專利名稱：魚成分檢測實時pcr檢測引物、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及食品中魚成分檢測實時PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
水產(chǎn)品是世界經(jīng)濟貿(mào)易的重要組成部分，也是重要的食品蛋白質(zhì)來源。可食用水產(chǎn)品種類繁多，國際貿(mào)易的主要品種有25大種群，僅美國食品藥品管理局列出的可食水產(chǎn)品名單上就有約1700多種。隨著水產(chǎn)品國際貿(mào)易的發(fā)展和加工水平的提高，特定種類產(chǎn)品供需關(guān)系的變化，部分商家用低值水產(chǎn)品假冒高值水產(chǎn)品進行銷售，獲得不當?shù)慕?jīng)濟利益，如將養(yǎng)殖的鱒魚假冒大西洋鮭，將羅非魚、錤鰍魚假冒紅鯛等。也曾有將河豚魚片混入安康魚片導致食用者中毒死亡的案例。由美國National Seafood Inspection Laboratory開展的一項為期9年的調(diào)查結(jié)果顯示:有37%的魚類產(chǎn)品和13%的其它海洋食品的物種沒有正確標識。最近歐洲和北美進行的市場調(diào)查表明，水產(chǎn)品原料錯誤標識率在15-43%，紅鯛產(chǎn)品的錯誤標識率竟高達75%。除了經(jīng)濟損失之外，該行為還對保護頻臨滅絕物種、食品安全、經(jīng)濟秩序帶來嚴重危 害。水產(chǎn)加工品的物種真?zhèn)舞b定目前已經(jīng)成為水產(chǎn)加工業(yè)中面臨的重要問題。歐盟已經(jīng)建立了標簽法，強制生產(chǎn)商提供水產(chǎn)品物種證明、產(chǎn)地和生產(chǎn)方法等信息；美國按照食品藥品化妝品聯(lián)邦法案的規(guī)定，禁止水產(chǎn)品的假冒行為；加拿大食品檢驗局及進口商于2011年12月起嘗試對部分進口海產(chǎn)品進行DNA檢驗。這種檢測主要針對以低值魚冒充高值魚的經(jīng)濟欺詐情況。為了防止經(jīng)濟欺詐行為的發(fā)生，確保食品安全，有必要針對水產(chǎn)加工品的原料真?zhèn)芜M行鑒定。當水產(chǎn)品未經(jīng)加工處理、外觀完整時，通?？梢酝ㄟ^形態(tài)學特征判斷品種的真?zhèn)巍τ谒a(chǎn)加工品如魚糜、烤魚片、生魚片、罐頭、魚粉等，則需要建立基于DNA分析的鑒定方法。河豚魚和安康魚加工成魚片或魚泥之后，很難從形態(tài)上加以區(qū)別。為了確保食用安全性，防止食用河豚魚中毒，有必要選擇合適的基因片段，建立實用、可行的鑒定實時PCR方法。目前我國在食品中魚成分檢測方法仍是個空白，在保證方法穩(wěn)定性、特異性等方面存在很多困難，這也是制約方法建立的瓶頸。鑒于水產(chǎn)品原料真?zhèn)舞b定在維護貿(mào)易公平、保障食品安全、保護瀕危物種等方面的重要性，很多研究人員均對該領(lǐng)域展開了深入研究，建立了一系列的方法并加以應(yīng)用。EspineiraM等采用PCR測序的FINS方法鑒定鯛、羅非魚、鯖魚、鮫錬魚、比目魚、鮭魚。DNA條形碼計劃是FINS技術(shù)中的重要組成部分，該計劃是利用一段被稱作DNA條形碼的序列(C0I)通過PCR測序和分析將物種鑒定標準化的一項全球性項目。到目前為止，已有93%的淡水魚物種和98%的海洋魚物種可以通過該方法準確鑒別。Rasmussen R S，Rea S和HsiehC H分別利用PCR-RFLP進行魚醬、河豚魚肉、鮭魚與鱒魚等海洋食品的鑒定。Rehbein H等利用PCR-SSCP法進行鮭魚、沙丁魚、鰻魚、金槍魚、鰹魚、鱘魚等多種魚的鑒定。LowensteinJ H等采用RAro方法用于鯰魚等遺傳分析與鑒定。最近有報道針對DNA條形碼，利用物種特異性多重PCR成功鑒定鯊魚、比目魚、鰹魚、鯖魚、鮭魚和鱒魚。Taylor等根據(jù)ATPase6和ATPase8基因建立了多重Real-time PCR方法，用來鑒定三種具有重要商業(yè)價值的鱈魚。此夕卜，Rasmussen、Itoi S和Lopez I分別采用TaqMan MGB探針用于鰻魚、金槍魚、鮭魚和鱒魚的鑒定，Bayha K Mort等采用TaqMan LNA探針用于真鯛和美國紅魚的鑒定。2004年，法國率先開發(fā)出用于食品與動物飼料檢測的DNA芯片F(xiàn)oodExpert-1D系統(tǒng)，可同時分析超過數(shù)十種新鮮的或加工過的脊椎動物，包括15種魚類。