專利名稱：分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說，是涉及一種發(fā)酵過程中分批補加氮源發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶具備的水解木質(zhì)纖維素成糖的能力使得其具有廣泛的應(yīng)用前景，通過對秸桿等木質(zhì)纖維素水解，將其發(fā)酵成糖，在通過發(fā)酵等方法制備燃料乙醇或者其他的化工產(chǎn)品，這也是利用木質(zhì)纖維素制備能源化工產(chǎn)品當(dāng)中一個關(guān)鍵要素之一，纖維素酶的制備成本和效率也是能否實現(xiàn)生物質(zhì)基能源化工產(chǎn)品逐漸取代石油能源和化工產(chǎn)品的決定因·
素之一。高活性的纖維素酶發(fā)酵技術(shù)能夠極大的提高發(fā)酵效率節(jié)約產(chǎn)酶的成本，傳統(tǒng)的纖維素酶發(fā)酵通常采用液體深層間歇式發(fā)酵技術(shù)即在發(fā)酵初始配置發(fā)酵培養(yǎng)基時，一次性的投加足量的碳源、氮源、生長因子及微量元素等，通過控制發(fā)酵過程中的溫度、融氧、PH等保證微生物能有一個最優(yōu)的發(fā)酵條件從而獲得高發(fā)酵活性的纖維素酶。該方法操作簡單，適合大多數(shù)微生物的培養(yǎng)，易于推廣。同時該方法在前期一次性投加整個發(fā)酵過程中所需的營養(yǎng)，容易導(dǎo)致初始培養(yǎng)基濃度過高造成傳質(zhì)、傳熱的困難增加了發(fā)酵的能耗；發(fā)酵前期高濃度的營養(yǎng)會導(dǎo)致整個發(fā)酵培養(yǎng)基的滲透壓的增高不利于延滯期菌株的生長；高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)同時會導(dǎo)致前期營養(yǎng)物質(zhì)大量的用于合成菌株生長所需要的營養(yǎng)，導(dǎo)致菌株大量繁殖，以至于后期發(fā)酵合成纖維素酶時營養(yǎng)緊缺從而抑制產(chǎn)酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，通過前期添加少量的氮源在降低發(fā)酵液滲透壓的同時降低初始培養(yǎng)基的營養(yǎng)，抑制菌絲的過量繁殖，避免大量的營養(yǎng)用于菌絲生長，發(fā)酵后期通過分批補氮源，在限制營養(yǎng)用于菌絲生長的同時保證纖維素酶合成所需要的營養(yǎng)供給，提高營養(yǎng)的利用率，獲得更高的發(fā)酵纖維素酶活。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該纖維素酶的生產(chǎn)方法包括如下步驟
(1)培養(yǎng)基的配制
以纖維質(zhì)原料為唯一碳源及產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，玉米漿(CSL)、蛋白胨、酵母膏中的一種或幾種作為培養(yǎng)基的有機氮源，銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨水一種或幾種的組合作為培養(yǎng)基的無機鹽氮源，配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝液量以發(fā)酵罐裝液容量的60% 80%為宜；
(2)接種與發(fā)酵以培養(yǎng)基體積的1°/Γ5%(ν/ν)的接種量接種真菌種子液于發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程參數(shù)控制為溫度為28 30°C，溶解氧不低于109Γ20%，通氣量為O. Γθ. 3vvm
(3)過程補料根據(jù)發(fā)酵過程中真菌的生長與產(chǎn)酶的特性分別在發(fā)酵培養(yǎng)第2 3天及4^5天補加質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中無機氮源質(zhì)量的O. 25、. 5倍的無機氮源或質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中有機氮源質(zhì)量的O. 25、. 5倍的有機氮源，也可以是同時補加質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中氮源對應(yīng)質(zhì)量的O. 25、. 5倍的無機氮源及有機氮源。其中，步驟(I)配制的初始培養(yǎng)基的氮源濃度O. 059Tl% (w/v)0其中，步驟(2)中的真菌為木霉屬、曲霉屬的一種或兩種的組合。其中，所述的纖維質(zhì)原料為纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素制備纖維素的一種或幾種的混合。 其中，所述的纖維質(zhì)原料為經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維素，包括農(nóng)作物秸桿、草類、林木生物質(zhì)中的一項或幾項的組合。本發(fā)明具有以下做點
