組合物及其制造方法
【專利摘要】提供新穎的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的組合物、及蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法。組合物：其包含：含有最頻粒徑是500nm以下的超微細(xì)氣泡的水和蛋白質(zhì)；及蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其包括將含有最頻粒徑是500nm以下的超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合。
【專利說(shuō)明】組合物及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組合物，其包含:含有最頻粒徑是500nm以下的超微細(xì)氣泡(納米氣泡、也稱為NB)的水和蛋白質(zhì)，及蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其包括混合含有最頻粒徑是500nm以下的超微細(xì)氣泡的水和蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]酶、抗體、肽等的蛋白質(zhì)在洗滌劑、工業(yè)、化妝品、食品加工、藥品、診斷一檢查、生物傳感器中被廣泛利用。由于與粉末相比，蛋白質(zhì)的水溶性制劑/形態(tài)操作性優(yōu)良等而廣被大量地利用酶的業(yè)界使用。但是，一般而言，與粉體相比，水溶液中的酶存在明顯不穩(wěn)定而保存性差，無(wú)法長(zhǎng)期間維持生理活性的問(wèn)題。以往的不使蛋白質(zhì)的生理活性降低而提供蛋白質(zhì)的方法，已知有利用冷凍干燥法等不經(jīng)熱純化蛋白質(zhì)提供穩(wěn)定化的制劑的方法。另外，已知使蛋白質(zhì)在水溶液中穩(wěn)定化的方法有:使之含有甘油等的多元醇作為尿酸酶、過(guò)氧化酶的穩(wěn)定劑的方法(專利文獻(xiàn)1:特開(kāi)平6-70798)、向含膽留醇氧化酶的水溶液添加牛血清白蛋白或葡萄糖等的糖類或賴氨酸等的氨基酸的技術(shù)(專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)平8-187095)、不限定蛋白質(zhì)而向水溶液中添加胍鹽酸鹽、尿素、吡啶等的有機(jī)化合物作為穩(wěn)定劑的技術(shù)(專利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2011-67202)等。
[0003]但是，這些的公知技術(shù)存在下述幾個(gè)問(wèn)題。例如，因?yàn)槔鋬龈稍锓ǖ拿撍冃缘牡鞍踪|(zhì)無(wú)法使用，和干燥步驟中因?yàn)榘l(fā)生吸濕或氧化導(dǎo)致變質(zhì)等問(wèn)題，此外，由于有必要重新調(diào)節(jié)酶的水溶液而導(dǎo)致煩瑣。使蛋白質(zhì)在水溶液中穩(wěn)定的技術(shù)有:為了使尿酸酶、過(guò)氧化酶穩(wěn)定而使用多元醇的方法、和為了使膽留醇氧化酶水溶液穩(wěn)定而使用牛血清白蛋白或糖類或氨基酸的方法，任何一個(gè)方法都是穩(wěn)定特定的蛋白質(zhì)的方法，其存在缺乏廣泛使用性的問(wèn)題。另外，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)水溶液而使用胍鹽酸鹽等有機(jī)化合物的方法雖有廣泛使用性，但當(dāng)該酶與其他物質(zhì)制成混合制·劑時(shí)，有一旦含與有機(jī)化合物反應(yīng)的物質(zhì)就不能使用的問(wèn)題，另外，由于添加濃度也不得不調(diào)節(jié)為適當(dāng)?shù)臐舛榷鴮?dǎo)致煩瑣。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)1:特開(kāi)平6-70798
[0007]專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)平8-187095
[0008]專利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2011-67202

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0010]本發(fā)明以提供無(wú)上述的問(wèn)題的、新穎的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的組合物、及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化方法作為目的。
[0011]解決問(wèn)題的技術(shù)方案
[0012]為解決上述問(wèn)題，反復(fù)銳意研究的結(jié)果，通過(guò)混合含有超微細(xì)氣泡的水和蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)得到穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，從而完成本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明提供組合物，其包含:含有最頻粒徑是500nm以下的超微細(xì)氣泡的水和蛋白質(zhì)。另外本發(fā)明提供包含上述的含有超微細(xì)氣泡的水和蛋白質(zhì)的上述的組合物，其中超微細(xì)氣泡的最頻粒子濃度是100萬(wàn)個(gè)/ml以上。還有，本發(fā)明提供包含含有超微細(xì)氣泡的水和蛋白質(zhì)的上述的組合物，其中粒徑1000nm以下的氣泡的粒子濃度是5000萬(wàn)個(gè)/ml以上。