Chisholm J等將FoodExpert-1D系統(tǒng)與Real-time PCR進行了比較,表明具有很好的適用性。Kochzius等針對歐盟重要的11種進口魚類建立了一種DNA芯片。每種方法都有各自的優(yōu)勢和不足。PCR測序法在速度與成本這兩方面沒有優(yōu)勢。PCR-RFLP方法的分析步驟比較多，相當費時。SSCP的高靈敏度要求很高程度的可重復性，每一次的實驗條件要沒有差別。PCR-RAPD的主要缺點在于該方法的可重復性，尤其是目標DNA的量少或輕微降解時，這個缺點尤其突出。AFLP方法相對費時，沒有大規(guī)模應(yīng)用。DNA芯片與其它方法相比，樣本分析相對較慢并且成本過高。Real-time PCR方法具有成本低、操作簡便的特點，特別適用于對混合樣品的鑒定，應(yīng)用最為廣泛。但是該方法只能用一對特異性的引物分析一個物種，在通用性上受到很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述實際問題，本發(fā)明建立了一種魚成分檢測實時PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。提取樣品DNA，以DNA為模板，分別采用特異性檢測引物和探針進行實時熒光PCR擴增，直接讀取實時熒光PCR的增幅現(xiàn)象，能夠?qū)κ称分械聂~成分進行鑒定。本發(fā)明 的一方面在于:公開一種魚成分檢測用引物與探針，其包括堿基序列SEQID N0.f 3。本發(fā)明建立對魚物種的真?zhèn)舞b別，本發(fā)明在使用了歐洲分子生物學實驗室的數(shù)據(jù)庫(gene databanks, EMBL)和BOL、FishTrace參考序列數(shù)據(jù)庫，比較了其中足夠多的魚的種間數(shù)據(jù)。在一些侯選基因片段中，選擇了魚物種12s基因片段進行設(shè)計引物和探針，采用DNAMAN8.0軟件，據(jù)此設(shè)計了本發(fā)明用于檢測的魚成分的檢測引物和探針，序列信息見表I。在引物的設(shè)計上對引物和探針的退火溫度的一致性，GC含量的相似性等因素進行了充分的考慮，引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。表I魚特異性檢測弓I物和探針序列
權(quán)利要求
1.一種食品中魚成分檢測用引物與探針，其特征在于，包括以下堿基序列: 上游引物:SEQ ID N0.1 下游引物:SEQ ID N0.2 探針:SEQ ID N0.3。
2.一種食品中魚成分實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1所述魚成分檢測用引物與探針。
3.一種食品中魚成分的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于:利用權(quán)利要求1所述的引物與探針，對樣品DNA進行實時熒光PCR方法檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食品中魚成分的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于:所述的對樣品DNA進行實時熒光PCR方法檢測為: ①實時熒光PCR反應(yīng)體系: 反應(yīng)體系總體積為25ii L，其中:
全文摘要
本發(fā)明公開了食品中魚成分的實時熒光PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。該方法針對魚的特異性基因序列，設(shè)計了魚基因的檢測用引物和探針SEQ ID NO.1~3，采用實時熒光PCR法對食品中魚成分的定性檢測。本發(fā)明所研制的食品中魚成分的實時熒光PCR法定性檢測方法、對提高食品中魚成分成份的檢測效率及靈敏度，降低檢測成本，檢測市場上相關(guān)假冒產(chǎn)品，進行食品安全監(jiān)測和提高檢驗技術(shù)具有重要意義，具有廣闊發(fā)展前景。
文檔編號C12N15/11GK103103281SQ20131004192
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者曹際娟, 李晶泉, 徐君怡, 徐楊 申請人:曹際娟, 李晶泉, 徐君怡, 徐楊