專利名稱：可控制雜菌污染的白腐真菌反應(yīng)器及其控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域，特別涉及在非滅菌環(huán)境條件下建立白腐真 菌降解體系時抑制其它微生物生長、繁殖的方法。用于保證對白腐真菌反應(yīng)
器的長期運行。
背景技術(shù)：
難降解有機污染物很難被微生物分解或分解速度很慢且不徹底，殘留時 間較長，是環(huán)境保護與治理技術(shù)研究的難點，至今尚無十分經(jīng)濟有效的解決 方法。
在對白腐真菌的研究中人們認識到白腐真菌能降解多種難降解有機污 染物，這為難降解有機污染物的治理提供了一條新的途徑。然而，無論國內(nèi) 還是國外，對白腐真菌處理難降解有機污染物廢水的研究都還停留在實驗室 研究階段，應(yīng)用到實際工程中的案例基本沒有。
那么是什么制約其在實際工程中應(yīng)用呢？經(jīng)過對從1982年至今的45個
反應(yīng)器研究情況的分析，我們發(fā)現(xiàn)維持白腐真菌的生物活性是關(guān)鍵的因素。
在影響白腐真菌生物活性的因素中，雜菌(主要是細菌)的干擾不容忽視。 白腐真菌有別于細菌，它屬于真核微生物，生長速度很慢。因此， 一旦反應(yīng) 體系有細菌進入，細菌就會與白腐真菌爭奪培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，由于細菌 的繁殖速度比真菌快很多，這樣，細菌就會在反應(yīng)體系內(nèi)占優(yōu)勢，而白腐真 菌因缺乏營養(yǎng)將停止生長，進而影響胞外降解酶系的分泌，使整個處理系統(tǒng) 失去降解的功能。由此可知，解決白腐真菌降解系統(tǒng)的染菌問題，有助于維 持反應(yīng)器中白腐真菌的生物活性。在實驗室研究中，采用滅菌手段來解決染 菌問題，這在實際工程中顯然是行不通的，因為它將大大提高工藝的運行成 本，即使在國外，采用滅菌手段來解決污水處理過程中的染菌問題也是沒有 先例的。最近幾年，國外的研究者已經(jīng)開始認識到染菌問題是制約白腐真菌 處理技術(shù)工業(yè)化的瓶頸問題，并開始著手研究解決這一問題。
但是，通過檢索中外文獻，只發(fā)現(xiàn)兩篇研究應(yīng)用白腐真菌降解污染物時
的抑菌技術(shù)， 一個為通過控制低pH值、氮限制培養(yǎng)基和添加天然載體，研究 應(yīng)在非滅菌環(huán)境用白腐真菌7><^^^ rer^ "r降解活性染料的控制策略， 但至今未見任何有關(guān)反應(yīng)器水平的相關(guān)研究的報道。(Judy A， et al. Competition strategies for the decolorization of a textile-reactive dye with the white—rot fungi 7]r棚ete51 p^r57'co/or under non—sterileconditions. Biotechnilogy and Bioengineering， 2003，82(6):736-744.); 另外一篇文章，是Fujita等人采用高溫(50°C)對回流系統(tǒng)中的雜菌進行抑 制(Fujita M, Era A， Ike M, Soda S， Miyata N， Hirao T. Decolorization of heat-treatment liquor of waste sludge by a bioreactor using polyurethane foam-i謹obilized white rot fungus equipped with an ultramembrane filtration unit. J". Biosci Bioeng 2000:90:387 - 94)， 可以達到80%的抑菌率。但對寬溫微生物(15-65°C)而言，此溫度是無法控 制的；另外，5(TC正好嗜熱菌的最適生長溫度范圍。此外，80%控制的殺菌 率很低，比如若8乂106的細菌去掉80%仍然還有1.6乂106，在數(shù)量級上沒有 變化。因此， 一旦白腐真菌反應(yīng)體系感染這些微生物，是無法通過溫度控制 的。
