專利名稱：離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶法合成食品添加劑領域，具體涉及一種離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法。
背景技術：
現(xiàn)有技術異槲皮苷(Isoquercitrin),即槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖苷(Quercetin-3-glucose),是自然界中非常罕見的一種具有顯著的抗氧化性、抗腫瘤等生物活性的黃酮類化合物，是國際上各大醫(yī)藥食品公司競相開發(fā)的高級食品添加劑、輔助藥物或藥物有效成分，也是國際上新型多功能食品添加劑EMIQ (Enzymatically ModifiedIsoquercitrin)的合成原料(Toxicology, 2010, 268 (3) :213_218)。從天然植物中分離提取異槲皮苷，這類方法通常需要使用大量的有機溶劑，且耗時費力，生產(chǎn)效率低。酸水解產(chǎn)生的大量酸性廢水嚴重污染環(huán)境，且蘆丁酸水解過程中槲皮素和異槲皮苷并存，這也增加了后期分離純化的成本(African Journal of Biotechnology, 2011,10 (8) :1460_1466)。目前建立的生物轉化蘆丁定向合成異槲皮苷的酶促水解工藝(Journal ofMolecularCatalysis B =Enzymatic, 2012,81 :34_42)是公認的制備異槲皮苷最具前景的生產(chǎn)工藝。因而，提高糖苷酶酶促反應的速度和效率是提高蘆丁轉化率和異槲皮苷得率的關鍵技術之
O離子液體(Ionic Liquids, ILs)是由帶正電荷的離子和帶負電荷的離子構成，在-100°c和200°C間呈液體狀態(tài)。ILs具有蒸汽壓小、溶解性好、不揮發(fā)等傳統(tǒng)溶劑所沒有的優(yōu)點。離子液體具有很強的可塑性，即可以組合不同的陰陽離子來適應反應底物的極性，從而提高底物的溶解性和酶促反應速率(Journal of MolecularCatalysis B Enzymatic, 2010,65 :68_72)。嗜熱蛋白酶在離子液體中有較高的熱穩(wěn)定性(BiotechnologyProgress, 2000,16 :1129-1131), 80°C 條件下，在離子液體[BMIM] [PF6]水浴20h后，酶活性增加了 20% (Green Chemistry，2002，4 :147-151 )。脂肪酶經(jīng)離子液體[Bmim] [PF6]、[Emim] [Tf2N]、[Bmim] [BF4]和[Emim] [BF4]處理后，活性分別增加 I. 81、I.66、1. 56 和 I. 6 倍(JournaI ofMolecular Catalysis BEnzymatic,2007,45 (3-4)118-121)。離子液體中的陰離子是影響酶活的重要因素，[NO3], [CF3CO2], [CH3CO2]等比[PF6]具有更高的親核性，使得它們能更好地與脂肪酶中帶正電荷的位點結合，影響酶的構象從而影響酶的活性(Journal of the American Chemical Society, 2003,125 (14)4125-4131)。專利US2008299623A1中報道了在酶催化反應中，含有離子液體的反應介質可以提高底物溶解性，提高酶的活性及選擇性，減少產(chǎn)物抑制和副反應的發(fā)生。脂肪酶CALB在離子液體[EMIM] [BF4]中催化葡萄糖的酯化反應具有很高的選擇性，在[Μ0ΕΜΙΜ] [BF4]中反應迅速，且55°C時葡萄糖的溶解度可達5g/L,是丙酮中的100多倍(Current Opinionin Biotechnology, 2003,14 :432-437)。β -半乳糖苷酶催化N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)乳糖的反應中，由于產(chǎn)物N-乙酰乳糖胺的競爭性二級水解使產(chǎn)率受到抑制。此反應在[MMIm][MeSO4] /水(V/V25 75)中進行時，產(chǎn)率達58%，而在水-緩沖液體系中進行時，產(chǎn)率僅為 30% (Biotechnology and bioengineering, 2006,95 (6) :1093_1100)。然而，尚未見以離子液體作共溶劑強化酶促合成異槲皮苷的報道。以緩沖水溶液為介質的傳統(tǒng)反應體系中，蘆丁的溶解度低，且酶促反應效率差。本專利中，在傳統(tǒng)的水溶液反應體系中加入離子液體，有利于提高底物溶解度，提高酶促反應效率，且操作簡便，對環(huán)境友好。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術問題針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，該方法可大大地提高了酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應效率。技術方案離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，包括橙皮苷酶或柚皮苷酶水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系，該反應體系中包括以磷酸氫二鈉-朽1檬酸緩 沖液配制蘆丁母液，以及橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，在該反應體系中含有離子液體，所述離子液體由陽離子和陰離子配合而成，陽離子類型為[Emim]、[Bmim]、[TOMA]、[Hmim]、[Nmim]或[EMPY]，陰離子類型為[BF4]、[PF6]、[Tf2N]、[HSO4]、[Tf0]或[C4F9SO3]，陰陽離子比例為I 1，蘆丁母液與離子液體混合后蘆丁的濃度為0. 