降低糖化過程的粘度的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可用于水解生物質(zhì)的組合物諸如包含具有糖基水解酶家族61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的組合物，水解生物質(zhì)材料的方法，以及使用包含具有糖基水解酶家族61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的組合物降低生物質(zhì)混合物粘度的方法。
【專利說明】降低糖化過程的粘度的方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求2011年3月17日提交的美國臨時申請N0.61/453，923的權(quán)益，該申請據(jù)此全文以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及用于水解生物質(zhì)的組合物，使用此類組合物水解生物質(zhì)材料的方法，以及降低生物質(zhì)糖化混合物的粘度的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]自從二十世紀七十年代出現(xiàn)石油危機以來，可再生木質(zhì)纖維素生物質(zhì)到可發(fā)酵糖的生物轉(zhuǎn)化已引起研究者的廣泛關(guān)注，所述可發(fā)酵糖隨后發(fā)酵產(chǎn)生作為液體燃料替代品的醇(如乙醇)(Bungay, H.R.，“Energy: the biomass options”.NY:Wiley,1981;Olsson L, Hahn-Hagerdal B.Enzyme Microb Technoll996, 18:312-31;Zaldivar,J et al., Appl Microbiol Biotechnol2001, 56:17-34;Galbe, M et al., Appl MicrobiolBiotechnol2002, 59:618-28) (Bungay, H.R.，“能源:生物質(zhì)選擇”。NY:ffiley ；1981 ；01ssonL、Hahn-Hagerdal B.,《酶與微生物技術(shù)》1996年,第18期,第312-31頁；Zaldivar, J等人，《應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)》2001年，第56期，第17-34頁；Galbe，M等人，《應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)》2002年，第59期，第618-28頁))。對通過木質(zhì)纖維素生物質(zhì)材料制備糖類，以及糖類的后續(xù)發(fā)酵和蒸餾為乙醇的了解已有時日。許多現(xiàn)有開發(fā)出現(xiàn)于第二次世界大戰(zhàn)期間，當(dāng)時在諸如德國、日本和前蘇聯(lián)等國燃料非常稀有。這些早期過程主要涉及酸水解，這在工程與設(shè)計上較為復(fù)雜，并且通常對過程中的細小變化敏感，例如對溫度、壓力和/或酸濃度的變化敏感。這些早期過程的綜合討論見于“Production of Sugars from WoodUsing High-pressure H ydrogen Chloride，，, Biotechnology and Bioengineering, VolumeXXV, at2757-2773(1983)(“使用高壓氯化氫通過木材制備糖類”，《生物技術(shù)與生物工程》，第 XXV 卷，第 2757-2773 頁(1983))。
[0006]從第二次世界大戰(zhàn)至二十世紀七十年代初期，充足的石油供應(yīng)減緩了乙醇轉(zhuǎn)化研究。然而，由于1973年的石油危機，研究者加倍努力地開發(fā)利用木材和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品制備乙醇的方法。該研究對于乙醇的開發(fā)尤為重要，所述乙醇作為汽油添加劑用于降低美國對外國石油生產(chǎn)的依賴，增加燃料的辛烷值，以及作為環(huán)境措施減少排氣污染物。
[0007]在“石油危機”發(fā)生時，美國環(huán)境保護署頒布了要求減少鉛添加劑的法規(guī)。鑒于乙醇實際上已作為鉛的替代品，一些煉油廠已選擇乙醇作為替代品，因為乙醇具備易于引入精煉廠操作的能力，而無需昂貴的固定設(shè)備投入。
[0008]數(shù)十年前開發(fā)的高壓和高溫氣體糖化過程仍待改善。最新研究集中關(guān)注酶轉(zhuǎn)化過程，該過程利用來自多種生物體諸如嗜中溫和嗜熱真菌、酵母和細菌的酶，將纖維素降解為可發(fā)酵糖。這些過程仍然存在不確定性，主要在于能否形成商業(yè)規(guī)模以及提高乙醇生產(chǎn)的效率。
[0009]纖維素和半纖維素是通過光合作用產(chǎn)生的最豐富的植物材料。它們可被多種產(chǎn)生能夠?qū)⒕酆衔锏孜锼獬蓡误w糖類的酶的微生物(包括細菌、酵母和真菌)降解用作能源(Aro等人，2001)。生物體通常對于其利用的糖類具有限制性，并且這決定了轉(zhuǎn)化過程中何種糖產(chǎn)出最佳。由于我們已接近不可再生資源的限值，我們認識到纖維素成為主要可再生資源的巨大潛能(Krishna等人，2001)。通過生物過程有效利用纖維素可潛在地克服食品、飼料和燃料短缺(Ohmiya等人，1997)。
[0010]纖維素酶是水解纖維素(β-1，4-葡聚糖或i3D-糖苷鍵)導(dǎo)致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維低聚糖等的酶。傳統(tǒng)上將纖維素酶分為3大類:內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4) (“EG”)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91) ( “CBH”)和β -葡萄糖苷酶([β ]_D_葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC3.2.1.21) ( “BG”) (Knowles 等人，1987 和 Shulein，1988)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用在纖維素纖維的非晶部分，而纖維二糖水解酶還能夠降解結(jié)晶纖維素。
[0011]另外已顯示，在機械木漿的處理中(Pere等人，1996)，在用作飼料添加劑(W091/04673)以及用于谷物濕磨時，纖維素酶可用于將纖維素生物質(zhì)降解為乙醇(其中纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖，酵母或其他微生物將葡萄糖進一步發(fā)酵為乙醇)。單獨的糖化和發(fā)酵是這樣的過程，其中存在于生物質(zhì)(例如玉米秸桿)中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，隨后酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。同步糖化和發(fā)酵是這樣的過程，其中存在于生物質(zhì)(例如玉米秸桿)中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，與此同時并且在相同反應(yīng)器中，酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。通過易得的纖維素源制備乙醇提供了穩(wěn)定的可再生燃料源。
[0012]通過多種細菌、酵母和真菌制得纖維素酶。某些真菌產(chǎn)生能夠降解結(jié)晶形式的纖維素的完全纖維素酶系(即全纖維素酶)。然而，全纖維素酶，尤其是天然存在的全纖維素酶，不一定能夠?qū)崿F(xiàn)有效降解，因為其可能不包括實現(xiàn)該效率所需的所有組分/活性成分，例如來自CBH、EG和BG分類中每一個的活性成分。(Filho等人，1996)。已知各CBH、EG和BG組分不能單獨地導(dǎo)致有效水解，但EG型纖維素酶和CBH型纖維素酶的組合互相作用，從而比任何單獨使用的酶更有效地降解纖維素(Wood, 1985 ；Baker等人，1994 ;和Nieves等人，1995)。
[0013]在本領(lǐng)域中已知的是，纖維素酶可用于處理紡織品，用于增強清潔劑組合物的清潔能力，用作軟化劑，用于改善棉織品的觸感和外觀等(Kumar等人,1997)。具有改善的清潔性能(美國專利N0.4，435，307 ;國際專利申請N0.2，095，275和2，094，826)以及用于處理織物以改善紡織品的觸感和外觀(美國專利N0.5，648，263,5, 691，178和5，776，757以及國際專利申請N0.1, 358，599)的含纖維素酶的清潔劑組合物已有所描述。
[0014]因此，在真菌和細菌中制得的纖維素酶已受到極大關(guān)注。具體地講，已證實木霉(Trichoderma spp.)(如長枝木霉(T.1ongibrachiatum)或里氏木霉(T.reesei))的發(fā)酵可產(chǎn)生能夠降解結(jié)晶形式 的纖維素的完全纖維素酶系。多年以來，已通過典型的誘變、篩選、選擇和開發(fā)高度精細的大規(guī)模低成本發(fā)酵條件，改善了木霉屬纖維素酶生產(chǎn)。雖然木霉的多組分纖維素酶系能夠?qū)⒗w維素水解為葡萄糖，但存在來自其他微生物(尤其是細菌菌株)的具有不同的有效纖維素水解性能的纖維素酶，并且將為有利的是，在絲狀真菌中表達這些蛋白，以用于工業(yè)規(guī)模纖維素酶生產(chǎn)。然而，許多研究結(jié)果顯示，通過絲狀真菌表達細菌酶的產(chǎn)量較低(Jeeves等人，1991)。
[0015]諸如葡萄糖和纖維二糖的可溶性糖在化學(xué)品和生物制品的生產(chǎn)中有許多用途。纖維素水解的優(yōu)化允許可溶性糖的生產(chǎn)中更少的酶用量和改善的成本效率。[0016]木質(zhì)纖維素生物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖對于以經(jīng)濟有效和環(huán)境友好方式生產(chǎn)生物乙醇至關(guān)重要。為降低能源和加工成本，通過可行過程產(chǎn)生的最小乙醇濃度應(yīng)為至少4%(w/v) 0可通過加工具有較高固體干物質(zhì)的底物實現(xiàn)此類增加的乙醇濃度。然而，糖化高干物質(zhì)生物質(zhì)的相關(guān)常見問題是漿液的高粘度，導(dǎo)致漿液不可泵送或處理時需要較大能量輸入。處理高固體時，將出現(xiàn)以下問題，例如I)混合不充分，質(zhì)量傳遞有限，2)抑制劑濃度增加，例如乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛、酚醛樹脂木質(zhì)素降解產(chǎn)物，3)生產(chǎn)抑制，例如葡萄糖、纖維二糖、乙醇，以及4)發(fā)酵微生物可行性。高粘度限制了過程中的干底物含量，從而增加耗能和耗水量，降低分離效率、蒸發(fā)和熱交換，并最終降低乙醇產(chǎn)量。因此，降低粘度是有益的，并且酶在降解導(dǎo)致高粘度的可溶/不溶性化合物時發(fā)揮著重要作用。
[0017]已進行增加固體載量和/或降低糖化過程粘度的研究。例如，許多研究利用補料分批操作，以便增加生物質(zhì)底物載量中的固體含量。使用了重力混合反應(yīng)器，該反應(yīng)器允許以最多至40%固體濃度分批酶液化和水解預(yù)處理麥秸。該補料分批策略在酶水解過程中連續(xù)地加載生物質(zhì)底物或酶底物，以便實現(xiàn)大量底物的水解，水解過程中相對較低的粘度，以及過程中相對高的葡萄糖濃度?；蛘?，可在酶最適溫度(如50°C)下，對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進行一段時間的酶法預(yù)水解，以降低漿液粘度，從而允許泵送和攪拌。預(yù)水解過程中粘度的降低使得后續(xù)發(fā)酵或SSF成為可能。
[0018]盡管開發(fā)了許多方法，但本領(lǐng)域仍需要其他方法以降低粘度和提高所需可發(fā)酵糖產(chǎn)量。
[0019]本文引用的所有參考文獻(包括專利、專利申請和出版物)全文以引用方式并入。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本公開部分基于以下意外發(fā)現(xiàn):在生物質(zhì)糖化混合物中引入某些內(nèi)切葡聚糖酶(例如，具有糖基水解酶家 族61 ( “GH61”)/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，諸如里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶(“Eg4”))顯著降低了混合物的粘度。本公開還涉及引入此類酶以顯著提高糖化和通過給定生物質(zhì)底物產(chǎn)生的所需可發(fā)酵糖的產(chǎn)量。
[0021]本文提供了具有糖基水解酶家族61 ( “GH61”)/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。所謂“GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性”是指，多肽具有GH61活性和/或內(nèi)切葡聚糖酶活性。在一些方面，多肽為分離的。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)為來自多個物質(zhì)的GH61內(nèi)切葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶IV( “EG IV”)，或為對應(yīng)于GH61內(nèi)切葡聚糖酶(例如與其同源，共享功能結(jié)構(gòu)域，共享GH61基序和/或共享保守殘基)的多肽(如里氏木霉Eg4多肽)。此類物種包括木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、脈抱菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、綿霉屬(Achlya)、柄孢殼菌屬(Podospora)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、毛霉屬(Mucor)、旋孢腔屬(Cochliobolus)、梨孢屬(Pyricularia)、金孢菌屬(Chrysosporium)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、金抱子菌(Chrysosporium lucknowense)、桿抱狀鍵抱菌(Fusarium bactridioides)、禾谷鍵抱菌(Fusarium cerealis)、克地鍵抱菌(Fusarium crookwel Iense)、大刀鍵抱菌(Fusarium culmorum)、禾本科德抱菌(Fusarium graminearum)、禾赤德抱菌(Fusarium graminum)、異抱德抱菌(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱菌(Fusariumnegundi)、尖抱德抱菌(Fusarium oxysporum)、多枝德抱菌(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢菌(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢菌(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢菌(Fusarium sarcochroum)、擬枝抱德抱菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱菌(Fusarium sulphureum)、族囊德抱菌(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱菌(Fusariumtrichothecioides)、毒性德抱菌(Fusarium venenatum)、煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsis aneirina)、淺黃擬錯菌(Ceriporiopsis caregiea)、車乞擬錯孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、擬錯菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬錯菌(Ceriporiopsis rivulosa)、淺紅擬錯菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬錯菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、綿毛狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)、間型脈抱菌(Neurospora intermedia)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、變灰青霉(Penicillium canescens)、離生青霉(Penicilliumsoli turn)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脈菌(Phlebia radiate)、杏鮑燕(Pleurotus eryngii)、黃色籃狀菌(Talaromyces fIavus)、太瑞斯梭抱殼霉(Thielavia terrestris)、長域毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、長枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉(Trichoderma viride)、埃默森撫青霉(Geosmithiaemersonii)或嗜熱脂肪地芽抱桿菌(G.stearothermophilus)。
