專利名稱：用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明屬于有機(jī)化合物的生物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種用來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的ガ-葡萄糖苷酶程序升溫催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法。
背景技術(shù)：
甜菊苷(13-[(2-0-ガ-D-Glucopyranosyl-ガ-D-glucopyranosyl) oxy]kaur-16-en_18 -oic acid β -D-glucopyranosyl ester, stevioside,以 F丨荀禰 Stノ 是從甜葉菊{(diào)Stevia rebaudiana Bertoni)中提取出的四環(huán)ニ職類化合物,是ー種具有后苦潘味的甜味劑。St分子中含有三種糖苷鍵，經(jīng)水解可以得到甜菊醇、異甜菊醇、甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、懸鉤子苷或者其混合物；水解產(chǎn)物的各組分含量取決于水解條件例如用無機(jī) 堿催化水解St得到甜菊雙糖苷(SharipovaR, et al, 2009),用無機(jī)酸催化水解St則得到甜菊醇和異甜菊醇的混合物(專利號(hào)200910025817. 3)。例如張大永等通過化學(xué)法兩步制備甜菊醇，首先St經(jīng)高碘酸鈉或四醋酸鉛氧化，然后經(jīng)堿水解、柱層析純化后得到甜菊醇(專利號(hào)200810242967. 5)。Avent等指出酸性水解St除得到甜菊醇和異甜菊醇以夕卜，還有其他兩種同分異構(gòu)體(Avent A G, et al, 1990)。用同種酶催化水解St也可能得到不同產(chǎn)物。因而如果通過利用酶的高區(qū)域選擇性酶催化方法水解St，可以ー步直接獲得高品質(zhì)單一水解產(chǎn)物，同時(shí)還可以通過改變水解反應(yīng)條件調(diào)控產(chǎn)品組成，Milagre等指出在pH 4. O下，胰酶(Pancreatin)催化St水解反應(yīng)的產(chǎn)物為異甜菊醇；而在pH 7. O下，產(chǎn)物為甜菊醇(Milagre HMS, et al, 2009)。酶催化雖然優(yōu)點(diǎn)眾多，但熱穩(wěn)定性差成為酶使用過程中不可回避的問題。通?？梢酝ㄟ^外加穩(wěn)定劑，固定化等途徑來提高熱穩(wěn)定性。來源于黑曲霉的ガ-葡萄糖苷酶在75°C下會(huì)較快失活，但同時(shí)又在70-75 °C下具有最高催化水解效率。因此本發(fā)明采用程序升溫反應(yīng)的方式可以有效減少酶的熱失活并兼顧水解反應(yīng)速度，而且避免固定化酶與析出的產(chǎn)物混為一體，減少純化的困難，提高來源干#廣霉的ガ-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性并有效縮短完成水解反應(yīng)的時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種用β -葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法。本發(fā)明用篩選出的來源于黑曲霉的ガ-葡萄糖苷酶，水解St制備得到甜菊醇；通過程序升溫反應(yīng)，降低酶的熱失活。生產(chǎn)過程綠色環(huán)保，催化效率高，產(chǎn)品分離純化簡(jiǎn)單，純度高。來源于黑曲霉的ガ-葡萄糖苷酶催化甜菊苷制備甜菊醇的反應(yīng)方程式如下
權(quán)利要求
1.一種用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法，其特征是以甜菊苷或者含有甜菊苷的甜葉菊提取物為底物，將其用去離子水或緩沖液配制成150-300 g/L的反應(yīng)液；55 0C下恒溫0. 5 h后加入上述3 -葡萄糖苷酶，同溫下反應(yīng)2-6 h ;然后升溫至70-75°C下反應(yīng)至甜菊苷轉(zhuǎn)化率不再升高；甜菊苷水解成甜菊醇從反應(yīng)液中析出，而其他甜葉菊提取物的成分沒有或很少反應(yīng)；對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，用水洗滌濾渣，再用20%甲醇水溶液重結(jié)晶濾渣即可得到甜菊醇產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法，其特征是，所說的甜菊苷是指具有如下結(jié)構(gòu)的甜菊苷
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用J3-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法，其特征是所說的緩沖液為50 mM的pH 4. 0-5. 4的醋酸緩沖液或pH 6. 0磷酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法，其特征是所說的葡萄糖苷酶來源于黑曲霉，其形態(tài)是酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法，其特征是所述葡萄糖苷酶催的添加量為500-1000U/g甜菊苷。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制備甜菊醇的方法，屬于有機(jī)化合物的生物合成技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶為催化劑，程序升溫下催化水解從單一甜菊苷或甜葉菊提取物中的甜菊苷來制備甜菊醇，具有轉(zhuǎn)化率高、選擇性高、分離簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)；通過程序升溫反應(yīng)來降低酶活損失，可提高酶的利用率。本發(fā)明提供了一種高效、環(huán)境友好的制備甜菊醇的新方法。
文檔編號(hào)C12P15/00GK102827891SQ20121035246
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者夏詠梅, 方云, 萬會(huì)達(dá) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)