26-0. 97g / L，pH為3-10，反應體系中按體積比加入5-50%的離子液體、45-90%的蘆丁母液和5-45%的橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，反應溫度范圍為20-60°C，振蕩轉速為50-300r / min，反應時間范圍為l_40h。緩沖液配制的蘆丁母液與離子液體混合后蘆丁的濃度為0. 72g / L0緩沖液配制的蘆丁母液與離子液體混合后的pH為5。反應體系中按體積比加入10%的離子液體、72%的蘆丁母液和18%的橙皮苷酶液。反應體系的反應溫度范圍為40°C。反應體系的振蕩轉速為120r / min。反應體系的反應時間范圍為7h。反應結束后HPLC檢測表明，離子液體共溶劑體系中異槲皮苷的得率要高于相同反應條件下緩沖液體系的得率。有益效果在離子液體共溶劑體系中酶催化水解蘆丁制備異槲皮苷，反應速率增大，產(chǎn)物得率比傳統(tǒng)水溶液體系要高，因此，離子液體共溶劑體系為異槲皮苷的生產(chǎn)提供了新的反應介質。該方法操作簡單，反應條件溫和，對環(huán)境友好，具有良好的應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明進行任何改動和修改，這些等價形式同樣落于本申請所述權利要求書所限定的范圍。本發(fā)明實施例中使用HPLC法同時檢測蘆丁和異槲皮苷，色譜條件:Alltima C18(250X4. 6mm，5 μ m)，流動相0. 02%磷酸-乙腈(80 20，V / V);檢測波長360nm ;流速1. OmL / min ;進樣量:20 μ L。使用HPLC法檢測槲皮素，色譜條件=Alltima C18C250X4.6_，5μπι)，流動相0. 5mol / LpH4. O醋酸胺緩沖液-乙腈(73 27, V / V);檢測波長360nm ;流速1. OmL / min ;進樣量20 μ L。其中，蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率的計算方法如下
蘆丁轉化率=^^^^yxl00%
+ 初始蘆丁量
異槲皮苷摩爾麵 初始原料蘆丁的摩爾量·
槲臟獅勝&越稱取O. Ig橙皮苷酶或柚皮苷酶，加水溶解，定容至10mL，得O. Olg / mL的橙皮苷酶液或柚皮苷酶液。實施例I以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH=3. O的O. 26g/L的蘆丁母液，以體積比5%的離子液體[Emim] [BF4]，陰陽離子比例為I : 1、90%的蘆丁母液和5%的橙皮苷酶液構成反應體系，在60°C條件下，300r / min振蕩反應lh。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為30^^23%和O.5%，與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 O. 8%。實施例2以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制PH=IO. O的O. 41g/L的蘆丁母液，以體積比50%的離子液體[Bmim] [BF4]，陰陽離子比例為I : I、45%的蘆丁母液和5%的橙皮苷酶液構成反應體系，在20°C條件下，50r / min振蕩反應40h。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為30%、15%和
I%，與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 2 %。實施例3以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH=5. O的O. 82g/L的蘆丁母液，以體積比10%的離子液體[Emim] [BF4]，陰陽離子比例為I : 1、72%的蘆丁母液和18%的橙皮苷酶液構成反應體系，在40°C條件下，120r / min振蕩反應7h。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為94^^96%和11%,與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 89%。實施例4以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH=7. O的O. 29g/L的蘆丁母液，以體積比50%的離子液體[Bmim] [Tf2N],陰陽離子比例為I : I、40%的蘆丁母液和10%的橙皮苷酶液構成反應體系，在40°C條件下，120r / min振蕩反應24h。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為98 %、53 %和2%，與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 5%。實施例5
以甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制pH=9. O的O. 97g/L的蘆丁母液，以體積比10%的離子液體[Bmim] [BF4]，陰陽離子比例為I : I、72%的蘆丁母液和18%的橙皮苷酶液構成反應體系，在40°C條件下，120r / min振蕩反應12h。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為98^^99%和2%,與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 60 %。實施例6以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH=7. O的O. 29g/L的蘆丁母液，以體積比5%的離子液體[Emim] [BF4]，陰陽離子比例為I : 1、50%的蘆丁 母液和45%的橙皮苷酶液構成反應體系，在30°C條件下，50r / min振蕩反應40h。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為82^^48%和10%，與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 3%。實施例7以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH=7. O的O. 29g/L的蘆丁母液，以體積比5%的離子液體[Emim] [BF4]，陰陽離子比例為I : I、50%的蘆丁母液和45%的柚皮苷酶液構成反應體系，在30°C條件下，120r / min振蕩反應40h。反應結束后，HPLC檢測蘆丁、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁轉化率、異槲皮苷摩爾得率和槲皮素摩爾得率分別為65%、37%和9%，與同樣條件下的緩沖液體系相比，異槲皮苷摩爾得率提高了 2%。
權利要求
1.離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，包括橙皮苷酶或柚皮苷酶水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系，該反應體系中包括以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制蘆丁母液，以及橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，其特征在于在該反應體系中含有離子液體，所述離子液體由陽離子和陰離子配合而成，陽離子類型為[Emim]、[Bmim]、[TOMA]、[Hmim]、[Nmim]或[EMPY]，陰離子類型為[BF4]、[PF6]、[Tf2N]、[HSO4]、[TfO]或[C4F9SO3]，陰陽離子比例為I 1，蘆丁母液與離子液體混合后蘆丁的濃度為O. 26-0. 97g / L，pH為3-10，反應體系中按體積比加入5-50%的離子液體、45-90%的蘆丁母液和5-45%的橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，反應溫度范圍為20-60°C，振蕩轉速為50-300r / min，反應時間范圍為l_40h。
2.根據(jù)權利要求I所述的離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于緩沖液配制的蘆丁母液與離子液體混合后蘆丁的濃度為O. 72g / L0
3.根據(jù)權利要求I所述的離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于緩沖液配制的蘆丁母液與離子液體混合后的pH為5。
4.根據(jù)權利要求I所述的離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于反應體系中按體積比加入10%的離子液體、72%的蘆丁母液和18%的橙皮苷酶液。
5.根據(jù)權利要求I所述的離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于反應體系的反應溫度范圍為40°C。
6.根據(jù)權利要求I所述的離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于反應體系的振蕩轉速為120r / min。
7.根據(jù)權利要求I所述的離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于反應體系的反應時間范圍為7h。
全文摘要
離子液體共溶劑效應強化酶促合成異槲皮苷的方法，包括橙皮苷酶或柚皮苷酶水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系，該反應體系中包括以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制蘆丁母液，以及橙皮苷酶液或柚皮苷酶液，在該反應體系中含有離子液體，所述離子液體由陽離子和陰離子配合而成。在離子液體共溶劑體系中酶催化水解蘆丁制備異槲皮苷，反應速率增大，產(chǎn)物得率比傳統(tǒng)水溶液體系要高，因此，離子液體共溶劑體系為異槲皮苷的生產(chǎn)提供了新的反應介質。該方法操作簡單，反應條件溫和，對環(huán)境友好，具有良好的應用前景。
文檔編號C12P17/06GK102876746SQ20121038328
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權日2012年10月11日
發(fā)明者王俊, 吳福安, 孫國霞 申請人:江蘇科技大學