綜上所述，有關(guān)非滅菌環(huán)境如何培養(yǎng)白腐真菌和使用它降解活性染料的 研究還比較初步，目前還沒有能夠在非滅菌環(huán)境保證白腐真菌活性并能有 效抑制雜菌生長的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在白腐真菌反應(yīng)器運行中， 一旦反應(yīng)體系有雜菌(特別是細菌)進入會導致 雜菌數(shù)量的增加而使整個白腐真菌處理系統(tǒng)失去降解的功能。因此，染菌問 題是制約白腐真菌處理技術(shù)應(yīng)用的瓶頸問題。本發(fā)明的目的是提供了在自然 環(huán)境(非滅菌環(huán)境)下白腐真菌反應(yīng)器運行過程中有效抑制雜菌生長的方法 和裝置。
根據(jù)前期研究中的發(fā)現(xiàn)MnP不被低濃度的臭氧所氧化而提出采用臭氧對 白腐真菌反應(yīng)器中污染的雜菌進行控制。首先，采用外部回流臭氧作用系統(tǒng) 降低或解決臭氧對白腐真菌的影響。將白腐真菌固定于打結(jié)棉線載體上并投 入反應(yīng)器中，通過曝氣使附著白腐真菌的載體處于流化狀態(tài)，使大部分污染 的雜菌易于與白腐真菌分離。然后，通過外部回流系統(tǒng)將含有污染雜菌的處 理液回流到臭氧作用的反應(yīng)器中利用臭氧的殺菌能力對回流液中的雜菌進行 殺滅，經(jīng)過預(yù)定時間的臭氧殺菌后，將臭氧作用反應(yīng)器中的處理液流回白腐 真菌反應(yīng)器中。
本發(fā)明提供了一種可控制雜菌污染的白腐真菌反應(yīng)器，其特征在于
依次包括氣泵1連接白腐真菌反應(yīng)器2，臭氧作用的反應(yīng)器8通過泵114 連接白腐真菌反應(yīng)器2，臭氧發(fā)生裝置6連接臭氧作用的反應(yīng)器8;培養(yǎng)基容 器5通過泵I 3連接白腐真菌反應(yīng)器2，在白腐真菌反應(yīng)器2上方設(shè)有出水口 7。
本發(fā)明提供了應(yīng)用上述的可控制雜菌污染的白腐真菌反應(yīng)器的控制方
法，其特征在于，包括以下步驟
將白腐真菌固定于打結(jié)棉線載體上并投入白腐真菌反應(yīng)器2，通過氣泵1
曝氣使附著白腐真菌的載體處于流化狀態(tài)，使大部分污染的雜菌易于與白腐 真菌分離；培養(yǎng)基通過泵I 3投放至白腐真菌反應(yīng)器2中；
然后，通過泵IH將含有污染雜菌的處理液回流到臭氧作用的反應(yīng)器8中 利用臭氧的殺菌能力對回流液中的雜菌進行殺滅，經(jīng)過臭氧殺菌后，將臭氧 作用反應(yīng)器8中的處理液流回白腐真菌反應(yīng)器2中；
運行條件白腐真菌反應(yīng)器2的運行溫度為30-40度，工作體積與臭氧作用 體積之比為lh 1;曝氣采用空氣，曝氣量為120-160L/h，投加附著生長有 白腐真菌的打結(jié)絲線載體的數(shù)量為150-200個/L;
臭氧作用的反應(yīng)器8的運行溫度為20-25度；水力停留時間(HRT)為10-40 分鐘，有效體積與白腐真菌反應(yīng)器2的體積之比為1: 11;臭氧濃度0. 98mg/L， 將此濃度的臭氧作用于臭氧作用的反應(yīng)器8中的處理液。
培養(yǎng)基的投加的配方葡萄糖250mg/h.L;酒石酸胺:0.6 mg/h.L;磷酸二 氫鉀25mg/h.L;硫酸鎂6.25mg/h丄；氯化鈣1. 25mg/h. L;硫酸錳2. 2mg/h. L; 維生素B1: 0.013 mg/h.L;采用乙酸一乙酸鈉緩沖液將pH值調(diào)至4.5。
有益效果
從白腐真菌反應(yīng)器中白腐真菌的形態(tài)變化、雜菌的數(shù)量變化和產(chǎn)MnP的 結(jié)果表明本發(fā)明消除了臭氧對白腐真菌的影響且對雜菌還具有良好的殺滅 作用(可以將每毫升雜菌控制在1X105以下)，并且還能生產(chǎn)目標酶一MnP。 因此，本發(fā)明是可以用于對白腐真菌反應(yīng)器運行中對污染的雜菌進行控制的， 這為白腐真菌反應(yīng)器的建立和實際工程中應(yīng)用白腐真菌處理含難降解污染物 廢水提供了新的可能途徑。