[0022]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)為選自具有本公開圖1所示氨基酸序列的多肽的GH61內(nèi)切葡聚糖酶。例如，合適的GH61內(nèi)切葡聚糖酶包括由其基因庫登錄號 CAB97283.2、CAD70347.1、CAD21296.1、CAE81966.1、CAF05857.UEAA26873.UEAA29132.UEAA30263.UEAA33178.UEAA33408.UEAA34466.1、EAA36362.1、EAA29018.1和EAA29347.1表示的那些，或以下命名的那些:嗜熱節(jié)格孢(S.thermophilum)24630 的 St61、嗜熱節(jié)格孢 23839c 的 St61A、嗜熱節(jié)格孢 46583 的 St61B、嗜熱節(jié)格孢 80312 的 St61D、煙曲霉(A.fumigatus)Afu3g03870 的 Afu61a (NCBI 參考序列:XP—748707)、NCBI參考序列為XP—750843.1的煙曲霉Afu6g09540的內(nèi)切葡聚糖酶、煙曲霉EDP47167的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉(T.terrestris) 16380的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉155418的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉68900的內(nèi)切葡聚糖酶、球毛殼菌(C.globosum)的Cg61A(EAQ86340.1)、里氏木霉Eg7、里氏木霉Eg4以及基因庫登錄號為XP—752040的煙曲霉Af293的內(nèi)切葡聚糖酶。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)包含與SEQ ID N0:l-29和148中任一個具有至少約60% (例如，至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的氨基酸序列。在某些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)包含氨基酸序列，該氨基酸序列包含選自以下的一個或多個序列基序:(I) SEQ ID N0:84和88 ； (2) SEQ ID NO:85 和 88 ; (3) SEQ ID NO:86 ；(4)SEQ ID NO:87 ；(5)SEQ ID N0:84、88 和89 ； (6) SEQ ID NO:85、88和 89 ; (7) SEQ ID N0:84、88和90 ; (8) SEQ ID NO:85、88和90 ; (9)SEQ ID N0:84、88和91 ； (IO)SEQ ID NO:85、88和91 ； (Il)SEQ ID NO:84、88、89和91 ； (12)SEQ ID N0:84、88、90 和 91 ； (13) SEQ ID NO:85、88、89 和 91 ;以及(14) SEQ ID NO:85、88、90和91。在一些實施例中，多肽長度為至少約100 (例如，至少約120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240或更多)個氨基酸殘基。
[0023]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽為GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體，例如選自圖1中所列的那些的其中一個。合適的多肽包括例如基因庫登錄號CAB97283.2、CAD70347.UCAD21296.UCAE81966.UCAF05857.UEAA26873.UEAA29132.UEAA30263.1、EAA33178.1、EAA33408.1、EAA34466.1、EAA36362.1、EAA29018.1 或 EAA29347.1，或嗜熱節(jié)格孢24630的St61、嗜熱節(jié)格孢23839c的St61A、嗜熱節(jié)格孢46583的St61B、嗜熱節(jié)格孢 80312 的 St61D、煙曲霉 Afu3g03870 的 Afu61a (NCBI 參考序列:XP_748707)、煙曲霉Afu6g09540的酶(NCBI參考序列:XP_750843.1)、煙曲霉EDP47167的酶、太瑞斯梭孢殼霉16380的酶、太瑞斯梭孢殼霉155418的酶、太瑞斯梭孢殼霉68900的酶和球毛殼菌Cg61A(EAQ86340.1)、里氏木霉Eg7、里氏木霉Eg4、和煙曲霉Af293的酶(基因庫登錄號:XP_752040)。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽為包含SEQ ID N0:l_29和148中任一個的酶的變體。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以是長度為至少約100(例如，至少約 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240 或更多)個氨基酸殘基的酶的變體，包含選自以下的一個或多個序列基序:(I) SEQ ID NO: 84和88 ; (2) SEQ IDNO: 85 和 88 ; (3) SEQ ID NO: 86;⑷ SEQ ID NO: 87; (5) SEQ ID NO: 84、88 和 89 ; (6) SEQ IDN0:85、88和89;(7)SEQ ID NO: 84、88 和 90 ; (8) SEQ ID NO: 85、88 和 90 ; (9) SEQ ID NO: 84、88 和 91 ; (IO)SEQ ID N0:85、88 和 91 ； (Il)SEQ ID NO: 84、88、89 和 91 ； (12) SEQ ID NO: 84,88、90 和 91 ; (13)SEQ ID NO: 85、88、89 和 91 ;以及(14) SEQ ID NO: 85、88、90 和 91。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以是GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體，其中該變體具有與SEQID NO: 1-18 中任一個具有至少約 60% (例如，至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一者)同一性的氨基酸序列。
[0024]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如，分離的多肽，包括GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體)具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。該變體可以包含選自SEQ ID N0:84-91的至少一個基序(至少1、2、3、4、5、6、7或8個基序)。出于本公開的目的，可按其功能來提及酶。例如，內(nèi)切葡聚糖酶多肽還可作為具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽提及，或反之亦然。
[0025]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(包括GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體)包含選自以下的一個或多個序列基序= (I)SEQ ID NO: 84和88 ; (2) SEQ ID NO: 85和88;(3) SEQ ID NO: 86;⑷ SEQ ID NO: 87; (5) SEQ ID NO: 84、88 和 89 ; (6) SEQ ID N0:85、88 和89; (7)SEQ ID NO:84、88 和 90 ; (8)SEQ ID NO:85、88 和 90 ; (9)SEQ ID N0:84、88 和 91;(IO)SEQ ID N0:85、88和91；(Il)SEQ ID NO:84、88、89 和 91 ； (12)SEQ ID N0:84、88、90和91 ； (13) SEQ ID NO: 85、88、89 和 91 ;以及(14) SEQ ID NO: 85、88、90 和 91。
[0026]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(包括變體)包含CBM結(jié)構(gòu)域(例如功能CBM結(jié)構(gòu)域)。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(包括GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體)包含催化結(jié)構(gòu)域(例如功能催化結(jié)構(gòu)域)。
[0027]本文還提供了 EG IV多肽的變體。例如，此類變體可與SEQ ID NO: 1-29和148中任一個或它們的成熟多肽具有至少約60% (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性。例如，本文提供了里氏木霉Eg4多肽的變體。此類變體可以與SEQ ID NO:27的殘基22至344具有至少約60% (例如，至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、92.5%、95%、96%、97%、98% 或 99%)的序列同一性。在一些方面，多肽或其變體為分離的。在一些方面，多肽或其變體具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于SEQ ID NO:27的H22、D61、G63、C77、H107、R177、E179、H184、Q193、C198、Y195 和 Y232 中的至少約 5 個殘基(例如，至少約 6、7、8、9、10、11或12個中任一者)的殘基，或任何其他多肽中的任何對應(yīng)保守殘基。在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于 SEQ ID NO: 27 的 H22、D61、G63、C77、H107、R177、E179、H184、Q193、C198、Y195和Y232的殘基。多肽或其變體可以包含對應(yīng)于SEQ ID NO:27的G313、Q314、C315、G316、G317、S321、G322、P323、T324、C326、A327、T331、C332、N336、Y338、Y339、Q341、C342和L343中的至少5個殘基(例如，至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個中的任一者)的殘基。在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于SEQ ID NO:27的G313、Q314、C315、G316、G317、S321、G322 、P323、T324、C326、A327、T331、C332、N336、Y338、Y339、Q341、C342和L343的殘基。多肽或其變體可以包含CBM結(jié)構(gòu)域(例如功能CBM結(jié)構(gòu)域)。在一些方面，多肽或其變體包含催化結(jié)構(gòu)域(例如功能催化結(jié)構(gòu)域)。
[0028]本文還提供了編碼本文多肽中任一者的核酸或多核苷酸。例如，本公開提供了編碼與SEQ ID NO: 1-29和148中任一者具有至少約60% (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的多肽的多核苷酸。例如，本公開提供了本文分離的核酸，其與SEQ ID N0:30具有至少約60% (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、92.5%、95%、96%、97%、98% 或 99%)的同一性。還提供了包含上述核酸的表達盒、載體和細胞。
[0029]本文還提供了包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的酶組合物(例如，非天然存在的組合物)。在一些方面，組合物包含全纖維素酶，其包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或其變體)。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽為例如里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV(“T.reesei Eg4”)或其變體。里氏木霉Eg4的變體可為本文所提供變體中的任何一個。
[0030]在一些方面，酶組合物為纖維素酶組合物。酶組合物還可以包含一種或多種半纖維素酶，因此還可為半纖維素酶組合物。在一些方面，酶組合物包含至少一種(例如，至少2、
3、4、5、6、7或8種)纖維素酶多肽。在一些方面，至少一種纖維素酶多肽為具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、具有纖維二糖水解酶活性的多肽或具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽。在一些方面，組合物還包含至少一種(例如，至少2、3、4、5、6、7或8種)半纖維素酶多肽。在一些方面，至少一種半纖維素酶多肽為具有木聚糖酶活性的多肽、具有β -木糖苷酶活性的多肽、或具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽、或具有木聚糖酶/ β -木糖苷酶組合活性、β -木糖苷酶/L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶組合活性或木聚糖酶/L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶組合活性的多肽。在一些方面，組合物包含至少一種(例如，至少2、3、4、5、6、7或8種)纖維素酶多肽以及至少一種(例如，至少2、3、4、5、6、7或8種)半纖維素酶多肽。
[0031]在一些方面，酶組合物包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，還包含至少一種(例如至少2、3、4或5種)具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、至少一種(例如至少2、3、4或5種)具有纖維二糖水解酶活性的多肽、至少一種(例如至少2、3、4或5種)具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽、至少一種(例如至少2、3、4或5種)具有木聚糖酶活性的多肽、至少一種(例如至少2、3、4或5種)具有β -木糖苷酶活性的多肽和/或至少一種(例如至少2、3、4或5種)具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。
[0032]在一些方面，組合物包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或其變體)以及至少一種具有木聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2、AfuXyn5或它們變體)。在一些方面，組合物還包含至少一種具有β _葡萄糖苷酶活性的多肽(例如 Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G、Tn3B或它們的變體)。在一些方面，組合物還包含至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBHl、煙曲霉74、78、球毛殼菌7八、78、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌(S.thermophile)6A、6B或它們的變體)。在一些方面，組合物還包含至少一種除具有GH61酶活性外還具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如，里氏木霉EGl、里氏木霉EG2或它們的變體)。
[0033]組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)和至少一種具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽(例如Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G、Tn3B 或它們的變體)。組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)。組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉EG1、里氏木霉EG2或它們的變體)。組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有β-木糖苷酶活性的多肽(例如 Fv3A、Fv43A、Pf43A、Fv43D、Fv39A、Fv43E、Fo43A、Fv43B、Pa51A、Gz43A、里氏木霉Bxll或它們的變體)。組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(例如Af43A、Fv43B、Pf51A、Pa51A、Fv51A或它們的變體)。
[0034]本文所述組合物的任何一種可以包含全纖維素酶。例如，提供了包含全纖維素酶的組合物，該全纖維素酶包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。作為另外一種選擇，提供了包含全纖維素酶和具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的組合物。在一些方面，提供了組合物，其包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，和除具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽之外具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，具有纖維二糖水解酶活性的多肽，以及具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽。組合物還包含一種或多種半纖維素酶多肽。例如，組合物可以包含一種或多種具有木聚糖酶活性的多肽、一種或多種具有β -木糖苷酶活性的多肽，和/或一種或多種具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，至少一種具有木聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2、AfuXyn5或它們的變體)以及全纖維素酶。在一些方面，提供了組合物，其包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，至少一種具有木聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2、AfuXyn5或它們變體)，以及少一種具有半纖維素酶活性的其他多肽。