I、步驟(I)的初始培養(yǎng)基的氮源濃度為較低的水平，以O(shè). 059Tl% (w/v)為宜，以保證前期供應(yīng)少量氮源用于菌絲生長，防止大量營養(yǎng)用于菌絲繁殖。2、根據(jù)真菌的生長與產(chǎn)酶的特性補加氮源，在發(fā)酵前期補加無機氮能夠維持菌絲生長的基本營養(yǎng)易于菌絲吸收，發(fā)酵后期補加有機氮源能夠在維持菌絲基本營養(yǎng)的基礎(chǔ)上同時提供纖維素酶合成過程中所需的氨基酸等氮源營養(yǎng)，促進纖維素酶大量合成。3、補加氮源可以是單純的補加無機氮或有機氮，也可以是兩種氮源的組合補加。4、通過改變N源的添加方式，在發(fā)酵前期添加少量的N源以供菌絲生長，在產(chǎn)酶過程中分批次補加所需的N源以保證蛋白的合成，與傳統(tǒng)的間歇式發(fā)酵相比同濃度的C源及其他營養(yǎng)物質(zhì)的情況下發(fā)酵所得的酶活提高了 Γ2倍，極大的提高了產(chǎn)酶發(fā)酵營養(yǎng)的利用率，降低了生產(chǎn)成本，使得該培養(yǎng)方法更容易適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化的推廣。


圖I為里氏木霉Rut-30傳統(tǒng)間歇式發(fā)酵生長與產(chǎn)酶隨發(fā)酵時間變化的曲線圖。圖2為里氏木霉Rut-30在發(fā)酵第3天及第5天補加有機氮源玉米漿后的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶隨發(fā)酵時間變化的曲線圖。圖3為里氏木霉Rut-30在發(fā)酵第3天及第5天補加無機氮源硫酸銨后的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶隨發(fā)酵時間變化的曲線圖。圖4為里氏木霉Rut-30在發(fā)酵第3天補加硫酸銨，第5天補加玉米漿的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶隨發(fā)酵時間變化的曲線圖。圖5為黑曲霉傳統(tǒng)間歇式發(fā)酵生長與產(chǎn)酶隨發(fā)酵時間變化的曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實施例不能理解為是對技術(shù)方案的限制。實施例中的預(yù)處理草是稻草，濕度為20%左右，平均長度為2厘米左右；預(yù)處理條件是直接將2公斤稻草置于50升的預(yù)處理壓力容器中，在200攝氏度的濕熱蒸汽下預(yù)處理20 min，預(yù)處理后的秸桿烘干后進行粉碎，再通過200目的篩子獲得的。實施例I :以里氏木霉Rutc-30為發(fā)酵菌株
在50L發(fā)酵罐中，以經(jīng)過預(yù)處理的稻草為產(chǎn)酶的唯一碳源與產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑配制培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組分為預(yù)處理草 30g/L，玉米漿(CSL)3g/L，(NH4)2SO4 1.4 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 · 6H20 2mg/L, CaCl2 0. 01 g/L ;121°C滅菌 20min,降溫至 30。。，以 5% 的接種量接種培養(yǎng)好的Rutc-30的種子2L于滅菌后的發(fā)酵罐，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束，測定酶活最高為2. 12u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖I所示。實施例2 以里氏木霉Rutc-30為發(fā)酵菌株
在50L發(fā)酵罐中，以經(jīng)過預(yù)處理的稻草為產(chǎn)酶的唯一碳源與產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑配制培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組分為預(yù)處理草 30g/L，玉米漿(CSL) lg/L，(NH4)2SO4 1.4 g/L，KH2PO4 2 g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 · 6H20 2mg /L, CaCl2 0. 01 g/L ;121°C滅菌 20min,降溫至 30。。，以 2. 5% 的接種量接種培養(yǎng)好的Rutc-30的種子IL于滅菌后的發(fā)酵罐，在發(fā)酵第3天及第5天分別補加100g/L的玉米漿溶液100ml，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束；測定酶活最高為3. 21u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖2所示。實施例3 以里氏木霉Rutc-30為發(fā)酵菌株