[0014]此外，本發(fā)明提供了包括將含有最頻粒徑500nm以下的超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合步驟的蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法。另外本發(fā)明提供了包括將最頻粒徑是500nm以下的、超微細(xì)氣泡的最頻粒子濃度是100萬(wàn)個(gè)/ml以上的含有超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合的步驟的蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法。還有，本發(fā)明提供包括將最頻粒徑是500nm以下的、粒徑1000nm以下的氣泡的粒子濃度是5000萬(wàn)個(gè)/ml以上，任意地超微細(xì)氣泡的最頻粒子濃度可為100萬(wàn)個(gè)/ml以上的含有超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合步驟的蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法。
[0015]在本發(fā)明中，上述超微細(xì)氣泡內(nèi)部雖不限于這些，但可為選自空氣、氧、氫、氮、二氧化碳?xì)怏w、氬、氖、氙、氟化氣體及惰性氣體的I種或2種以上的氣體。
[0016]作為可在本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物中使用的蛋白質(zhì)，雖不特別限定，但可舉出酶、動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)、魚(yú)來(lái)源蛋白質(zhì)、植物來(lái)源蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)、酶、抗體、肽等，如可使用例如以下的蛋白質(zhì):
[0017]酶類:作為酶類，可使用氧化還原酶(膽留醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化·物酶等)；轉(zhuǎn)移酶(酰基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶等)；水解酶(蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、等)；添加脫離酶(果膠裂合酶等)；異構(gòu)化酶(葡萄糖異構(gòu)酶等)；合成酶(脂肪酸合酶、磷酸合酶、檸檬酸合酶、透明質(zhì)酸裂合酶、碳酸脫水酶等)。
[0018]重組蛋白質(zhì):作為重組蛋白質(zhì)，可使用蛋白制劑(干擾素α、生長(zhǎng)激素、胰島素、血清白蛋白)、疫苗等。
[0019]抗體:作為抗體，可使用單克隆抗體及多克隆抗體。
[0020]肽:作為肽，不特別限定氨基酸，可使用二肽、三肽、多肽等。
[0021]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)可為水溶性蛋白質(zhì)，更優(yōu)選為，蛋白質(zhì)可為酶，再優(yōu)選為，蛋白質(zhì)可為水溶性的酶，最優(yōu)選為，選自過(guò)氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、及脂肪酶中的至少I種。
[0022]所使用的蛋白質(zhì)的量隨蛋白質(zhì)的種類、用途等而變化。優(yōu)選的量可通過(guò)實(shí)驗(yàn)適宜確定，一般而言可使用lng/ml~300mg/ml、優(yōu)選為10ng/ml~100mg/ml、再優(yōu)選為30ng/ml~50mg/ml的范圍。
[0023]本發(fā)明中使用的水不限于這些，但可選自:自來(lái)水、純化水、離子交換水、純水、超純水、去離子水、蒸餾水、緩沖液、清潔水、天然水、過(guò)濾水、高純水、飲用水及電解水。
[0024]另外，也可加水溶性溶劑、例如醇、二醇、甘油、醚、酮、酯等。
[0025]發(fā)明效果
[0026]包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的組合物的穩(wěn)定性優(yōu)良，特別是具有對(duì)pH的變化穩(wěn)定的pH穩(wěn)定性、降低溫度影響的溫度穩(wěn)定性、及降低光影響的光穩(wěn)定性優(yōu)良的效果?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1:是顯示含有超微細(xì)氣泡的水中的氣泡的粒徑分布的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0028]圖2:是顯示日本藥局方純化水中的氣泡的粒徑分布的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0029]圖3:是顯示過(guò)氧化氫酶穩(wěn)定性測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0030]圖4:是顯示脂肪酶穩(wěn)定性測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0031]實(shí)施方式
[0032]本發(fā)明中使用的超微細(xì)氣泡的最頻粒徑是500nm以下，優(yōu)選為，最頻粒徑是300nm以下，再優(yōu)選為最頻粒徑是150nm以下，最優(yōu)選為最頻粒徑是IOOnm以下，最頻粒徑的氣泡的粒子濃度優(yōu)選為100萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為300萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為500萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為700萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為1000萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為5000萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為9000萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為I億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為5億個(gè)/ml以上、最優(yōu)選是9億個(gè)/ml以上。