[0035]在一些方面，全纖維素酶包含至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉EG1、里氏木霉EG2或它們的變體)，所述多肽不是具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。全纖維素酶可包含至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBHl、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)。全纖維素酶可包含至少一種具有葡萄糖苷酶活性的多肽(例如 Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G、Tn3B或它們的變體)。
[0036]在一些方面，在本文所述組合物的任何一種中，至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，但不是具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽為例如里氏木霉EGl (或它們的變體)和/或里氏木霉EG2 (或它們的變體)。在一些方面，至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽為例如里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體。在一些方面，至少一種具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽為例如 Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G和/或Tn3B或它們的變體。在一些方面，至少一種具有木聚糖酶活性的多肽為例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2和/或AfuXyn5或它們的變體。在一些方面，至少一種具有β-木糖苷酶活性的多肽為例如第I組β-木糖苷酶或第2組β-木糖苷酶，其中第I組木糖苷酶可以是Fv3A、Fv43A多肽或它們的變體，第2組β -木糖苷酶可以是 Pf43A、Fv43D、Fv39A、Fv43E、Fo43A、Fv43B、Pa51A、Gz43A、里氏木霉 Bxll 多肽或它們的變體。在一些方面，至少一種具有木糖苷酶活性的多肽為例如Fv3A (或它們的變體)和/或Fv43D (或它們的變體)。在一些方面，至少一種具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽可以是Af43A、Fv43B、Pf51A、Pa51A和/或Fv51A或它們的變體。
[0037]在一些方面，提供了包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)的組合物。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)由宿主細胞表達，其中編碼具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的核酸已在宿主細胞中進行工程改造。例如，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽由宿主細胞表達，編碼該多肽的核酸與宿主細胞異源。
[0038]在一些方面，提供了組合物，其包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)，還包含一種或多種纖維素酶多肽和/或一種或多種半纖維素酶多肽，其中纖維素酶多肽和/或半纖維素酶多肽由宿主細胞表達，并且纖維素酶多肽和半纖維素酶多肽與宿主細胞異源。在一些方面，提供了組合物，其包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽并且還包含至少一種纖維素酶多肽和/或至少一種半纖維素酶多肽，并且纖維素酶多肽和/或半纖維素酶多肽由宿主細胞表達，并且纖維素酶多肽和/或半纖維素酶多肽與宿主細胞具有內(nèi)源性。在一些方面，纖維素酶多肽包含不同于具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉EG1、里氏木霉EG2或它們的變體)，具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)，或具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽(例如Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G、Tn3B或它們的變體)。在一些方面，半纖維素酶多肽包含具有木聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2、AfuXyn5或它們的變體)，具有β -木糖苷酶活性的多肽(例如Fv3A、Fv43A、Pf43A、Fv43D、Fv39A、Fv43E、Fo43A、Fv43B、Pa51A、Gz43A、里氏木霉Bxll或它們的變體)，或具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(例如Af43A、Fv43B、Pf51A、Pa51A、Fv51A或它們的變體)。
[0039]在一些方面,組合物由發(fā)酵液制得。在一些方面，組合物由結(jié)合菌株(integratedstrain)(例如本文實例中所述H3A/Eg4，#27)的發(fā)酵液制得，其中GH61內(nèi)切葡聚糖酶基因結(jié)合到宿主菌株的遺傳物質(zhì)。在一些方面，組合物由菌株的發(fā)酵液制得，其中編碼具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)的核酸與宿主細胞異源，其中GH61內(nèi)切葡聚糖酶已例如結(jié)合到菌株，或通過引入宿主菌株的載體表達。
[0040]本文提供的包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)的組合物或方法中的任何一種可以是全纖維素酶。組合物可以是經(jīng)受最少后生產(chǎn)處理(例如純化、過濾、細胞殺傷步驟和/或超濾等)并用作全發(fā)酵液制劑的發(fā)酵液。
[0041]在一些方面，提供了包含里氏木霉Eg4、里氏木霉Bgll、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv43D和Fv51A或它們的相應(yīng)變體的組合物(例如非天然存在的組合物)。組合物可以是全纖維素酶。組合物可以是經(jīng)受最少后生產(chǎn)處理(例如過濾、純化、超濾、細胞殺傷步驟等)并因此用作全發(fā)酵液制劑的發(fā)酵液。在一些方面，組合物包含分離的里氏木霉Eg4或它們的變體。在一些方面,組合物包含分離的里氏木霉Bgl 1、分離的里氏木霉xyn3、分離的Fv3A、分離的Fv43D以及分離的Fv51A中的至少一者。例如，可通過簡單加入或混合純化或分離的多肽，將上述多肽中的任何一者引入組合物。作為另外一種選擇，可使用合適的重組技術(shù)通過宿主菌株表達本文的多肽，并且上述多肽中的某些與其宿主細胞中自然存在的含量相t匕，可以過表達或欠表達。在一些方面，編碼上述多肽中的任何一者的基因可結(jié)合到宿主菌株中。在一些方面，本公開的組合物由宿主菌株的發(fā)酵液制得。在一些方面，組合物來自于結(jié)合菌株(例如H3A/Eg4，#27，如本文實例中所述)的發(fā)酵液。在一些實施例中，發(fā)酵液經(jīng)受最少后生產(chǎn)處理，并用作全發(fā)酵液制劑。在一些方面，編碼GH61內(nèi)切葡聚糖酶的核酸與宿主細胞異源。在一些方面，至少一種編碼里氏木霉Bgll、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv43D或Fv51A的核酸與表達本發(fā)明的GH61內(nèi)切葡聚糖酶的宿主細胞異源。在一些方面，至少一種編碼里氏木霉Bgl1、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv43D或Fv51A的核酸與表達GH61內(nèi)切葡聚糖酶的宿主細胞具有內(nèi)源性。
[0042]具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)可以一定量存在于酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中，與通過與本文的酶或其他組分在類型和濃度上相當(dāng)?shù)缓哂蠫H61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的對照酶組合物或?qū)φ丈镔|(zhì)糖化混合物實現(xiàn)的產(chǎn)量相比，該存在量足以增加通過生物質(zhì)材料的水解產(chǎn)生的可發(fā)酵糖的產(chǎn)量(例如增加至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80% 或 90%)。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以一定量存在于酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中，與本文的酶或其他組分在類 型和濃度上相當(dāng)?shù)缓哂蠫H61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的對照混合物的粘度相比，該存在量足以降低生物質(zhì)糖化混合物在生物質(zhì)材料水解過程中的粘度(例如降低至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80% 或 90%)。在一些方面，酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物包含至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽、至少一種具有β_葡萄糖苷酶活性的多肽，總量足以導(dǎo)致生物質(zhì)材料水解，其中多肽與生物質(zhì)材料接觸。酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物還可以包含至少一種具有木聚糖酶活性的多肽、至少一種具有β_木糖苷酶活性的多肽、至少一種具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽和/或全纖維素酶或它們的混合物，總量足以導(dǎo)致生物質(zhì)材料水解，其中多肽與生物質(zhì)材料接觸。
[0043]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或其變體)以蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％ (例如，約0.5重量％至約30重量％、約I重量％至約20重量％、約5重量％至約20重量％、約7重量％至約20重量％、或約8重量％至約15重量％)的量存在于酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中。例如，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽以蛋白總重量的約8重量％、約10重量％、或約12重量％的量存在于酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中。酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含不止一種具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。例如，酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可包含里氏木霉Eg4或它們的變體以及里氏木霉Eg7 (或它們的變體)，其中具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶(Eg4+Eg7)活性的多肽的總量為酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％(例如，約0.5重量％至約30重量％、約2重量％至約20重量％、約5重量％至約20重量％、約7重量％至約20重量％、或約8重量％至約15重量％)。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的多核苷酸表達?；蛘撸哂蠫H61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以分離或純化形式引入酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物。
[0044]在一些方面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)以蛋白總重量的約0.1重量％至約80重量％ (例如，約5重量％至約70重量％、約10重量％至約60重量％、約20重量％至約50重量％、或約25重量％至約50重量％)的量存在于酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中。酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含不止一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)，其中具有纖維二糖水解酶活性的多肽的總量為酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中蛋白總重量的約0.1重量％至約80重量％ (例如，約5重量％至約70重量％、約10重量％至約60重量％、約20重量％至約50重量％、或約25重量％至約50重量％)。在一些方面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達。在一些方面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽可以分離或純化形式引入酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物。
[0045]酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含一種或多種具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽(例如 Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G、Tn3B或它們的變體)，其中具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽的總量為酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％ (例如，約I重量％至約30重量％、約2重量％至約20重量％、約5重量％至約20重量％、或約8重量％至約15重量％)。具有β_葡萄糖苷酶活性的多肽可以由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達?；蛘撸哂笑?葡萄糖苷酶活性的多肽可以分離或純化形式引入酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物。
[0046]在一些方面，酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可包含一種或多種具有木聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2、AfuXyn5或它們的變體)，其中具有木聚糖酶活性的多肽的總量為酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％(例如，約I重量％至約40重量％、約4重量％至約30重量％、約5重量％至約20重量％、或約8重量％至約15重量％)。具有木聚糖酶活性的多肽可由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達。在一些方面，具有木聚糖酶活性的多肽可以分離或純化形式引入或混合到酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中。
[0047]酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含一種或多種具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(例如Af43A、Fv43B、Pf51A、Pa51A、Fv51A或它們的變體)，其中具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽的總量為酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％(例如，約I重量％至約40重量％、約2重量％至約30重量％、約4重量％至約20重量％、或約5重量％至約15重量％)。具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽可由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達。在一些方面，具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽可以分離或純化形式引入或混合到酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中。
[0048]酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含一種或多種具有木糖苷酶活性的多肽(例如 Fv3A、Fv43A、Pf43A、Fv43D、Fv39A、Fv43E、Fo43A、Fv43B、Pa51A、Gz43A、里氏木霉Bxll或它們的變體)，其中具有β_木糖苷酶活性的多肽的總量為酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％ (例如，約I重量％至約40重量％、約4重量％至約35重量％、約5重量％至約25重量％、或約5重量％至約20重量％)。具有β_木糖苷酶活性的多肽可由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達?；蛘?，具有β_木糖苷酶活性的多肽可以分離或純化形式引入酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物。