在50L發(fā)酵罐中，以經(jīng)過預(yù)處理的稻草為產(chǎn)酶的唯一碳源與產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑配制培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組分為預(yù)處理草 30g/L，玉米漿(CSL)3g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 ·6Η20 2mg/L, CaCl2 0. Olg/ L ;121°C滅菌 20min,降溫至 28。。，以 1% 的接種量接種培養(yǎng)好的Rutc-30的種子400ml于滅菌后的發(fā)酵罐；在發(fā)酵第2天及第4天分別補加IOOg/L的(NH4)2SO4 100ml，28°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束；測定酶活最高為2.85u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖3所示。實施例4 以里氏木霉Rutc-30為發(fā)酵菌株
在50L發(fā)酵罐中，以經(jīng)過預(yù)處理的稻草為產(chǎn)酶的唯一碳源與產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑配制培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組分為預(yù)處理草 30g/L，玉米漿(CSL)2g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L,CoCl2 ·6Η20 2mg/L, CaCl2 0. Olg/ L ;121°C滅菌 20min,降溫至 29。。，以 2. 5% 的接種量接種培養(yǎng)好的Rutc-30的種子IL于滅菌后的發(fā)酵罐，在發(fā)酵第3天補加100g/L的(NH4)2SO4溶液100ml，第5天補加滅100g/L的玉米漿溶液200ml，29°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束；測定酶活最高為3. 56u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖4所示。實施例5 以黑曲霉為發(fā)酵菌株
以微晶纖維素為產(chǎn)酶的唯一碳源與產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑配制培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組分為微晶纖維素 30g/L，蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 ·7Η20 O. 3g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η205mg/L, ZnSO4 · 7Η20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7Η20 I. 6mg/L ;培養(yǎng)基于 50L 的發(fā)酵罐 121 °C 滅菌20min,降溫至28°C，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的黑曲霉的種子液2L，28°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束；測定酶活最高為I. 65u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖5所示。實施例6 :以黑曲霉為發(fā)酵囷株
以經(jīng)過微晶纖維素為產(chǎn)酶的唯一碳源與產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑配制培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組分為微晶纖維素 30g/L，蛋白胨 5g/L，(MM)2SO4 3 g/L，KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L,FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 I. 4mg/L, MnSO4 · 7H20 I. 6mg/L ;培養(yǎng)基于 50L 的發(fā)酵罐121°C滅菌20min，降溫至28°C，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的黑曲霉的種子液2L，在發(fā)酵第3天補加100g/L的(NH4)2SO4溶液300ml，第5天補加100g/L的蛋白胨，溶液500ml，28°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)束；測定酶活最高為2. 53u/mL·圖I、圖2、圖3及圖4顯示與圖I所示的傳統(tǒng)的間歇式發(fā)酵里氏木霉Rutc-30相t匕，前期少量的N源發(fā)酵菌絲的生物量明顯下降，生物量最高依次分別為20. 04g/L、15. 01g/L、15. 11 g/L及15. 36 g/L，菌絲生長在前期受到了抑制，防止了菌絲大量的生長；補加有機氮或補加無機氮都能提高發(fā)酵酶活，單純補加有機氮效果要好于補加 無機氮；在補加的效果中前期補加無機氮后期補加有機氮能獲得最好的補加效果，酶活最高可達3. 56 u/ml,是傳統(tǒng)的I. 7倍左右。圖5為以黑曲霉為發(fā)酵菌株的發(fā)酵，同樣驗證了補加氮源能有效的提高發(fā)酵酶活。