[0033]在本發(fā)明中，總粒子濃度優(yōu)選為5000萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為7000萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為8000萬(wàn)個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為I億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為6億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為10億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為30億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為50億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為70億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為100億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為200億個(gè)/ml以上、再優(yōu)選為500億個(gè)/ml以上、最優(yōu)選可為700億個(gè)/ml以上。在再優(yōu)選的實(shí)施方式中，幾乎不存在1000nm以上的氣泡。
`[0034]本發(fā)明中使用的超微細(xì)氣泡的粒徑由于非常小，無(wú)法用通常的粒度分布測(cè)定裝置正確地測(cè)定。因此，本說(shuō)明書(shū)中利用由納米粒子解析系統(tǒng)NanoSight系列(NanoSight公司制)測(cè)定的數(shù)值。納米粒子解析系統(tǒng)NanoSight系列(NanoSight公司制)測(cè)量納米粒子的布朗運(yùn)動(dòng)的速度，從其速度算出粒徑。最頻粒徑可由存在的粒子的粒徑分布確認(rèn)，是指?jìng)€(gè)數(shù)變成極大值之時(shí)的粒徑。
[0035]再有，本發(fā)明中的超微細(xì)氣泡的粒徑及個(gè)數(shù)是指在組合物配合后24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的數(shù)值。
[0036]再有，本申請(qǐng)發(fā)明的組合物不限于這些，還可含防腐劑及穩(wěn)定劑等添加劑。作為防腐劑，雖不限于這些，但可使用例如聚六亞甲基雙胍及對(duì)羥基苯甲酸酯等。另外作為穩(wěn)定齊?，雖不限于這些，但可使用例如糖類、抗生素物質(zhì)、氨基糖苷、有機(jī)酸、輔酶、及氨基酸等。另外，本申請(qǐng)發(fā)明的組合物可含表面活性劑。表面活性劑不僅包括含水不溶性物質(zhì)或水難溶性物質(zhì)的添加劑的情況，在使用水溶性的添加物時(shí)，也可根據(jù)使用條件等適宜添加。
[0037]超微細(xì)氣泡表面的ζ電位影響氣泡的穩(wěn)定性。本發(fā)明中使用的超微細(xì)氣泡表面帶電，其?電位的絕對(duì)值為5mV以上、優(yōu)選為7mV以上、更優(yōu)選為IOmV以上、再優(yōu)選為20mV以上、再優(yōu)選為25mV以上、最優(yōu)選是30mV以上。另外，ζ電位的絕對(duì)值由于與溶液的粘度系數(shù)/溶液的介電常數(shù)成比例，因此認(rèn)為越在低溫條件下將含有超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合，穩(wěn)定性越高。
[0038]本發(fā)明中使用的超微細(xì)氣泡可由任意的公知的手段、例如靜態(tài)混合器式、文丘里式、空化式、蒸氣凝集式、超聲波方式、旋渦流方式、加壓溶解方式、微細(xì)孔方式發(fā)生。優(yōu)選的氣泡的發(fā)生方法是氣液混合剪切方式。[0039]作為對(duì)于由氣液混合剪切方式發(fā)生超微細(xì)氣泡的有用的裝置，可舉出例如專利第4118939號(hào)中公開(kāi)的裝置。在此裝置中，導(dǎo)入到流體旋渦室內(nèi)的氣液混合流體的多數(shù)與如在前述的以往裝置中單純地流向吐出口不同，而是先向與吐出口的方向反對(duì)方向作為旋渦流前進(jìn)。然后，該旋渦流由第I端壁部件反轉(zhuǎn)，從該第I端壁部件向第2端壁部件前進(jìn)，但此時(shí)的旋渦旋轉(zhuǎn)半徑相比向第I端壁部件之時(shí)變小，所以其流速變快，從而，向該液體內(nèi)含的氣體的剪切力變大，促進(jìn)其微細(xì)化。
[0040]通過(guò)將蛋白質(zhì)的水溶液由超微細(xì)氣泡發(fā)生裝置處理，在水溶液中發(fā)生超微細(xì)氣泡，可制造蛋白質(zhì)溶解在水中的本發(fā)明的組合物。另外，通過(guò)向含有超微細(xì)氣泡的水溶解蛋白質(zhì)也可制造本發(fā)明的組合物。上述的含有超微細(xì)氣泡的水可具有如前述的最頻粒徑及個(gè)數(shù)。
[0041]本說(shuō)明書(shū)中的本發(fā)明的說(shuō)明及實(shí)施例的記述僅用于本發(fā)明的各種各樣的例示的實(shí)施方式的詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可對(duì)本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的實(shí)施方式進(jìn)行各種各樣的改良及變更。從而，本說(shuō)明書(shū)的記載不以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由專利權(quán)利要求的記載確定。
實(shí)施例
[0042]實(shí)施例1
[0043]含有大氣的超微細(xì)氣泡的水的調(diào)節(jié)