[0049]在一些方面，本文提供的酶組合物可以是全纖維素酶。全纖維素酶可以包含一種或多種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(諸如里氏木霉Eg4、Egl、Eg2、Eg7或它們的變體)，所述多肽由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達。全纖維素酶還可以包含一種或多種具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如，里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)，所述多肽由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達。全纖維素酶還可以包含一種或多種具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽(例如Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd 3A、Pa3G、Tn3B或它們的變體)，所述多肽由與宿主細胞異源或具有內(nèi)源性的核酸表達。全纖維素酶可以宿主細胞的發(fā)酵液形式使用。發(fā)酵液可經(jīng)受最少后生產(chǎn)處理(包括例如過濾、純化、超濾、細胞殺傷步驟等)，因此發(fā)酵液可以全發(fā)酵液制劑用于生物質(zhì)水解。
[0050]在一些方面，本文提供的酶組合物能夠?qū)⑸镔|(zhì)材料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和/或纖維二糖)。在一些方面，酶組合物能夠獲得至少約0.1(例如0.1至0.4)分率產(chǎn)物，如通過本文所述卡爾科弗盧爾測定法測定。
[0051]在一些方面，酶組合物可為纖維素酶組合物或半纖維素酶組合物。酶組合物可以包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，還可以包含一種或多種纖維素酶多肽和/或一種或多種半纖維素酶多肽，其中將一種或多種具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽以及一種或多種纖維素酶多肽，和/或一種或多種半纖維素酶多肽共混在混合物中，然后將混合物用于接觸和水解生物質(zhì)糖化混合物中的生物質(zhì)底物。
[0052]在一些方面，在不同時間將一種或多種具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、一種或多種纖維素酶多肽，以及一種或多種半纖維素酶多肽加入生物質(zhì)材料。例如，在將纖維素酶多肽和/或半纖維素酶多肽加入相同生物質(zhì)材料之前或之后，將具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽加入生物質(zhì)材料。
[0053]在一些方面，本發(fā)明的組合物包含至少一種具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和例如混合物中的生物質(zhì)材料。例如，組合物可以是水解混合物、發(fā)酵液/混合物或生物質(zhì)糖化混合物?；旌衔锟梢园环N或多種可發(fā)酵糖。
[0054]本文還提供了水解生物質(zhì)材料的方法，該方法包括將生物質(zhì)材料與酶組合物(例如非天然存在的組合物)接觸，該酶組合物包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，其含量足以水解所得生物質(zhì)糖化混合物中的生物質(zhì)材料。
[0055]本文還提供了降低生物質(zhì)混合物和/或生物質(zhì)糖化混合物的粘度的方法，該方法包括將混合物與酶組合物(例如非天然存在的組合物)接觸，該酶組合物包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，該多肽以足以降低混合物粘度的量存在于組合物中。在一些方面，生物質(zhì)混合物或生物質(zhì)糖化混合物包含生物質(zhì)材料，任選地還包含可發(fā)酵糖、全纖維素酶和/或包含具有纖維素酶活性的多肽和/或具有半纖維素酶活性的多肽的組合物。與對照混合物的粘度相比，混合物的粘度可以降低至少約5% (例如，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%或90%)，對照組合物包含相同濃度的相同組分，不同的是混合物中不存在具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。生物質(zhì)材料可以包含半纖維素、纖維素或它們的混合物。生物質(zhì)材料可以包含葡聚糖、木聚糖和/或木質(zhì)素或它們的混合物。
[0056]在一些方面，可適當(dāng)?shù)赜盟峄驂A處理或預(yù)處理生物質(zhì)材料。在一些方面，堿為氨。本發(fā)明的方法還可以包括將生物質(zhì)混合物的pH調(diào)節(jié)為約4.0至約6.5的pH (例如約4.5至約5.5的pH)。在一些方面,在約4.0至約6.5的pH (例如約4.5至約5.5的pH)下執(zhí)行該方法。在一些方面，將該方法進行約2小時至約7天(例如約4小時至約6天、約8小時至約5天、或約8小時至約3天)?？蛇m當(dāng)?shù)卦趯⑸镔|(zhì)混合物與多肽或酶組合物接觸之前進行該pH調(diào)節(jié)。
[0057]在一些方面，生物質(zhì)材料以高固體含量存在于糖化混合物中，例如，固態(tài)生物質(zhì)材料構(gòu)成糖化混合物中酶與生物質(zhì)材料的總重量的至少約5重量％至約60重量％ (例如約10重量％至約50重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約30重量％、或約20重量％至約30重量％)。所謂固態(tài)生物質(zhì)材料的重量，是指干態(tài)、干固態(tài)、自然態(tài)、或未加工態(tài)、或生物質(zhì)與酶組合物中的多肽接觸前的生物質(zhì)材料的重量。優(yōu)選地，固態(tài)生物質(zhì)材料構(gòu)成糖化混合物中酶與生物質(zhì)材料總重量的至少約15重量％，甚至更優(yōu)選地構(gòu)成至少約20重量％或25重量％。
[0058]在一些方面，該方法包括制備可發(fā)酵糖。使用本發(fā)明的方法可以制備增加含量的可發(fā)酵糖量。例如，與通過包含相同濃度的相同多肽組分但不存在具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的酶組合物水解相同生物質(zhì)材料制得的可發(fā)酵糖量相比，使用本文方法或組合物制得的可發(fā)酵糖量增加至少約5% (例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80% 或 90%)。
[0059]在一些方面，與通過具有相同濃度的相同組分但不存在具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的酶組合物處理相同生物質(zhì)材料的可發(fā)酵糖產(chǎn)量相比，包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的酶組合物的量足以將可發(fā)酵糖的產(chǎn)量增加至少約5% (例如至少約5%、10%、15%、20、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80% 或 90%)。在一些方面，與對照生物質(zhì)糖化混合物的粘度相比，生物質(zhì)糖化混合物中具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的量足以將混合物的粘度降低至少約5% (例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%或90%)，該對照生物質(zhì)糖化混合物包含相同濃度的相同生物質(zhì)和相同多肽組分，但不存在具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。
[0060]在一些方面，用于糖化或水解過程的包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的組合物量相對于生物質(zhì)材料中每克纖維素、半纖維素、或纖維素與纖維素的混合物計，為約0.1mg至約50mg蛋白(例如，約0.2mg至約40mg蛋白、約0.5mg至約30mg蛋白、約Img至約20mg蛋白、或約5mg至約15mg蛋白)。本文所述蛋白的量是指酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物中的總蛋白重量。蛋白包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，并且可以包含其他酶，諸如纖維素酶多肽和/或半纖維素酶多肽。在一些方面，用于水解或糖化過程的具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的量相對于生物質(zhì)材料中所含每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計，為約0.2mg至約30mg (例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、或約Img至約5mg)蛋白。
[0061]水解或糖化 過程中包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Egl、里氏木霉Eg2和/或它們的變體)的酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含相對于生物質(zhì)材料中的每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計約0.2mg至約30mg (例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、或約Img至約5mg)蛋白。
[0062]水解和或糖化過程中包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽(例如里氏木霉CBH1、煙曲霉7A、7B、球毛殼菌7A、7B、太瑞斯梭孢殼霉7A、7B、里氏木霉CBH2、太瑞斯梭孢殼霉6A、嗜熱鏈球菌6A、6B或它們的變體)的酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含相對于生物質(zhì)材料中的每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計約0.2mg至約30mg(例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、或約Img至約5mg)蛋白。
[0063]在一些方面，水解或糖化過程中包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽(例如Fv3C、Pa3D、Fv3G、Fv3D、Tr3A、Tr3B、Te3A、An3A、Fo3A、Gz3A、Nh3A、Vd3A、Pa3G、Tn3B或它們的變體)的酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含相對于生物質(zhì)材料中的每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計約0.2mg至約30mg (例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、或約0.5mg至約5mg)蛋白。
[0064]水解或糖化過程中包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有木聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Xyn3、里氏木霉Xyn2、AfuXyn2、AfuXyn5或它們的變體)的酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含相對于生物質(zhì)材料中的每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計約0.2mg至約30mg (例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、約0.5mg至約5mg)蛋白。
[0065]用于水解或糖化過程的包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有 β -木糖苷酶活性的多肽(例如 Fv3A、Fv43A、Pf43A、Fv43D、Fv39A、Fv43E、Fo43A、Fv43B、Pa51A、Gz43A、里氏木霉Bxll和/或它們的變體)的酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含相對于生物質(zhì)材料中的每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計約0.2mg至約30mg(例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、或約0.5mg至約5mg)蛋白。[0066]用于水解或糖化過程的包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽(例如Af43A、Fv43B、Pf51A、Pa51A、Fv51A和/或它們的變體)的酶組合物或生物質(zhì)糖化混合物可以包含相對于生物質(zhì)材料中的每克纖維素、半纖維素、或纖維素和半纖維素計約0.2mg至約30mg (例如，約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg、或約0.5mg至約5mg)蛋白。
[0067]在一些方面，在約30°C至約65°C (例如，約35°C至約60°C、約40°C至約60°C、或約45°C至約55°C)的溫度下執(zhí)行本發(fā)明的方法。
[0068]本發(fā)明的方法還可以包括將生物質(zhì)材料與包含全纖維素酶的酶組合物接觸的步驟。在一些方面，在將生物質(zhì)材料與包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的酶組合物接觸之前、之后或同時，進行將生物質(zhì)材料與包含全纖維素酶的組合物進一步接觸的步驟。
[0069]在一些方面，本發(fā)明的方法還包括將生物質(zhì)材料與包含具有纖維素酶活性的多肽和/或具有半纖維素酶活性的多肽的酶組合物接觸的步驟。可以在將生物質(zhì)材料與包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的酶組合物接觸之前、之后或同時，進行將生物質(zhì)材料與包含具有纖維素酶活性的多肽和/或具有半纖維素酶活性的多肽的組合物接觸的步驟。
[0070]在一些方面，組合物包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，并且還包含至少一種纖維素酶多肽和/或至少一種半纖維素酶多肽，其中將具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和至少一種纖維素酶 多肽和/或至少一種半纖維素酶多肽共混在混合物中，然后將混合物用于接觸生物質(zhì)材料。
[0071]在一些方面，組合物包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，并且還包含一種或多種纖維素酶多肽和/或一種或多種半纖維素酶多肽，其中具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和一種或多種纖維素酶多肽和/或一種或多種半纖維素酶多肽在不同時間加入生物質(zhì)材料。例如，在加入一種或多種纖維素酶多肽和/或一種或多種半纖維素酶多肽之前或之后，加入具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如里氏木霉Eg4或它們的變體)。
[0072]在一些方面，可以設(shè)想在工業(yè)環(huán)境和/或商業(yè)環(huán)境中的發(fā)酵液中應(yīng)用本發(fā)明的方法。因此，包含合適的GH61內(nèi)切葡聚糖酶的方法或制造、銷售或以其他方式商業(yè)化本發(fā)明組合物的方法在本公開的范圍內(nèi)。該方法包括例如以商業(yè)酶供應(yīng)模式應(yīng)用組合物或GH61內(nèi)切葡聚糖酶多肽或它們的變體，其中本發(fā)明的酶和變體以及組合物供應(yīng)或銷售給纖維素糖生產(chǎn)商、某些乙醇(生物乙醇)精煉廠或其他生物化學(xué)或生物材料制造商。在一些方面，該方法還可以現(xiàn)場生物精煉模式應(yīng)用組合物或GH61內(nèi)切葡聚糖酶多肽或它們的變體，其中本發(fā)明的多肽或變體、或非天然存在的纖維素酶和半纖維素酶組合物由酶制造商在位于纖維素糖工廠、生物乙醇精煉廠或生物化學(xué)/生物材料制造商處或其附近的位置建造的酶生產(chǎn)系統(tǒng)中制得。在一些方面，合適的生物質(zhì)底物優(yōu)選地經(jīng)過如本文所述的合適的預(yù)處理，可在生物乙醇精煉廠或生物化學(xué)/生物材料制造設(shè)施處或附近使用本文的糖化方法和酶和/或酶組合物水解。然后，所得可發(fā)酵糖可在相同設(shè)施或附近的設(shè)施處經(jīng)受發(fā)酵。
[0073]應(yīng)當(dāng)了解，可以將本文所述實施例的性質(zhì)中的一種、一些或全部進行組合，形成本發(fā)明的其他實施例。本發(fā)明的這些和其他方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0074]技術(shù)人員將理解到，附圖僅用于示例目的，而非旨在以任何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的范圍。
[0075]圖1:示出了多個具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的某些氨基酸序列。
[0076]圖2:示出了使用ClustalV (PAM250)比較多個具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如圖1所示那些(SEQ ID NO: 1-28))的多個氨基酸序列的同一性和差異性百分比。
[0077]圖3:示出了多個具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如圖1所示那些(SEQID NO: 1-28))的對比。
