mM Tris、2mM DTT，pH8.0)中溶解，加入溶菌酶， 分別使用高速剪切機和高壓均質機破碎菌體。
[0087] 3)破碎后菌液，經離心后分離上清，并向上清中緩慢加入3mol/L硫酸銨溶液，是 硫酸銨終濃度為I. 5mol/L，沉淀目的蛋白。離心，收集沉淀，重溶于Buffer A中。
[0088] 4)將沉淀重溶的蛋白溶液上Ni-NTA親和層析柱，Buffer A平衡層析柱，Buffer B (20mM Tris、250mM Imidazole、2mM DTT、pH8. 0)梯度洗脫目的蛋白，根據洗脫峰，收集 15%Buffer B洗脫的目的蛋白。
[0089] 5)上Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,Buffer A平衡層析柱，Buffer C (20mM Tris、500mM NaCl、2mM DTT、pH8. 0)梯度洗脫目的蛋白，根據洗脫峰，收集40%Buffer B洗脫的目的蛋白。
[0090] 6)將 Buffer D (3M(NH4)2S04、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0)按體積比 1:1 的比例緩 慢加入到Q Sepharose Fast Flow洗脫液中，混合均勻。
[0091] 7)上 Butyl Sepharose4FF 疏水層析柱，Buffer E (I. 5M(NH4)2S04、20mM Tris、 2mMDTT、pH8. 0)平衡層析柱，Buffer A (20mM Tris、2mM DTT，pH8.0)梯度洗脫目的蛋白， 根據洗脫峰，收集45%Buffer A洗脫的目的蛋白。
[0092] 8)將 Buffer D (3M(NH4)2S04、20mM Tris、2mM DTT、pH8. 0)按體積比 20:9 的比例， 緩慢加入到Butyl Sepharose4FF洗脫液中，混合均勻。
[0093] 9)上 Phenyl Sepharose High Performance 疏水層析柱，Buffer E (I. 5M(NH4)2S04、20mM Tris、2mM DTT、pH8.0)平衡層析柱，Buffer A (20mM Tris、2mM DTT， pH8. 0)梯度洗脫目的蛋白，根據洗脫峰，收集45%Buffer A洗脫的目的蛋白。
[0094] 10)使用超濾器對Solution D溶液（20mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液、 0. 5%GSH、50mM NaCl，pH5. 5)進行超濾，收集于干熱處理過的容器中。
[0095] 11)向裝有待透析蛋白溶液容器中加入Solution D攪拌，以QuattroFlowl200泵， 以轉速10平衡膜包。
[0096] 12)以Watson_Marlow520S蠕動泵將Solution D泵入容器中，攪拌均勻，啟動 QuattroFlow 1200泵，保持濾出和流加速度相等，進行蛋白溶液流加透析。
[0097] 13)向蛋白溶液中補加 Tween80,緩慢攪拌，混勻。
[0098] 14)使用超濾器進行蛋白樣品濃縮。
[0099] 采用本發(fā)明方法進行制備，最終可得到純度>98%的具有活性的可溶性TRAIL融合 蛋白，該TRAIL融合蛋白可應用于制備抗腫瘤藥物。
[0100] 動物試驗顯示，人源TRAIL蛋白對照組對腫瘤的抑制率為35. 8%，而本發(fā)明所述融 合蛋白組腫瘤完全消失，且裸鼠狀態(tài)明顯好于給予人源TRAIL蛋白的陽性對照組，表明與 TRAIL相比，本發(fā)明所述融合蛋白毒性更低。另外，本發(fā)明所述融合蛋白的體內消除速度明 顯低于TRAIL蛋白，說明融合蛋白與TRAIL相比半衰期明顯延長。
[0101] 下面將結合最佳實施例的詳細描述和附圖，進一步說明本發(fā)明前述的和其他的優(yōu) 點和特點。
[0102] 實施例1 :
[0103] 發(fā)明人經過大量實驗發(fā)現，構建的融合蛋白LZ-TRAIL95治療腫瘤可達到完全消 失的效果，且裸鼠狀態(tài)明顯好于給予人源TRAIL蛋白的陽性對照組，表明與TRAIL相比， 融合蛋白LZ-TRAIL95毒性更低。另外，融合蛋白的體內半衰期為218分鐘，顯著高于人源 TRAIL蛋白。
[0104] 融合蛋白LZ-TRAIL95含有3部分：交聯區(qū)、LZ (亮氨酸拉鏈）和TRAIL胞外區(qū)。其 中交聯區(qū)含有2個半胱氨酸，在活性形式三聚體結構中，兩兩形成分子間二硫鍵，起到加固 TRAIL三聚體的作用，其序列如下：
[0105] MEEDPCACESLVKFQAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTVVGSTSEETISTVQEK QQNISPLVRE RGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSN LHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRF QEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARN SCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDM DHEASFFGAFLVG
[0106] LZ-TRAIL95蛋白遇到的最大問題是二硫鍵錯配，在非還原電泳表現為不均一條 帶。經Western blotting以及肽圖證明各條帶均為LZ-TRAIL95蛋白。添加多種藥用輔料 抗氧劑均不能解決這一問題。
[0107] 為了解決LZ-TRAIL95二硫鍵錯配的問題，將LZ片段N端兩個Cys突變?yōu)镾er，構 建LZ-TRAIL95CS蛋白的表達載體，其表達的LZ-TRAIL95CS蛋白序列如SEQ ID No. 3所示， 結果表明突變可以大大緩解LZ-TRAIL95的不均一化問題。
[0108] 完全去除DTT前后，C18反相色譜柱檢測圖譜如圖10所示，純度90%。與 LZ-TRAIL95相比，蛋白均一程度明顯改善。分子篩鑒定表明，LZ-TRAIL95CS蛋白在分子篩 中的保留時間要比BSA單體（68KD)保留時間短，見表1，說明LZ-TRAIL95CS的分子量大于 68KD，是以活性形式三聚體存在。
[0109] 表I :LZ-TRAIL95CS與BSA在SEC-HPLC保留時間對比結果
[0110]
[0111] 實施例2.構建融合蛋白表達載體

【權利要求】
1. 一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白的制備方法，其特征在于包含以下步 驟的層析純化處理： 1) 發(fā)酵上清液，上親和層析柱，收集37. 5mm〇l/l咪唑洗脫目的峰； 2) 上陰離子交換層析柱，收集40%鹽濃度目的峰； 3) 上疏水層析柱，收集55%鹽濃度目的峰； 4) 上疏水層析柱，收集55%鹽濃度目的峰。
2. 根據權利要求1的制備方法，所述腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白包括： 人源亮氨酸拉鏈結構域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū) 的片段。
3. 根據權利要求1的制備方法，步驟1)中所述親和層析柱介質為Ni-NTA ;步驟2) 中陰離子交換柱介質為Q Sepharose Fast Flow;步驟3)中疏水層析柱介質為Butyl Sepharose4FF;步驟 4)中疏水層析柱介質為 Phenyl Sepharose High Performance。
4. 根據權利要求1的制備方法，步驟1)中所述發(fā)酵上清液通過如下步驟獲得： ① 選用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL21(DE3)CGMCC No. 4953作為菌株進行發(fā)酵培 養(yǎng)； ② 對發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進行洗滌和破碎； ③ 對破碎所得菌體物質進行硫酸銨沉淀處理。
5. 根據權利要求4的制備方法，步驟②包含以下子步驟：在發(fā)酵所得菌體中加入含有 DTT和溶菌酶的Tris-Cl溶液；使用高速剪切機和高壓均質機破碎菌體；經離心后分離獲得 上清。
6. 根據權利要求1-5的制備方法，其特征在于還需要對層析處理所得菌體物質進行脫 鹽和緩沖液更換處理，具體步驟： ① 向層析純化后蛋白溶液中加入檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，混勻； ② 使用膜包進行流加超濾透析脫鹽并置換緩沖液。
【文檔編號】C12P21/02GK104211808SQ201310089727
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月5日 優(yōu)先權日:2013年6月5日
【發(fā)明者】蘇云鵬, 劉曉斌, 周宇, 王猛, 鄧嘉修 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司, 江蘇先聲藥業(yè)有限公司, 山東先聲麥得津生物制藥有限公司