圖l控制雜菌污染的白腐真菌反應(yīng)器裝置簡圖
圖2非連續(xù)采用臭氧控菌的控菌白腐真菌反應(yīng)器運行結(jié)果
圖中A所示的是臭氧加入的時間；B所示的是臭氧作用結(jié)束的時間。
圖3控菌白腐真菌反應(yīng)器中污染細菌
圖4錳過氧化物酶(MnP)活性變化
圖5白腐真菌反應(yīng)器中白腐真菌形態(tài)
A圖臭氧作用反應(yīng)器的HRT=20分鐘時運行20天后的白腐真菌形態(tài) B圖臭氧作用反應(yīng)器的HRT=40分鐘時運行20天后的白腐真菌形態(tài)
具體實施例方式
1錳過氧化物酶(MnP)不被低濃度的臭氧所氧化
取大腸桿菌(Ecoh')懸液加入200 ml粗酶液(酶活259U/L)中， 使每毫升粗酶液含1X109個大腸桿菌。開啟臭氧發(fā)生器待臭氧的產(chǎn)生穩(wěn)定后， 將含臭氧的氣體(采用的出口濃度為0.98mg/L)通入含大腸桿菌的粗酶液作 用至預(yù)定時間。吸取lml取原液或其稀釋液lml接種平皿，傾注牛肉膏蛋白 胨培養(yǎng)基后置于37 'C培養(yǎng)24h，計算殺滅率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭氧連續(xù)殺菌40 分鐘后酶活為2^ "/Z。酶活沒有損失而殺菌率可達99.9%。此結(jié)果表明了 出口濃度為0. 98mg/L的臭氧對MnP沒有影響，但此濃度仍然保持對細菌的有 效殺滅作用。
2非連續(xù)采用臭氧控菌的控菌白腐真菌反應(yīng)器運行
運行條件白腐真菌反應(yīng)器的運行溫度為30-40度；工作體積約2.2L;曝
氣采用空氣，曝氣量為120-160L/h，投加附著生長有白腐真菌的打結(jié)絲線載 體的數(shù)量為150-200個/L。
培養(yǎng)基的投加的配方葡萄糖250mg/h.L;酒石酸胺:0.6mg/h.L;磷酸 二氫鉀25 mg/h.L;硫酸鎂:6.25mg/h.L;氯化鈣1.25mg/h.L;硫酸錳 2.2mg/h.L;維生素Bl: 0.013 mg/h. L;采用乙酸一乙酸鈉緩沖液將pH值調(diào)至 4.5。
臭氧作用反應(yīng)器的運行溫度為20-25度；HRT為20和40分鐘，有效條件 為0.2升。臭氧濃度為0.98mg/L(氣態(tài)中的臭氧濃度)，將此濃度的臭氧通入 到200ml的處理液中。
運行方式白腐真菌反應(yīng)器連續(xù)運行，在前6天不采用臭氧對雜菌進行控 制，考察雜菌的生長情況；然后加入臭氧對污染的雜菌進行控制，待污染的 雜菌被控制后，再停止臭氧控菌，觀察雜菌的生長。
結(jié)果表明在不采用臭氧對污染的雜菌進行控制的情況下，白腐真菌反應(yīng) 器中雜菌的生長非常迅速，在運行一天后雜菌的數(shù)量就達到lX105CFU/毫升， 在運行6天后，雜菌的數(shù)量在1 X 107—1 X 108 CFU/ml之間整個反應(yīng)器呈混濁 狀態(tài)。在運行的第6天開始采用臭氧對污染的雜菌進行控制，污染雜菌的數(shù)量開 始明顯下降。通過一天的控制雜菌的數(shù)量由lX107CFU/ml下降到1X104 CFU/ml;經(jīng)過2天的控制，污染雜菌的數(shù)量降低至lX104CFU/ml，達到穩(wěn)定 的水平，在其后4天的運行中污染雜菌的數(shù)量沒有發(fā)生較大的波動，基本控 制在1X104 CFU/ml左右。
在對污染雜菌被控制到穩(wěn)定水平后，去掉臭氧的作用，污染的雜菌又迅速 繁殖， 一天后數(shù)量增加至lX107CFU/ml左右。
以上的結(jié)果表明在白腐真菌反應(yīng)器中，如果不對污染的雜菌進行控制， 污染的雜菌生長是非常迅速的。另外，臭氧對污染雜菌的控制是非常有效、 迅速的。
3控菌白腐真菌反應(yīng)器的連續(xù)運行
運行條件白腐真菌反應(yīng)器的運行溫度為30-40度；工作體積約2.2L;
曝氣采用空氣，曝氣量為120-160L/h，投加的載體量為400個。