[0078]圖4A-4B:圖4A示出了里氏木霉Eg4(SEQ ID NO: 30)的核苷酸序列。圖4B示出了里氏木霉Eg4(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域為粗體，預(yù)測連接基為斜體。
[0079]圖5:示出了里氏木霉 Eg4(TrEG4) (SEQ ID NO:27)與里氏木霉 Eg7 (TrEG7 或TrEGb) (SEQ ID NO:26)和 TtEG (SEQ ID NO:29)的氨基酸序列對比。
[0080]圖6A-6B:圖6A提供了從TrEG7 (晶體結(jié)構(gòu)，蛋白數(shù)據(jù)庫登錄號:pdb: 2vtc)和TtEG (晶體結(jié)構(gòu)，蛋白數(shù)據(jù)庫登錄號:pdb:3EII)的序列對比和已知結(jié)構(gòu)推斷的里氏木霉Eg4(TrEg4)的保守殘基。圖6B提供了從Tr6A和Tr7A的已知序列的序列對比推斷的保守CBM結(jié)構(gòu)域殘基。
[0081]圖7列出了 GH61內(nèi)切葡聚糖酶的多個氨基酸序列基序。序列基序中的每個“a”代表可為丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸中任何一種的氨基酸。
[0082]圖8A-81:圖 8A 示出了 pENTR-TOPO-Bgl 1-943/942 質(zhì)粒。圖 8B 示出了pTrex3g943/942表達載體。圖8C示出了 pENTR/里氏木霉Xyn3質(zhì)粒。圖8D示出了 pTrex3g/里氏木霉Xyn3表達載體。圖8E示出了 pENTR_Fv3A質(zhì)粒。圖8F示出了 pTrex6g質(zhì)粒。圖8G 示出了 pTrex6g/Fv3A 表達載體。圖 8H 示出了 TOPO Blunt/Pegll_Fv43D 質(zhì)粒。圖 81 示出了 TOPO Blunt/Pegll-Fv51A 質(zhì)粒。
[0083]圖9:提供了里氏木霉結(jié)合菌株H3A的酶組合物。
[0084]圖10:列出了單獨加入實例2的每個樣品中的酶(純化或非純化)，以及這些酶的
存儲蛋白濃度。
[0085]圖11A-11D:圖1lA示出了根據(jù)實例2的通過將包含圖10的多個純化或非純化酶的酶組合物加入里氏木霉結(jié)合菌株H3A，使稀氨水預(yù)處理的玉米芯糖化后的葡萄糖釋放量。圖1lB示出了根據(jù)實例2的通過將包含圖10的多個純化或非純化酶的酶組合物加入里氏木霉結(jié)合菌株H3A，使稀氨水預(yù)處理的玉米芯糖化后的纖維二糖釋放量；圖1lC示出了根據(jù)實例2的通過將包含圖10的多個純化或非純化酶的酶組合物加入里氏木霉結(jié)合菌株H3A，使稀氨水預(yù)處理的玉米芯糖化后的木二糖釋放量；圖1lD示出了根據(jù)實例2的通過將包含圖10的多個純化或非純化酶的酶組合物加入里氏木霉結(jié)合菌株H3A，使稀氨水預(yù)處理的玉米芯糖化后的木糖釋放量。
[0086]圖12A-12B:圖12A示出了如實例3中所述的表達盒Pegll-eg4_sucA ;圖12B示出了包含如實例3中所述表達盒pEGl-EG4-sucA的pCR Blunt II TOPO的質(zhì)粒圖譜。
[0087]圖13:示出了根據(jù)實例3的通過包含由表達里氏木霉Eg4的里氏木霉結(jié)合菌株H3A轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的酶的酶組合物轉(zhuǎn)化為纖維二糖、葡萄糖、木二糖和木糖的葡聚糖和木聚糖的量或百分比。
[0088]圖14:示出了使用增加量的由表達里氏木霉Eg4的H3A轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的酶組合物所觀察到的增加的葡聚糖轉(zhuǎn)化率百分比。實驗細節(jié)在實例3中有所描述。
[0089]圖15:提供了用于實例4 (實驗I)的里氏木霉Eg4劑量表。樣品“#27”為如實例4中所述的H3A/Eg4結(jié)合菌株。添加的純化里氏木霉Eg4的量以重量％或質(zhì)量(mg蛋白/gG+X)列于“樣品描述”下。
[0090]圖16A-16B:圖16A示出了根據(jù)實例4的里氏木霉Eg4對稀氨水預(yù)處理玉米芯的糖化中葡萄糖釋放量的影響。圖16B示出了里氏木霉Eg4對稀氨水預(yù)處理玉米芯的糖化中木糖釋放量的影響。這些圖的Y軸是指反應(yīng)混合物中所釋放的葡萄糖或木糖的濃度。這些圖的X軸列出酶組合物樣品的名稱/簡介。這基于實例4 (實驗I)。
[0091]圖17A-17B:圖17A提供了用于實例4 (實驗2)的另一個里氏木霉Eg4劑量表。樣品與圖15中的那些具有類似描述。添加的純化里氏木霉Eg4的量與實例4的實驗1(上文)的量相比，具有較小增量。圖17B提供了用于實例4 (實驗3)的另一個里氏木霉Eg4劑量表。樣品與圖16和17A中的那些具有類似描述。添加的純化里氏木霉Eg4的量與實例4的實驗I和2 (上文)的量相比，具有甚至更細小的增量。
[0092]圖18A-18B:圖18A示出了不同量(0.05mg/g至1.0mg/g)的里氏木霉Eg4對稀氨水預(yù)處理玉米芯的糖化中葡萄糖釋放量的影響，如實例4中所述。圖18B示出了不同量(0.lmg/g至0.5mg/g)的里氏木霉Eg4對稀氨水預(yù)處理玉米芯的糖化中葡萄糖釋放量的影響，如實例4中所述。
[0093]圖19:示出了酶組合物中的里氏木霉Eg4對不同固體載量的稀氨水預(yù)處理玉米秸桿的糖化中葡萄糖/木糖釋放量的影響，如實例5中所述。固體載量以#%列于X軸上。
[0094]圖20:提供了根據(jù)實例6的使用包含里氏木霉Eg4的酶組合物通過稀氨水預(yù)處理玉米芯釋放的木糖單體產(chǎn)量百分比。
[0095]圖21:提供了根據(jù)實例6的使用包含里氏木霉Eg4的酶組合物通過稀氨水預(yù)處理玉米芯釋放的葡萄糖單體產(chǎn)量百分比。
[0096]圖22:提供了根據(jù)實例6的使用包含里氏木霉Eg4的酶組合物通過稀氨水預(yù)處理玉米芯釋放的全部可發(fā)酵單體的產(chǎn)量(mg/ml)。
[0097]圖23:對比了通過不含里氏木霉Eg4的酶組合物與包含0.53mg/g里氏木霉Eg4的酶組合物水解釋放的葡萄糖量。該實驗在實例7中有所描述。
[0098]圖24:示出了根據(jù)實例7的使用純化里氏木霉Eg4單獨處理氨水預(yù)處理玉米芯所釋放的葡萄糖單體。
[0099]圖25:示出并對比了由里氏木霉結(jié)合菌株H3A和結(jié)合菌株H3A/Eg4 (菌株#27)產(chǎn)生的酶劑量為14mg/g的酶組合物的糖化性能。這基于實例8的描述。
[0100]圖26:示出了由里氏木霉結(jié)合菌株H3A和結(jié)合菌株H3A/Eg4 (菌株#27)產(chǎn)生的不同酶劑量的酶組合物對酸預(yù)處理玉米秸桿的糖化性能。這基于實例9的描述。
[0101]圖27:示出了根據(jù)實例10的由里氏木霉結(jié)合菌株H3A和結(jié)合菌株H3A/Eg4(菌株#27)產(chǎn)生的酶組合物對稀氨水預(yù)處理玉米葉、莖、或芯的糖化性能。
[0102]圖28:根據(jù)葡萄糖或木糖釋放量，對比了由里氏木霉結(jié)合菌株H3A和結(jié)合菌株H3A/Eg4 (菌株#27)產(chǎn)生的酶組合物的糖化性能。這基于實例11。[0103]圖29:示出了由里氏木霉結(jié)合菌株H3A/Eg4 (菌株#27)產(chǎn)生的酶組合物的量增加時葡聚糖和木聚糖轉(zhuǎn)化率百分比的變化。這基于實例12的描述。
[0104]圖30:為列出里氏木霉Eg4添加量對稀氨水預(yù)處理玉米芯糖化的影響的表。實驗條件在實例13中有所描述。
[0105]圖31:示出了通過里氏木霉Eg4的CMC水解。實驗條件在實例13中有所描述。
[0106]圖32:示出了通過里氏木霉Eg4的纖維二糖水解。實驗條件在實例13中有所描述。
[0107]圖33:示出了用于糖化的不同酶組合物的量。實驗條件在實例14中有所描述。
[0108]圖34:示出了用對應(yīng)于圖33的各酶組合物產(chǎn)生的葡萄糖，葡萄糖+纖維二糖，或木糖的量實驗條件在實例14中有所描述。
[0109]圖35:示出了 CBH1、CBH2和里氏木霉Eg2混合物的不同比例，如實例15中所述。
[0110]圖36:示出了使用不同酶組合物的葡聚糖轉(zhuǎn)化率(%)。實驗條件在實例15中有所描述。
[0111]圖37示出了根據(jù)實例22在存在或不存在CBH I的情況下，使用包含里氏木霉Eg4的組合物處理Avicel時抗壞血酸的效應(yīng)。
[0112]圖38:示出了根據(jù)實例22在存在或不存在CBH II的情況下，使用包含里氏木霉Eg4的組合物處理Avicel時抗壞血酸的效應(yīng)。
[0113]圖39A-39B :圖39A示出了用于實例22的實驗的底物和不同酶的量，結(jié)果示于圖37中。圖39B示出了用于實例22的實驗的底物和不同酶的量，結(jié)果示于圖38中。
[0114]圖40:示出了根據(jù)實例16中所述實驗，使用不同酶組合物的玉米芯水解的葡萄糖產(chǎn)量。
[0115]圖41:示出了根據(jù)實例16的描述，使用不同酶組合物的玉米芯水解的木糖產(chǎn)量。
[0116]圖42:示出了根據(jù)實例17的描述，使用H3A和添加了純化Eg4的H3A的糖化混合物隨時間推移的粘度。
[0117]圖43:示出了根據(jù)實例18的描述，使用H3A和H3A/Eg4#27的糖化混合物隨時間推移的粘度。
[0118]圖44:示出了根據(jù)實例19的描述，使用14mg/g纖維素的H3A或H3A/Eg4#27的發(fā)酵液的、25%和30%固體的稀氨水預(yù)處理玉米芯的糖化的粘度。
[0119]圖45:示出了根據(jù)實例20，使用不同酶組合物在6小時糖化、25%干物質(zhì)、50°C、PH5.0時的葡萄糖濃度。
[0120]圖46:示出了根據(jù)實例20，使用不同酶組合物在24小時糖化、25%干物質(zhì)、50°C、PH5.0時的葡萄糖濃度。
[0121]圖47:示出了根據(jù)實例20，使用不同酶組合物在隨時間推移的糖化、25%干物質(zhì)、50°C、pH5.0時的葡萄糖濃度。
[0122]圖48:示出了根據(jù)實例20，使用不同酶組合物在隨時間推移的糖化、25%干物質(zhì)、50°C、pH5.0時的葡聚糖轉(zhuǎn)化率。
[0123]圖49提供了本公開中序列同一性的摘要。
[0124]圖50A-50B:圖50A示出了編碼Fv3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 35)。圖50B示出了 Fv3A氨基酸序列(SEQ ID NO:36)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表/Jn ο
[0125]圖51A-51B:圖51A示出了編碼Pf43A的核苷酸序列(SEQ ID N0:37)。圖51B示出了 Pf43A氨基酸序列(SEQ ID NO: 38)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示，預(yù)測碳水化合物結(jié)合組件(“CBM”)以大寫字母表示，分隔⑶和CBM的預(yù)測連接基以斜體表示。
[0126]圖52A-52B:圖52A示出了編碼Fv43E的核苷酸序列(SEQ ID N0:39)。圖52B示出了 Fv43E氨基酸序列(SEQ ID N0:40)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0127]圖53A-53B:圖53A示出了編碼Fv39A的核苷酸序列(SEQ ID N0:41)。圖53B示出了 Fv39A氨基酸序列(SEQ ID N0:42)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0128]圖54A-54B:圖54A示出了編碼Fv43A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 43)。圖54B示出了 Fv43A氨基酸序列(SEQ ID N0:44)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示，預(yù)測CBM以大寫字母表示，連接保守結(jié)構(gòu)域和CBM的預(yù)測連接基以斜體表示。
[0129]圖55A-55B::圖55A示出了編碼Fv43B的核苷酸序列(SEQ ID NO: 45)。圖55B示出了 Fv43B氨基酸序列(SEQ ID N0:46)。預(yù)測信號序列標有下劃線。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0130]圖56A-56B:圖56A示出了編碼Pa51A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 47)。圖56B示出了 Pa51A氨基酸序列(SEQ ID N0:48)。預(yù)測信號序列標有下劃線。預(yù)測L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。就里氏木霉中的表達而言，基因組DNA為密碼子優(yōu)化的(參見圖73C)。
[0131]圖57Α-57Β:圖57Α示出了編碼Gz43A的核苷酸序列(SEQ ID NO:49) ?圖57B示出了 Gz43A氨基酸序列(SEQ ID N0:50)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。就里氏木霉中的表達而言，預(yù)測信號序列由里氏木霉CBHl信號序列(myrklavisaflatara(SEQ ID NO: 120))取代。
[0132]圖58A-58B:圖58A示出了編碼Fo43A的核苷酸序列(SEQ ID N0:51)。圖58B示出了 Fo43A氨基酸序列(SEQ ID N0:52)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。就里氏木霉中的表達而言，預(yù)測信號序列由里氏木霉CBHl信號序列(myrklavisaf latara (SEQ ID NO: 120))取代
[0133]圖59A-59B:圖59A示出了編碼Af43A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 53)。圖59B示出了 Af43A氨基酸序列(SEQ ID NO: 54)。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0134]圖60A-60B:圖60A示出了編碼Pf51A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 55) ?圖60B示出了 Pf51A氨基酸序列(SEQ ID NO: 56)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。就里氏木霉中的表達而言，預(yù)測信號序列被優(yōu)化的密碼子取代，里氏木霉CBHl信號序列(myrklavisaf latara (SEQ ID NO: 120))(標有下劃線)和Pf51A核苷酸序列為針對表達優(yōu)化的密碼子。[0135]圖61A-61B:圖 61A 示出了編碼 AfuXyn2 的核苷酸序列(SEQ ID NO: 57) ? 圖 61B示出了 AfuXyn2氨基酸序列(SEQ ID NO: 58)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測GHll保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。[0136]圖62A-62B:圖 62A 示出了編碼 AfuXyn5 的核苷酸序列(SEQ ID NO: 59)。圖 62B示出了 AfuXyn5氨基酸序列(SEQ ID N0:60)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測GHll保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0137]圖63A-63B:圖63A示出了編碼Fv43D的核苷酸序列(SEQ ID N0:61)。圖63B示出了 Fv43D氨基酸序列(SEQ ID N0:62)。預(yù)測信號序列標有下劃線。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0138]圖64A-64B:圖64A示出了編碼Pf43B的核苷酸序列(SEQ ID NO: 63)。圖64B示出了 Pf43B氨基酸序列(SEQ ID N0:64)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0139]圖65A-65B:圖65A示出了編碼Fv51A的核苷酸序列(SEQ ID N0:65)。圖65B示出了 Fv51A氨基酸序列(SEQ ID N0:66)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0140]圖66Α-66Β:圖66Α示出了編碼Cg51B的核苷酸序列(SEQ ID NO: 67)。圖66B示出了 Cg51B氨基酸序列(SEQ ID N0:68)。對應(yīng)的預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0141]圖67A-67B:圖67A示出了編碼Fv43C的核苷酸序列(SEQ ID N0:69)。圖67B示出了 Fv43C氨基酸序列(SEQ ID NO: 70)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0142]圖68A-68B:圖68A示出了編碼Fv30A的核苷酸序列(SEQ ID N0:71)。圖68B示出了 Fv30A氨基酸序列(SEQ ID NO:72)。預(yù)測信號序列標有下劃線。
[0143]圖69A-69B :圖69A示出了編碼Fv43F的核苷酸序列(SEQ ID NO: 73)。圖69B示出了 Fv43F氨基酸序列(SEQ ID NO:74)。預(yù)測信號序列標有下劃線。
[0144]圖70A-70B:圖70A示出了編碼里氏木霉Xyn3的核苷酸序列(SEQ ID NO: 75)。圖70B示出了 Xyn3氨基酸序列(SEQ ID NO: 76)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0145]圖71A-71B:圖71A示出了里氏木霉Xyn2的氨基酸序列(SEQ ID N0:77)。信號序列標有下劃線。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。編碼序列可見于Tdrrdnen etal.Biotechnology, 1992, 10:1461-65 (T6n.6nen等人，《生物技術(shù)》，1992 年，第 10 期，第1461-1465頁)。圖71B示出了編碼Xyn2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 160) ?