本發(fā)明公開了一種分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，在發(fā)酵前期添加少量的氮源，降低了初始培養(yǎng)基的粘度，提高了傳質(zhì)傳熱的效率，同時低濃度的氮源降低了發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的滲透壓，更利于延滯期菌絲的生長；低濃度的氮源在發(fā)酵過程中抑制了菌絲的大量生長，降低了非產(chǎn)酶營養(yǎng)消耗的比率，在產(chǎn)酶過程中通過分批補加N源，保證了產(chǎn)酶N源的需求，極大地促進了產(chǎn)酶營養(yǎng)的利用率，同樣營養(yǎng)濃度情況下發(fā)酵酶活與傳統(tǒng)發(fā)酵提高f 2倍，提高了產(chǎn)酶發(fā)酵營養(yǎng)的利用率，降低了生產(chǎn)成本，該培養(yǎng)方法更容易適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化的推廣。
權(quán)利要求
1.分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是該纖維素酶的生產(chǎn)方法包括如下步驟 (O培養(yǎng)基的配制以纖維質(zhì)原料為唯一碳源及產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，玉米漿(CSL)、蛋白胨、酵母膏中的一種或幾種作為培養(yǎng)基的有機氮源，銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨水一種或幾種的組合作為培養(yǎng)基的無機鹽氮源，配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝液量以發(fā)酵罐裝液容量的60°/Γ80%為宜； (2)接種與發(fā)酵以培養(yǎng)基體積的1°/Γ5%(ν/ν)的接種量接種真菌種子液于發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程參數(shù)控制為溫度為28 30°C，溶解氧不低于109Γ20%，通氣量為O. Γθ. 3vvm (3)過程補料根據(jù)發(fā)酵過程中真菌的生長與產(chǎn)酶的特性分別在發(fā)酵培養(yǎng)第2 3天及4^5天補加質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中無機氮源質(zhì)量的O. 25、. 5倍的無機氮源或質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中有機氮源質(zhì)量的O. 25、. 5倍的有機氮源，或同時補加質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中氮源對應(yīng)質(zhì)量的O. 25、. 5倍的無機氮源及有機氮源。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是其中，所述步驟(I)的初始培養(yǎng)基中的氮源濃度為O. 059Tl% (w/v)0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是其中，所述的真國為木霉屬、曲霉屬一種或兩種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是其中，所述的纖維質(zhì)原料為纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素制備纖維素的一種或幾種的混口 O
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是其中，所述的纖維質(zhì)原料為經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維素，包括農(nóng)作物秸桿、草類、林木生物質(zhì)中的一項或幾項的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分批補加氮源培養(yǎng)真菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括如下步驟培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中以60%~80%的裝液量于121℃滅菌20min，降溫至培養(yǎng)溫度28~30℃；以裝液量1%~5%的接種量接種真菌種子液于發(fā)酵罐中發(fā)酵；分別在發(fā)酵培養(yǎng)第2~3天及4~5天補加質(zhì)量為初始培養(yǎng)基中氮源對應(yīng)質(zhì)量的0.25~0.5倍的無機氮源及有機氮源。本發(fā)明通過前期添加少量的N源在降低發(fā)酵液滲透壓的同時降低初始培養(yǎng)基的營養(yǎng)，抑制菌絲的過量繁殖，避免大量的營養(yǎng)用于菌絲生長，發(fā)酵后期通過分批補氮源，在限制營養(yǎng)用于菌絲生長的同時保證纖維素酶合成所需要的營養(yǎng)供給，提高營養(yǎng)的利用率，獲得更高的發(fā)酵纖維素酶活。
文檔編號C12R1/885GK102952791SQ20121044982
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者熊鵬, 宇文偉剛, 賀建龍 申請人:熊鵬