培養(yǎng)基參考配方葡萄糖250mg/h.L;酒石酸胺0.6 mg/h.L;磷酸二氫
鉀25mg/h. L;硫酸鎂:6. 25mg/h. L;氯化轉(zhuǎn)1. 25mg/h. L;硫酸錳2. 2mg/h. L;
維生素Bl: 0.013 mg/h.L;采用乙酸一乙酸鈉緩沖液將pH值調(diào)至4.5。
臭氧作用反應(yīng)器的運行溫度為20-25度；HRT為20和40分鐘，有效條件
為0. 2升。臭氧濃度為0. 98mg/L(氣態(tài)中的臭氧濃度)，將此濃度的臭氧通入
到0.2升的處理液中。
運行方式白腐真菌反應(yīng)器連續(xù)運行且連續(xù)采用臭氧對污染雜菌的控制 結(jié)果表明1連續(xù)的臭氧對污染雜菌的控制在運行2天后達到穩(wěn)定，污染
雜菌的數(shù)量基本控制在lX105CFU/ml以下。在白腐真菌反應(yīng)器運行期間，反
應(yīng)器始終處于較清澈的狀態(tài)，沒有出現(xiàn)混濁的情況。
2在此條件下，白腐真菌能連續(xù)生產(chǎn)目標酶一錳過氧化物酶(MnP)。 3在反應(yīng)器運行期間，白腐真菌的生長始終維持。
權(quán)利要求
1、一種可控制雜菌污染的白腐真菌反應(yīng)器，其特征在于依次包括氣泵(1)連接白腐真菌反應(yīng)器(2)，臭氧作用的反應(yīng)器(8)通過泵II(4)連接白腐真菌反應(yīng)器(2)，臭氧發(fā)生裝置(6)連接臭氧作用的反應(yīng)器(8)；培養(yǎng)基容器(5)通過泵I(3)連接白腐真菌反應(yīng)器(2)，在白腐真菌反應(yīng)器(2)上方設(shè)有出水口(7)。
2、 應(yīng)用權(quán)利要求l可控制雜菌污染的白腐真菌反應(yīng)器的控制方法，其特 征在于，包括以下步驟將白腐真菌固定于打結(jié)棉線載體上并投入白腐真菌反應(yīng)器(2)，通過氣 泵(1)曝氣使附著白腐真菌的載體處于流化狀態(tài)，使大部分污染的雜菌易于與白腐真菌分離；培養(yǎng)基通過泵I (3)投放至白腐真菌反應(yīng)器(2)中；然后，通過泵n (4)將含有污染雜菌的處理液回流到臭氧作用的反應(yīng)器(8)中利用臭氧的殺菌能力對回流液中的雜菌進行殺滅，經(jīng)過臭氧殺菌后，將臭氧作用反應(yīng)器(8)中的處理液流回白腐真菌反應(yīng)器(2)中；運行條件白腐真菌反應(yīng)器(2)的運行溫度為30-40度，工作體積與臭 氧作用體積之比為ll: 1;曝氣采用空氣，曝氣量為120-160L/h,投加附著生長有白腐真菌的打結(jié)絲線載體的數(shù)量為150-200個/L;臭氧作用的反應(yīng)器(8)的運行溫度為20-25度；水力停留時間為10-40 分鐘，有效體積與白腐真菌反應(yīng)器(2)的體積之比為1:11;臭氧濃度0.98mg/L， 將此濃度的臭氧作用于臭氧作用的反應(yīng)器(8)中的處理液。
全文摘要
本發(fā)明涉及在非滅菌環(huán)境條件下建立白腐真菌降解體系時抑制污染雜菌的方法。試驗發(fā)現(xiàn)低濃度的臭氧可以用于白腐真菌反應(yīng)器中污染的雜菌進行控制；在白腐真菌反應(yīng)器運行試驗中，將白腐真菌固定于打結(jié)棉線載體上并投入反應(yīng)器中，通過曝氣使附著白腐真菌的載體處于流化狀態(tài)。然后通過外部回流系統(tǒng)，連續(xù)將含有污染雜菌的上清液引入臭氧接觸反應(yīng)器中，經(jīng)過一定的時間的臭氧殺菌后，再將臭氧處理后的液體回流至白腐真菌反應(yīng)器中。在連續(xù)采用臭氧進行控制時發(fā)現(xiàn)污染雜菌被成功控制在1×10⁴CFU/ml左右，白腐真菌能生成MnP且能在較長時間內(nèi)保持其形態(tài)不變。本發(fā)明為白腐真菌反應(yīng)器的建立和實際工程應(yīng)用白腐真菌處理難降解污染物廢水提供新可能。
文檔編號C12M1/00GK101200691SQ20071030391
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者成 周, 文湘華 申請人:清華大學