[0146]圖72A-72B:圖72A示出了里氏木霉BxlI的氨基酸序列(SEQ ID NO: 78)。信號序列標有下劃線。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。編碼序列可見于MargolIes-Clark et al.Appl.Environ.Microbiol.1996, 62 (10): 3840-46 (Margolles-Clark 等人，《應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)》，1996年，第62卷第10期:第3840-46頁)。圖72B示出了編碼Bxll的核苷酸序列(SEQID NO:159)
[0147]圖73A-73F:圖73A示出了里氏木霉Bgl I的氨基酸序列(SEQ ID NO: 79)。信號序列標有下劃線。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。編碼序列可見于Barnett et al.Bio-Technology, 1991，9 (6): 562-567 (Barnett 等人，《生物技術(shù)》，1991 年，第 9 卷第 6 期:第 562-567頁)。圖73B示出了 Pa51A的推導(dǎo)cDNA(SEQ ID N0:80)。圖73C示出了 Pa51A的密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQ ID N0:81)。圖73D:示出了包含編碼成熟Gz43A的基因組DNA的CBHl信號序列(標有下劃線)上游的構(gòu)建體的編碼序列(SEQ ID N0:82)。圖73E:示出了包含編碼成熟Fo43A的基因組DNA的CBHl信號序列(標有下劃線)上游的構(gòu)建體的編碼序列(SEQ IDNO:83)。圖73F:示出了包含編碼成熟Pf5IA的密碼子優(yōu)化DNA的CBHl信號序列(標有下劃線)上游的構(gòu)建體的密碼子優(yōu)化編碼序列(SEQ ID NO:92)。
[0148]圖74A-74B:圖74A示出了編碼Pa3D的核苷酸序列(SEQ ID NO: 93)。圖74B示出了 Pa3D的氨基酸序列(SEQ ID NO:94)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0149]圖75A-75B:圖75A示出了編碼Fv3G的核苷酸序列(SEQ ID N0:95)。圖75B示出了 Fv3G的氨基酸序列(SEQ ID NO:96)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0150]圖76A-76B:圖76A示出了編碼Fv3D的核苷酸序列(SEQ ID NO: 97)。圖76B示出了 Fv3D的氨基酸序列(SEQ ID NO:98)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體
表不。
[0151]圖77A-77B:圖77A示出了編碼Fv3C的核苷酸序列(SEQ ID N0:99)。圖77B示出了 Fv3C的氨基酸序列(SEQ ID NO: 100)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表不。
[0152]圖78A-78B:圖78A示出了編碼Tr3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 101)。圖78B示出了 Tr3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 102)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0153]圖79A-79B:圖79A示出了編碼Tr3B的核苷酸序列(SEQ ID NO: 103)。圖79B示出了 Tr3B的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0154]圖80A-80B:圖80A示出了編碼Te3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 105)。圖80B示出了 Te3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 106)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0155]圖81A-81B:圖81A示出了編碼An3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 107) ?圖81B示出了 An3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 108)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0156]圖82A-82B:圖82A示出了編碼Fo3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 109)。圖82B示出了 Fo3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 110)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0157]圖83A-83B:圖83A示出了編碼Gz3A的核苷酸序列(SEQ ID N0:111)。圖83B示出了 Gz3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0158]圖84A-84B:圖84A示出了編碼Nh3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 113)。圖84B示出了 Nh3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 114)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0159]圖85A-85B:圖85A示出了編碼Vd3A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 115) ?圖85B示出了 Vd3A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 116)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0160]圖86A-86B:圖86A示出了編碼Pa3G的核苷酸序列(SEQ ID NO: 117)。圖86B示出了 Pa3G的氨基酸序列(SEQ ID NO: 118)。預(yù)測信號序列標有下劃線，預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域以粗體表示。
[0161]圖87:示出了編碼Tn3B的氨基酸序列(SEQ ID NO: 119) 0標準信號預(yù)測程序Signal P(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)未提供預(yù)測信號。
[0162]圖88:示出了里氏木霉 Eg4(SEQ ID NO:27)與 Tr6A(SEQ ID N0:31)以及與Tr7A(SEQ ID NO:32)的CBM結(jié)構(gòu)域的部分氨基酸序列對比。
[0163]圖89A-89C:圖89A示出了里氏木霉Eg6的氨基酸序列(SEQ ID N0:33)。加粗的氨基酸序列為預(yù)測信號肽序列。圖89B示出了大孢圓孢霉(S.coccosporum)內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:34);圖89C不出了編碼嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的GH61A的核苷酸序列(SEQ ID NO: 149)。
[0164]圖90A-901:圖90A示出了里氏木霉CBHl的同源物Afu7A的氨基酸序列(SEQ IDNO: 150)，圖90B示出了里氏木霉CBHl的同源物Afu7B的氨基酸序列(SEQ ID N0:151)，圖90C示出了里氏木霉CBHl的同源物Cg7A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 152)，圖90D示出了里氏木霉CBHl的同源物Cg7B的氨基酸序列(SEQ ID NO: 153)。圖90E示出了里氏木霉CBHl的同源物Tt7A的氨基酸序列(SEQ ID N0:154)。圖90F示出了里氏木霉CBHl的同源物Tt7B的氨基酸序列(SEQ ID勵:155)，圖906示出了里氏木霉08!12的同源物5七64的氨基酸序列(SEQ ID勵:156)，圖90!1示出了里氏木霉08!12的同源物5七68的氨基酸序列(SEQID NO: 157) ο圖901示出了里氏木霉CBH2的同源物Tt6A的氨基酸序列(SEQ ID NO: 158)。
【具體實施方式】
[0165]除非另有定 義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York(1994) (Singleton 等人，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》，第2版，紐約州約翰威立父子出版公司，1994年),和Hale&Marham, TheHarper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial,N.Y.(1991) (Hale 和Marham,《哈珀柯林斯生物詞典》，紐約州哈珀永久出版社)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用多個術(shù)語的一般詞典。盡管任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于實踐本發(fā)明，但描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。本發(fā)明并不限于所述的具體方法、規(guī)程和試劑，它們可以有所不同。
[0166]本文提供的標題并不限制本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤├?，這些方面或?qū)嵤├伎梢越鍖φf明書做整體參考而獲致。因此，通過整體參考本說明書可更完全地限定下文定義的術(shù)語。
[0167]本公開提供了組合物，其包含具有糖基水解酶家族61 (“GH61 ”) /內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、編碼本文提供的多肽的核苷酸、包含本文提供的核苷酸的載體，以及包含本文提供的核苷酸和/或載體的細胞。本公開還提供了使用本文提供的組合物水解生物質(zhì)材料的方法以及降低含生物質(zhì)混合物的粘度的方法。
[0168]如本文相對于核酸(諸如DNA或RNA)所用，術(shù)語“分離的”是指分別與以天然核酸源存在的其他DNA或RNA分離的分子。此外，所謂“分離的核酸”旨在包括核酸片段，該片段并非天然存在的片段并且在天然狀態(tài)下不可見。本文所用術(shù)語“分離的”還涉及多肽，該多肽與其他細胞蛋白分離并且旨在涵蓋純化多肽和重組多肽。如本文所用，術(shù)語“分離的”還涉及核酸或多肽，其可以基本上不含細胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的培養(yǎng)基。如本文所用，術(shù)語“分離的”還涉及核酸或多肽，其可以基本上不含化學(xué)合成的化學(xué)品前體或其他化學(xué)品。
[0169]如本文所用，多肽X的“變體”是指具有一個或多個改變的氨基酸殘基的多肽X的具有氨基酸序列的多肽。變體可以具有保守或非保守變化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的計算機程序(例如LASERGENE軟件(DNASTAR))發(fā)現(xiàn)判斷哪個氨基酸殘基可以被取代、插入或刪除而不影響生物活性的指導(dǎo)。本發(fā)明的變體包括與前體酶氨基酸序列相比包含改變的氨基酸序列的多肽，其中變體酶保持前體酶的特征性纖維素水解性，但在一些具體方面可以具有改變的性質(zhì)，例如，與前體酶相比增加或降低的最適pH、增加或降低的氧化穩(wěn)定性、增加或降低的熱穩(wěn)定性，以及增加或降低的對一個或多個底物的具體活性水平。
[0170]如本文所用，與宿主細胞“異源”的多肽或核酸是指宿主細胞中非自然存在的多肽或核酸。
[0171]對本文中的“約”值或參數(shù)的參考包括(并描述)涉及該值或參數(shù)自身的變型。例如，涉及“約X”的描述包括“X”的描述。
[0172]如本文和所附權(quán)利要求中所用，除非上下文另有明確指明，否則單數(shù)形式“一個”、“或”以及“該”包括多個指代物。
[0173]應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所述方法和組合物的方面和變型包括“由方面和變型組成”和/或“基本上由方面和變型組成”。
[0174] [0175]本公開提供了具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如，分離的、合成的或重組的多肽)。例如，本公開提供了多個菌種或其變體的GH61內(nèi)切葡聚糖酶，多個菌種或其變體的內(nèi)切葡聚糖酶IV (或內(nèi)切葡聚糖酶4)多肽(本文也稱為“Eg4”或“EG4”，在本文中可替換使用)，以及里氏木霉Eg4多肽或其變體。在一些方面，多肽為分離的。
[0176]糖苷水解酶家族61 ( “GH61”)酶
[0177]已在真核生物中鑒別出糖苷水解酶家族61( “GH61”)酶。對于來自紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的Cel61A已觀察到較弱的內(nèi)切葡聚糖酶活性(Karlsson et al, EurJ Biochem, 2001，268(24):6498-6507 (Karlsson 等人，《歐洲生物化學(xué)期刊》，2001 年，第268卷第24期:第6498-6507頁))，因此可以說其具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性。GH61多肽使得木質(zhì)纖維素底物通過纖維素酶的酶水解成為可能(Harris et al, 2010, Biochemistry, 49(15)3305-16 (Harris等人，2010年，《生物化學(xué)》，第49卷第15期，第3305-16頁))。對甲殼質(zhì)降解所涉及的同源多肽的研究預(yù)測，GH61多肽可以利用氧化水解機制，該機制需要電子供體底物并且其中涉及二價金屬離子(Vaaje-Kolstad, 2010, Science, 330 (6001), 219-22 (Vaaje-Kolstad,2010年，《科學(xué)》，第330卷第6001期，第219-22頁))。這與以下觀察結(jié)果一致:GH61多肽對木質(zhì)纖維素底物降解的協(xié)同增強效應(yīng)取決于二價離子(Harriset al, 2010, Biochemist ry, 49 (15) 3305-16 (Harris 等人，2010 年，《生物化學(xué)》，第 49 卷第15期，第3305-16頁))。GH61多肽的多種可行結(jié)構(gòu)具有由多個保守氨基酸殘基結(jié)合的二價原子(Karkehabadi，2008, J.Mol.Biol., 383 (1) 144-54; Harris et al, 2010, Biochemistry, 49 (15) 3305-16 (Karkehabadi, 2008年，《分子生物學(xué)雜志》，第383卷第I期，第144-54頁；Harris等人，2010年，《生物化學(xué)》，第49卷第15期，第3305-16頁))。已報道GH61多肽在金屬結(jié)合位點具有平面，該平面由保守殘基形成并且可能在底物結(jié)合中涉及(Karkehabadi, 2008，J.Mol.Biol.，383 (1)，144-54 (Karkehabadi，2008 年，《分子生物學(xué)雜志》，第383卷第1期，第144-54頁))。
[0178]本公開提供了具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)，其可為多個菌種的GH61內(nèi)切葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶IV( “EG IV”)，或者還可為與GH61內(nèi)切葡聚糖酶對應(yīng)(與其同源、與其共享功能結(jié)構(gòu)域、共享GH61基序和/或共享保守結(jié)構(gòu)域)的多個菌種的多肽(例如里氏木霉Eg4多肽)。此類物種包括木霉屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢菌屬、曲霉屬、脈孢菌屬、青霉菌屬、頭孢霉屬、綿霉屬、柄孢殼菌屬、內(nèi)座殼屬、毛霉屬、旋孢腔屬、梨孢屬、金抱囷屬、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)桌曲霉、黑曲霉、米曲霉、金抱子囷、桿抱狀鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、克地鐮孢菌、大刀鐮孢菌、禾本科鐮孢菌、禾赤鐮孢菌、異孢鐮孢菌、合歡木鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、多枝鐮孢菌、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、膚色鐮孢菌、擬枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢菌、簇囊鐮孢菌、擬絲孢鐮孢菌、毒性鐮孢菌、煙管菌、干擬蠟菌、淺黃擬蠟菌、乾擬蠟孔菌、擬蠟菌、環(huán)帶擬蠟菌、淺紅擬蠟菌、蟲擬蠟菌、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌、特異腐質(zhì)霉、綿毛狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲菌、粗糙脈孢菌、間型脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、變灰青霉、離生青霉、繩狀青霉、黃孢原毛平革菌、射脈菌、杏鮑菇、黃色籃狀菌、太瑞斯梭孢殼霉、長絨毛栓菌、變色栓菌、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉、埃默森疣青霉或嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