[0044]由作為由氣液混合剪切方式的超微細(xì)氣泡發(fā)生裝置的株式會(huì)社協(xié)和機(jī)械設(shè)備制造的“BUVITAS”，使用日本藥局方純化水，產(chǎn)生超微細(xì)氣泡。將生成的超微細(xì)氣泡的粒徑由納米粒子解析系統(tǒng)NanoSight系列(NanoSight公司制)測(cè)定。測(cè)定結(jié)果示于圖1。圖的橫軸示nm單位的粒徑,縱軸示每1ml的NB粒子數(shù)(納米氣泡粒子數(shù))(IO6個(gè)/ml)。另外，圖2示對(duì)日本藥局方純化水的微細(xì)氣泡的測(cè)定結(jié)果。
[0045]生成的含有超微細(xì)氣泡的水的最頻粒徑是86nm、在最頻粒徑的粒子濃度是
7.57 X IO6個(gè)/ml、總粒子濃度是6.86 X IO8個(gè)/ml。
[0046]對(duì)于日本藥局方純化水而言，粒子濃度非常地少，未見(jiàn)到正態(tài)分布，由此判斷測(cè)定
結(jié)果是噪聲。
[0047]在以下的實(shí)施例中，含有大氣的超微細(xì)氣泡的水與上述同樣地調(diào)節(jié)，作為空白的比較例，代替含有大氣的超微細(xì)氣泡的水，采用了使用日本藥局方純化水的水。
[0048]1.過(guò)氧化物酶在20°C、50°C的10天的穩(wěn)定性
[0049]向含有大氣的超微細(xì)氣泡的水加鏈霉親和素過(guò)氧化物酶至成50ng/ml,向管中各分別注入1.0ml，在20、50°C的條件下密閉保存1、3和10天。接下來(lái)，向保存的鏈霉親和素過(guò)氧化物酶水溶液100 μ I加loo μ I如下調(diào)節(jié)的底物液而顯色。
[0050]底物液的調(diào)節(jié)方法
[0051]將由下述成分組成的試劑混合而得到底物液。
[0052]ο-苯二胺片(SIGMA-ALDRICH 公司制):I 個(gè)
[0053]70mM檸檬酸緩沖液(檸檬酸-磷酸鈉；pH5.0):12.5ml
[0054]過(guò)氧化氫液:5 μ I
[0055](酶濃度及酶活性殘留率的算出方法)[0056]向樣品加50μ 14NH2S04溶液，停止顯色反應(yīng)之后，用酶標(biāo)儀(ThermoFisherScientific株式會(huì)社制)測(cè)定在492nm處的吸光度(A492)。酶濃度由使用鏈霉親和素過(guò)氧化物酶制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出。另外，以樣品的初期酶活性作為A、以保存后的酶活性作為B，由下式算出“酶活性殘留率”。
[0057]酶活性殘留率(％)=(1- (A-B)/A) XlOO
[0058]再有,在最頻粒徑的濃度計(jì)算為在最頻粒徑的濃度測(cè)定值(IO6個(gè)/ml) X測(cè)定時(shí)的稀釋倍率。另外，總粒子濃度計(jì)算為在總粒子濃度的濃度測(cè)定值(IO8個(gè)/ml) X測(cè)定時(shí)的稀釋倍率。
[0059]結(jié)果示于下述的表1和表2。
[0060]表1
[0061]
【權(quán)利要求】
1.組合物，其包含蛋白質(zhì)和含有最頻粒徑在500nm以下的超微細(xì)氣泡的水。
2.權(quán)利要求1所述的包含蛋白質(zhì)和含有超微細(xì)氣泡的水的組合物，其中超微細(xì)氣泡的最頻粒子濃度是100萬(wàn)個(gè)/ml以上。
3.權(quán)利要求1~2中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)和含有超微細(xì)氣泡的水的組合物，其中粒徑1000nm以下的氣泡的粒子濃度是5000萬(wàn)個(gè)/ml以上。
4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中上述超微細(xì)氣泡由選自空氣、氧、氫、氮、二氧化碳?xì)怏w、氬、氖、氙、氟化氣體及惰性氣體的I種或2種以上的氣體形成。
5.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中上述蛋白質(zhì)是酶。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中上述酶是過(guò)氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、或者脂肪酶。
7.蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其包括將含有最頻粒徑是500nm以下的超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合。
8.蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其包括將含有最頻粒徑是500nm以下，最頻粒子濃度是100萬(wàn)個(gè)/ml以上的超微細(xì)氣泡的水與蛋白質(zhì)混合。
9.蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其是權(quán)利要求7或8所述的蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其中含有超微細(xì)氣泡的水的粒徑1000nm以下的氣泡的粒子濃度是5000萬(wàn)個(gè)/ml以上。
10.權(quán)利要求7~9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其中上述超微細(xì)氣泡內(nèi)包選自空氣、氧、氫、氮、二氧化碳?xì)怏w、氬、氖、氙、氟化氣體及惰性氣體的I種或2種以上的氣體。
11.權(quán)利要求7~10中任一項(xiàng)所述的蛋`白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其中上述蛋白質(zhì)是酶。
12.權(quán)利要求11所述的蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定化方法，其中上述酶是過(guò)氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、或者脂肪酶。
【文檔編號(hào)】C12N9/14GK103857792SQ201280049370
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】宮尾悠, 安島讓, 岡徹, 廖能忠 申請(qǐng)人:新時(shí)代技研株式會(huì)社, 盛勢(shì)達(dá)新加坡有限公司