[0179]具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽包括圖1中所列多個GH61內(nèi)切葡聚糖酶。例如，合適的GH61內(nèi)切葡聚糖酶包括包含與圖1中所列的不同序列至少約60%—致的氨基酸序列的那些，包括例如由基因庫登錄號CAB97283.2、CAD70347.UCAD21296.UCAE81966.1、CAF05857.UEAA26873.UEAA29132.UEAA30263.UEAA33178.UEAA33408.UEAA34466.1、EAA36362.1、EAA29018.1和EAA29347.1表示的那些，或嗜熱節(jié)格孢24630的St61、嗜熱節(jié)格孢23839c的St61A、嗜熱節(jié)格孢46583的St61B、嗜熱節(jié)格孢80312的St61D、煙曲霉Afu3g03870 的 Afu61a (NCBI 參考序列:XP_748707)、具有 NCBI 參考序列:XP_750843.1 的煙曲霉Afu6g09540的內(nèi)切葡聚糖酶、煙曲霉EDP47167的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉16380的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉155418的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉68900的內(nèi)切葡聚糖酶、球毛殼菌的Cg61A (登錄號EAQ86340.1)、里氏木霉Eg7、里氏木霉Eg4，以及基因庫登錄號為XP_752040的煙曲霉Af293的內(nèi)切葡聚糖酶。在一些方面，本發(fā)明的合適的GH61內(nèi)切葡聚糖酶多肽包含與SEQ ID NO: 1-29和148中任一個具有至少約60%(例如，至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，本發(fā)明的合適的GH61內(nèi)切葡聚糖酶多肽包含選自以下的一個或多個氨基酸序列基序:(I)SEQ ID NO: 84 和 88 ; (2) SEQ ID NO: 85 和 88 ; (3) SEQ IDNO: 86;⑷ SEQ ID NO: 87; (5) SEQ ID NO: 84、88 和 89 ; (6) SEQ ID NO: 85、88 和 89 ; (7) SEQID N0:84、88 和 90 ;(8)SEQ ID NO: 85、88 和 90 ; (9) SEQ ID NO: 84、88 和 91 ; (10) SEQ IDN0:85、88和 91 ;(11)SEQ ID NO:84、88、89和 91 ; (12)SEQ ID NO:84、88、90 和 91 ; (13)SEQID N0:85、88、89 和 91 ;以及(14) SEQ ID NO: 85、88、90 和 91。多肽的長度可為至少 100(例如，110、120、130、140、150、160、170、180、200、220、250 或更多)個殘基。
[0180]本文提供的具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)還可以是GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體，例如具有本公開圖1所示氨基酸序列的多肽中的任何一個。例如，合適的GH61內(nèi)切葡聚糖酶包括由基因庫登錄號CAB97283.2、CAD70347.UCAD21296.1、CAE81966.1, CAF05857.UEAA26873.UEAA29132.UEAA30263.UEAA33178.UEAA33408.1、EAA34466.1、EAA36362.1、EAA29018.1 和 EAA29347.1 表示的那些，或嗜熱節(jié)格孢 24630 的St61、嗜熱節(jié)格孢23839c的St61A、嗜熱節(jié)格孢46583的St61B、嗜熱節(jié)格孢80312的St61D、煙曲霉 Afu3g03870 的 Afu61a(NCBI 參考序列:XP_748707)、NCBI 參考序列為 XP_750843.1的煙曲霉Afu6g09540的內(nèi)切葡聚糖酶、煙曲霉EDP47167的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉16380的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉155418的內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉68900的內(nèi)切葡聚糖酶、球毛殼菌的Cg61A(EAQ86340.1)、里氏木霉Eg7、里氏木霉Eg4，以及基因庫登錄號為XP_752040的煙曲霉Af293的內(nèi)切葡聚糖酶。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)為EG IV的變體。在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的多肽)為GH61內(nèi)切葡聚糖酶的變體，其中該變體具有與氨基酸序列SEQ ID NO: 1-29和148中任一個具有至少約60% (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%)同一性的氨基酸序列。
[0181]進行使用氨基酸序列SEQ ID NO: 1-29和148的對比，并且對比結(jié)果示于圖3中。圖2示出了通過多肽的氨基酸序列對比得到的同一性和差異性百分比。對比顯示，GH61內(nèi)切葡聚糖酶多肽共享某些序列基序，并且此類基序示于本公開圖7中。
[0182]因此，本公開提供了具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(例如分離的、合成的或重組的多肽)，其可以是GH61內(nèi)切葡聚糖酶或它們的變體，并且該變體可以包含選自SEQ IDN0:84-91的至少一個基序(至少2、3、4、5、6、7或8中的任一者)。具有SEQ ID NO:84-91的序列基序中的每個“a”(圖7中所述)代表可為丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸中任何一種的氨基酸。例如，在一些方面，本公開提供了包含SEQ ID N0:84、85、86、87、88、89、90和91中至少一個序列基序，諸如至少一個(例如2、3、4、5、6、7或8)的多肽(例如分離的、合成的或重組的多肽)。在一些方面，本公開提供了包含選自以下的一個或多個序列基序的多肽(例如分離的、合成的或重組的多肽):(I)SEQ ID NO: 84 和 88 ; (2) SEQ ID NO: 85 和 88 ; (3) SEQ ID NO: 86 ； (4) SEQID NO:87; (5)SEQ ID NO:84、88 和 89 ;(6)SEQ ID NO:85、88 和 89 ;(7)SEQ ID N0:84、88和90; (8) SEQ ID N0:85、88 和 90 ; (9)SEQ ID NO: 84、88 和 91 ; (10) SEQ ID N0:85、88 和 91;
(Il)SEQ ID N0:84、88、89 和 91 ;(12)SEQ ID NO:84、88、90 和 91 ; (13)SEQ ID N0:85、88、89和91;以及(14) SEQ ID N0:85、88、90和91，所選基序在至少約10，例如至少約15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350個殘基中的任一者的范圍內(nèi)，或在不成熟多肽的全長、全長成熟多肽、全長保守結(jié)構(gòu)域和/或全長CBM上。保守結(jié)構(gòu)域可為預(yù)測催化結(jié)構(gòu)域(“CD”)。示例性的多肽還包括長度為至少約 10 個，例如至少約 15、20、25、30、35、40、45、50、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600個殘基中任一者的片段。片段可包含保守結(jié)構(gòu)域和/或CBM。當(dāng)片段包含酶的保守結(jié)構(gòu)域和CBM時，片段任選地包括分隔這兩者的連接基。連接基可為天然連接基或異源連接基。在一些方面，多肽具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0183]在一些方面，具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽為GH61內(nèi)切葡聚糖酶或它們的變體、包含SEQ ID NO: 1-29和148中任一個的酶或其變體、EG IV或其變體、或里氏木霉Eg4或其變體。本文所述變體具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(包括變體)可以包含CBM結(jié)構(gòu)域(例如功能CBM結(jié)構(gòu)域)。具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽(包括變體)可以包含催化結(jié)構(gòu)域(例如功能催化結(jié)構(gòu)域)。
[0184]里氏木霉Eg4為GH61內(nèi)切葡聚糖酶多肽。里氏木霉Eg4的氨基酸序列(SEQ IDNO:27)示于圖1、4B和5中。SEQ ID N0:27為不成熟里氏木霉Eg4的序列。里氏木霉Eg4具有對應(yīng)于SEQ ID NO:27第I至21位殘基(標有下劃線)的預(yù)測信號序列；信號序列的剪切預(yù)計會產(chǎn)生成熟多肽，該成熟多肽具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 27的第22至344位殘基的序列。預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于SEQ ID NO: 27的第22-256位和307-343位殘基，后者為預(yù)測碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)。顯示里氏木霉Eg4在例如使用羧甲基纖維素作為底物的酶分析法中具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。測量內(nèi)切葡聚糖酶活性的方法亦為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
[0185]本公開還提供了里氏木霉Eg4多肽的變體，其可以包含與SEQ ID N0:27的第22至344位殘基中的至少約50 (例如，至少約55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、250或300)個連續(xù)氨基酸殘基具有至少約60%(例如，至少約65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的序列。例如，本公開提供了里氏木霉Eg4多肽的變體。此類變體可以與SEQ ID NO: 27的第22至344位殘基具有至少約70% (例如，至少約70%、75%、80%、85%、88%、90%、92.5%、95%、96%、97%、98% 或 99%)的同一性。多肽或其變體可以是分離的。多肽或其變體可以具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0186]里氏木霉Eg4殘基H22、H107、H184、Q193和Y195經(jīng)預(yù)測作為金屬配位殘基發(fā)揮作用；殘基D61和G63經(jīng)預(yù)測為保守的表面殘基；而殘基Y232經(jīng)預(yù)測為涉及活性，其中基于多種已知的內(nèi)切葡聚糖酶例如太瑞斯梭孢殼霉的內(nèi)切葡聚糖酶(登錄號ACE10234，本文也稱為“TtEG”)(SEQ ID NO:29)和里氏木霉的另一內(nèi)切葡聚糖酶Eg7 (登錄號ADA26043.1)(在本文也稱為“TrEGb”或“TrEG7”)與里氏木霉Eg4的氨基酸序列對比(參見圖5)。里氏木霉Eg4A中的預(yù)測保守殘基在圖6A和6B中示出。里氏木霉Eg4多肽的變體與天然里氏木霉Eg4相比在殘基H22、H107、H184、Q193、Y195、D61、G63和Y232處可以無改變。里氏木霉Eg4多肽的變體可在TrEGb、TtEG和里氏木霉Eg4之中保守的氨基酸殘基的至少60%、70%、80%、90%、95%、98%、或99%中無改變，如圖5的對比中所示。里氏木霉Eg4多肽的變體可包含天然里氏木霉Eg4的整個預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域。參見圖5和圖6。里氏木霉Eg4多肽的示例性變體包含與圖4B中所示的成熟里氏木霉Eg4序列(例如，SEQ ID NO: 27的第22至344 位殘基)具有至少約 70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性任一者的序列。在一些方面，里氏木霉Eg4多肽的變體具有內(nèi)切葡聚糖酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶IV(EGIV))活性。
[0187]在一些方面，里氏木霉Eg4多肽的變體具有內(nèi)切葡聚糖酶活性并包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有與SEQ ID NO:27的氨基酸序列或與SEQ ID N0:27的(i)第22-255 位、(ii)第 22-343 位、(iii)第 307-343 位、(iv)第 307-344 位或(V)第 22-344位殘基至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的任一者。
[0188]在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于SEQ ID NO:27的H22、D61、G63、C77、H107、R177、E179、H184、Q193、C198、Y195 和 Y232 的至少約 3 個殘基(例如至少約 4、5、6、7、8、9、
10、11或12個中的任一者)的殘基。在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于SEQ ID NO:27的 H22、D61、G63、C77、H107、R177、E179、H184、Q193、C198、Y195 和 Y232 的殘基。在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于 SEQ ID NO: 27 的 G313、Q314、C315、G316、G317、S321、G322、P323、T324、C326、A327、T331、C332、N336、Y338、Y339、Q341、C342 和 L343 的至少 3 個殘基(例如至少約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個中的任一者)的殘基。在一些方面，多肽或其變體包含對應(yīng)于SEQ ID N0:27的G313、Q314、C315、G316、G317、S321、G322、P323、T324、C326、A327、T331、C332、N336、Y338、Y339、Q341、C342 和 L343 的殘基。在一些方面，多肽或其變體包含CBM結(jié)構(gòu)域(例如功能CBM結(jié)構(gòu)域)。在一些方面，多肽或其變體包含催化結(jié)構(gòu)域(例如功能催化結(jié)構(gòu)域)。多肽適當(dāng)?shù)鼐哂袃?nèi)切葡聚糖酶活性。
[0189]可使用氨基酸取代制備GH61內(nèi)切葡聚糖酶、包含SEQ ID NO: 1-29和148中任一者的內(nèi)切葡聚糖酶、EG IV或里氏木霉Eg4多肽的變體。保守取代在下表中的“保守取代”標題下示出。取代還可以為下表中所示的示例性取代。
_0] 表1:氨基酸取代。
[0191]
【權(quán)利要求】
1.一種生物質(zhì)糖化混合物，所述生物質(zhì)糖化混合物包含: a.生物質(zhì)材料 b.包含具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的糖基水解酶家族61酶的酶組合物，所述酶: 1.與SEQID NO: 1-29和148的任一者具有至少65%的序列同一性； i1.與SEQID NO:27的第22-344位殘基具有至少65%的序列同一性； ii1.包含選自SEQID NO:84-91的至少一個氨基酸序列基序；
iv.包含選自(I)SEQID NO: 84 和 88 ; (2) SEQ ID NO: 85 和 88 ; (3) SEQ ID N0:86 ； (4)SEQ ID NO: 87 ； (5) SE ID N0:84、88和89;(6)SEQ ID N0:84、88 和 91 ; (IO)SEQ ID NO:85、88和91；(Il)SEQ ID N0:84、88、89和91；(12)SEQ ID N0:84、88、90和91 ；(13)SEQ ID NO:85,88、89和91;以及(14) SEQ ID NO: 85、88、90和91的一個或多個序列基序; v.由與SEQID NO: 30具有至少65%序列同一性的多核苷酸序列或其互補序列編碼；或者 v1.由在高嚴格性條件下雜交到SEQID NO:30或雜交到其互補序列的多核苷酸序列編碼； 其中所述生物質(zhì)糖化混合物具有比不含糖基水解酶家族61酶的生物質(zhì)糖化混合物低的粘度，和/或與不具有或具有較低水平糖基水解酶家族61酶的混合物中的糖化水平相t匕，能夠提高所述混合物中的糖化水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中通過將所述混合物孵育一段足以導(dǎo)致所述生物質(zhì)糖化的時間后可發(fā)酵糖的產(chǎn)量來度量所述糖化水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述糖基水解酶家族61酶衍生自絲狀真菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述絲狀真菌為選自以下的絲狀真囷:木霉屬、腐質(zhì)霉屬、鍵抱囷屬、曲霉屬、脈抱囷屬、青霉囷屬、頭抱霉屬、綿霉屬、柄抱殼菌屬、內(nèi)座殼屬、毛霉屬、旋孢腔屬、梨孢屬、金孢菌屬、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、金孢子菌、桿孢狀鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、克地鐮孢菌、大刀鐮孢菌、禾本科鐮孢菌、禾赤鐮孢菌、異孢鐮孢菌、合歡木鐮孢菌、尖鐮孢、多枝鐮孢菌、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、膚色鐮孢菌、擬分枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢菌、簇囊鐮孢菌、擬絲孢鐮孢菌、毒性鐮孢菌、煙管菌、干擬蠟菌、淺黃擬蠟菌、乾擬蠟孔菌、擬蠟菌、環(huán)帶擬蠟菌、淺紅擬蠟菌、蟲擬蠟菌、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌、特異腐質(zhì)霉、綿毛狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲菌、粗糙脈孢菌、間型脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、變灰青霉、離生青霉、繩狀青霉、黃孢原毛平革菌、射脈菌、杏鮑菇、黃色籃狀菌、太瑞斯梭孢殼霉、長絨毛栓菌、變色栓菌、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉、埃默森疣青霉或嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物還包含至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽和至少一種具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述至少一種具有纖維二糖水解酶活性的多肽為編碼里氏木霉 CBHl、Af7A(SEQ ID NO: 150) ,Af7B(SEQ ID NO: 151)、Cg7A(SEQID NO:152)、Cg7B(SEQ ID NO: 153)、Tt7A(SEQ ID NO: 154)、Tt7B(SEQ ID NO: 155)、里氏木霉 CBH2、Tt6A(SEQ ID NO: 156)、St6A (SEQ ID NO: 157)、St6B (SEQ ID NO: 158)的多肽或與其具有至少90%序列同一性的變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述至少一種具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽為:
a.編碼Fv3C(SEQ ID NO: 100)、Pa3D (SEQ ID NO:94)、Fv3G(SEQ ID NO:96)、Fv3D (SEQID NO:98),Tr3A(SEQ ID NO:102)、Tr3B(SEQ ID NO:104)、Te3A(SEQ ID NO:106)、An3A(SEQID N0:108)、Fo3A(SEQ ID NO:110)、Gz3A(SEQ ID NO:112)、Nh3A(SEQ ID NO:114)、Vd3A(SEQID NO: 116), Pa3G(SEQ ID NO: 118)、Tn3B (SEQ ID NO: 119)的多肽或與其具有至少 90% 序列同一'I"生的變體；或者 b.由(I)具有與SEQ ID N0:99、93、95、97、101、103、105、107、109、lll、113、115 或 117至少90%序列同一性；(2)在高嚴格性條件下雜交到SEQ ID N0:99、93、95、97、101、103、105、107、109、111、113、115或117或雜交到其互補序列的多核苷酸編碼的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物還包含以下一者或多者或全部:(I)具有木聚糖酶活性的多肽，(2)具有β -木糖苷酶活性的多肽；以及⑶具有L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述具有木聚糖酶活性的多肽為: a.編碼里氏木霉Xyn3(SEQ ID NO: 76)、里氏木霉 Xyn2 (SEQ ID NO: 77)、AfuXyn2 (SEQID NO:58)和AfuXyn5(SEQ ID NO:60)的多肽或與其具有至少90%序列同一性的變體；或者 b.由⑴具有與SEQID NO:75、57或59至少90%序列同一性；或⑵在高嚴格性條件下雜交到SEQ ID NO:75、57或59或雜交到其互補序列的多核苷酸編碼的多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述至少一種具有β-木糖苷酶活性的多肽為:
a.編碼Fv3A(SEQID NO: 36)、Fv43A(SEQ ID N0:44)、Pf43A(SEQ ID NO:38)、Fv43D(SEQID NO:62)、Fv39A(SEQ ID NO:42)、Fv43E(SEQ ID NO:40)、Fo43A(SEQ ID NO:52)、Fv43B(SEQID NO:46), Pa51A(SEQ ID NO: 48)、Gz43A (SEQ ID NO: 50)、里氏木霉 Bxll (SEQ ID NO:78)的多肽或與其具有至少90%序列同一性的變體；或者 b.由(I)具有與SEQ ID NO:35、43、37、61、41、39、51、45、47、49 或 159 至少 90%序列同一性；(2)在高嚴格性條件下雜交到 SEQ ID NO:35、43、37、61、41、39、51、45、47、49、159 或雜交到其互補序列的多核苷酸編碼的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所 述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述至少一種具有L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽為: a.編碼Af43A(SEQ ID NO: 54)、Fv43B (SEQ ID NO:46), Pf51A(SEQ ID NO:56),Pa51A(SEQ ID NO:48) ,Fv5IA(SEQ ID NO:66)的多肽或與其具有至少90%序列同一性的變體；或者 b.由(I)具有與SEQID NO:53、45、55、47或65至少90%序列同一性；(2)在高嚴格性條件下雜交到SEQ ID NO:53、45、55、47或65或雜交到其互補序列的多核苷酸編碼的多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物包含(I)參照所述酶組合物中的蛋白總重量,約0.1重量％至約50重量％、約I重量％至約20重量％、約5重量％至約15重量％的具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽；或(2)相對于所述生物質(zhì)材料中所含的每克纖維素、半纖維素或纖維素與半纖維素混合物計，約0.2mg至約30mg、約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約IOmg或約Img至約5mg的具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求5至12中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物包含纖維二糖水解酶，所述纖維二糖水解酶的量為(I)所述酶組合物中的蛋白總重量的約0.1重量％至約80重量％、約5重量％至約70重量％、約10重量％至約60重量％、約20重量％至約50重量％或約25重量％至約50重量％ ;或(2)相對于所述生物質(zhì)糖化混合物中所含的每克纖維素、半纖維素或纖維素與半纖維素混合物計，約0.2mg至約30mg、約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約10mg或約0.5mg至約5mg ;并且包含β -葡萄糖苷酶，所述β _葡萄糖苷酶的量為(I)所述酶組合物中的蛋白總重量的約0.1重量％至約50重量％、約I重量％至約30重量％、約2重量％至約20重量％、約5重量％至約20重量％或約8重量％至約15重量％;或(2)相對于所述生物質(zhì)糖化混合物中的每克纖維素、半纖維素或纖維素與半纖維素混合物計，約0.2mg至約30mg、約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約IOmg或約0.5mg至約5mg。
14.根據(jù)權(quán)利要求8至13中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物包含(I)參照所述酶組合物中的蛋白總重量,約0.1重量％至約50重量％、約I重量％至約40重量％、約4重量％至約30重量％、約5重量％至約20重量％或約8重量％至約15重量％的具有木聚糖酶活性的多肽；或(2)相對于所述生物質(zhì)糖化混合物中的每克纖維素、半纖維素或纖維素與半纖維素混合物計，約0.2mg至約30mg、約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約IOmg或約0.5mg至約5mg的具有木聚糖酶活性的多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求8至14中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物包含(I)參照所述酶組合物中的蛋白總重量,約0.1重量％至約50重量％、約I重量％至約40重量％、約2重量％至約30重量％、約4重量％至約20重量％或約5重量％至約15重量％的具有β -木糖苷酶活性的多肽；或(2)相對于所述生物質(zhì)糖化混合物中的每克纖維素、半纖維素或纖維素與半纖維素混合物計，約0.2mg至約30mg、約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約IOmg或約0.5mg至約5mg的具有β -木糖苷酶活性的多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求8至15中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物包含(I)參照所述酶組合物中的蛋白總重量,約0.1重量％至約50重量％、約0.1重量％至約50重量％、約I重量％至約40重量％、約2重量％至約30重量％、約4重量％至約20重量％或約5重量％至約15重量％的具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽；或⑵相對于所述生物質(zhì)糖化混合物中的每克纖維素、半纖維素或纖維素與半纖維素混合物計，約0.2mg至約30mg、約0.2mg至約20mg、約0.5mg至約IOmg或約0.5mg至約5mg的具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物為全纖維素酶組合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述全纖維素酶組合物衍生自表達編碼具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸的宿主細胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述編碼具有GH61家族酶活性的多肽的多核苷酸與所述宿主細胞異源。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述全纖維素酶組合物衍生自進一步表達編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸和編碼具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽的多核苷酸的宿主細胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸和/或所述編碼具有β-葡萄糖苷酶的多肽的多核苷酸與所述宿主細胞異源。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述全纖維素酶組合物衍生自表達以下一者或多者或全部的宿主細胞:(I)編碼具有β-木糖苷酶活性的肽的多核苷酸；(2)編碼具有木聚糖酶活性的多肽的多核苷酸；和(3)編碼具有L- α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的肽的多核苷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述編碼具有β-木糖苷酶活性的多肽的多核苷酸、所述編碼具有木聚糖酶活性的多肽的多核苷酸或所述編碼具有L-α -阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽的多核苷酸與所述宿主細胞異源。
24.根據(jù)權(quán)利要求17至23中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述酶組合物為全發(fā)酵液制劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中將以下一者或多者或全部:(1)編碼具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的所述多肽的基因；(2)編碼具有纖維二糖水解酶活性的所述 多肽的基因；(3)編碼具有β_葡萄糖苷酶活性的所述多肽的基因；(4)編碼具有β_木糖苷酶活性的所述多肽的基因；(5)編碼具有木聚糖酶活性的所述多肽的基因；和(6)編碼具有L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的所述多肽的基因整合進所述宿主細胞的遺傳物質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求18至25中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述宿主細胞為細菌宿主細胞、酵母宿主細胞或真菌宿主細胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述宿主細胞為絲狀真菌宿主細胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述絲狀真菌宿主細胞選自黑曲霉、米曲霉、金孢子菌、里氏木霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、桿孢狀鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、克地鐮孢菌、大刀鐮孢菌、禾本科鐮孢菌、禾赤鐮孢菌、異孢鐮孢菌、合歡木鐮孢菌、尖鐮孢、多枝鐮孢菌、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、膚色鐮孢菌、擬分枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢菌、簇囊鐮孢菌、擬絲孢鐮孢菌、毒性鐮孢菌、煙管菌、干擬蠟菌、淺黃擬蠟菌、乾擬蠟孔菌、擬蠟菌、環(huán)帶擬蠟菌、淺紅擬蠟菌、蟲擬蠟菌、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌、特異腐質(zhì)霉、綿毛狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲菌、粗糙脈孢菌、間型脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、變灰青霉、離生青霉、繩狀青霉、黃孢原毛平革菌、射脈菌、杏鮑菇、黃色籃狀菌、太瑞斯梭孢殼霉、長絨毛栓菌、變色栓菌、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉或綠色木霉的細胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述糖化混合物通過首先將包含具有GH61/內(nèi)切葡聚糖酶活性的所述多肽的所述酶組合物進行共混然后將所述酶組合物與所述生物質(zhì)混合而制備。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述生物質(zhì)材料包含半纖維素、纖維素或半纖維素與纖維素混合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述生物質(zhì)材料包含葡聚糖、木聚糖和/或木質(zhì)素。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述生物質(zhì)材料選自:種子、谷物、塊莖、植物廢料、食品加工或工業(yè)加工的副產(chǎn)物、玉米芯、玉米桿、草、印度草、柳枝稷、多年生藤條、木材、木屑、木材加工廢料、鋸屑、紙、廢紙、紙漿和回收紙、土豆、大豆、大麥、裸麥、燕麥、小麥、甜菜、鹿洛和稻草。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至32中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述生物質(zhì)材料經(jīng)受酸或堿預(yù)處理。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中將所述預(yù)處理的生物質(zhì)在與所述酶組合物混合前調(diào)節(jié)到約4.0至6.5的pH。
35.根據(jù)權(quán)利要求1至34中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物，其中所述生物質(zhì)材料以約5重量％至約60重量％、約10重量％至約50重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約30重量％或約20重量％至約30重量％的量存在于所述混合物中，所述量是指生物質(zhì)材料以其固體狀態(tài)相對于所述混合物總重量的量。
36.一種用于水解生物質(zhì)材料的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1至35中任一項所述的生物質(zhì)糖化混合物在適合水解所述生物質(zhì)糖化混合物中的所述生物質(zhì)材料的條件下孵育一段足夠的時間。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中適用于水解所述生物質(zhì)糖化混合物中的所述生物質(zhì)材料的所述條件包 括:(I)約3.5至約7.0的pH ; (2)約2小時或更長的持續(xù)時間；和/或⑶約20°C至約75°C的溫度。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述一段足夠的時間包括約8小時至約72小時的時間段。
39.根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項所述的方法，其中在2小時以上的任何給定時間，通過所述生物質(zhì)糖化混合物產(chǎn)生的可發(fā)酵糖的量與通過對照生物質(zhì)糖化混合物產(chǎn)生的可發(fā)酵糖的量相比增加至少約5%，所述對照生物質(zhì)糖化混合物包含相同量和類型的生物質(zhì)材料以及除不存在GH61/內(nèi)切葡聚糖酶外相同的酶組分組成。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中通過所述生物質(zhì)糖化產(chǎn)生的可發(fā)酵糖的量與通過所述對照生物質(zhì)糖化混合物產(chǎn)生的可發(fā)酵糖相比增加至少約10%。
41.根據(jù)權(quán)利要求36至40中任一項所述的方法，其中所述生物質(zhì)材料以其固體狀態(tài)按約10重量％至約50重量％的量存在。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述生物質(zhì)糖化混合物的粘度與對照生物質(zhì)糖化混合物的粘度相比降低至少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%或更多，所述對照生物質(zhì)糖化混合物包含相同量和類型的生物質(zhì)材料和除不存在GH61/內(nèi)切葡聚糖酶外相同的酶組分組成。
43.一種以商業(yè)酶供應(yīng)模式或現(xiàn)場生物精煉模式使用權(quán)利要求1至35中任一項所述的組合物將生物質(zhì)材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的方法。
【文檔編號】C12P19/02GK103842515SQ201280013810
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月17日
【發(fā)明者】C·米奇森, 李勉, B·R·凱萊門, S·E·蘭茨, K·D·溫, W·D·希茨 申請人:丹尼斯科美國公司