專利名稱：一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，屬于食品精深加工技術(shù)和功能性食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶水解得到的肽類物質(zhì)具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血壓、降血糖、提高免疫力等?；钚噪牡纳锘钚砸话愀哂诎被?，其活性強(qiáng)弱主要與分子量的大小、氨基酸的組成和序列有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的水解度越高，活性肽的分子量越低，生物活性越強(qiáng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)酶解法制備的肽類可表現(xiàn)很好的體外活性，但是在體內(nèi)卻活性很低甚至沒有活性，研究認(rèn)為這可能是活性肽在活體內(nèi)經(jīng)腸胃消化后被降解，從而失去其原有的生物活性。
本實(shí)驗(yàn)室建立了人體全仿生消化模型來(lái)評(píng)價(jià)食品中某物質(zhì)的生物可利用性，得到啟示可利用人體全仿生消化模型法來(lái)水解蛋白質(zhì)，從該蛋白水解液中分離制備的活性肽分子量大小適中，生理活性高，具有較好的抗體內(nèi)水解性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，該方法是一種制備高活性、高抗水解性的活性肽的體外模型法；主要是建立人體口、胃和腸的全仿生消化模型，來(lái)仿生消化蛋白質(zhì)，制備高生物活性肽類，與動(dòng)物模型相比，建立體外全仿生消化模型來(lái)制備活性肽，更為可靠、簡(jiǎn)便和易行。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)以上目的，采用的技術(shù)方案如下
以來(lái)源于植物、動(dòng)物或菌類的蛋白質(zhì)為原料，模仿蛋白質(zhì)進(jìn)入人體所經(jīng)歷的水解過(guò)程，即建立全仿生消化系統(tǒng)(包括唾液、胃液和十二指腸液三個(gè)過(guò)程)模型，然后將原料依次通過(guò)人體全仿生消化系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，每個(gè)過(guò)程料液比為I :5 I :50，保溫35 38°C，模擬咀嚼、腸胃蠕動(dòng)的頻率進(jìn)行攪拌，唾液水解過(guò)程進(jìn)行2 8min，胃液和腸液的水解過(guò)程分別進(jìn)行30 180min,腸液水解結(jié)束前30min,加入原料重量I 3%活性炭,水解結(jié)束后，升溫至85 100°C，保溫3 8min，鈍化酶活，冷卻，超濾，超濾液經(jīng)大孔樹脂分離純化后，制備高活性、高抗性的活性肽。本發(fā)明中人體唾液仿生消化系統(tǒng)中唾液的制備過(guò)程為在500ml O. 02mol/L的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液中，添加O. 05gNa0H、1.50 2. 00 g KC1、0. 2 g尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸和25 mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為6. 6 7. O。本發(fā)明中人體胃液仿生消化系統(tǒng)中胃液的制備過(guò)程為在500ml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中添加O. 5 g CaCl2、0. 6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH 為 I. 2 2. O。本發(fā)明中人體十二指腸仿生消化系統(tǒng)中十二指腸液的制備過(guò)程為在500 ml 0.01mol/L NaHCO3-KH2PO^f 沖液或碳酸鹽緩沖液，添加 5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0· I g尿素、O. 2g CaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和I. 5 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為7. 8 8. 2。本發(fā)明中超濾的分子量范圍為2000 10000 Da。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)研究結(jié)果，本發(fā)明技術(shù)方案的提出基于下述原理
I)本技術(shù)方案基于食物中某成分在人體內(nèi)生物可利用性的概念(bioaccessibility ),即食物中某成分經(jīng)人體口、胃和腸消化后，能夠存在于消化液中的部分，才可能被人體吸收和利用。所以，體外模擬人體口、胃和腸的消化過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行消化后，存在于超濾液中的肽類即是可能被人體吸收利用的部分。這部分肽類是人體消化液消化得到的，被人體食用后也不會(huì)再被降解而失去原有的結(jié)構(gòu)，也就是具有體內(nèi)的抗消化性(即高抗性)。2)分子量范圍在2000 10000 Da范圍內(nèi)的肽類具有高的抗氧化活性，所以在分 離純化之前采用2000 10000 Da分子量范圍的超濾。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是提供了一種簡(jiǎn)便、易操作的制備活性高、穩(wěn)定性好的生物肽的方法。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例I :全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，具體操作如下
以市售花生籽仁蛋白質(zhì)20 g為原料，同時(shí)建立人體全仿生消化系統(tǒng)模型，該消化系統(tǒng)模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個(gè)過(guò)程，將原料依次通過(guò)人體全仿生消化系統(tǒng)進(jìn)行水解，每個(gè)過(guò)程料液比為I :5，38°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動(dòng)的頻率進(jìn)行攪拌(100r mirT1)，仿生唾液水解8min,仿生胃液水解90min,十二指腸液水解180min,在十二指腸液水解進(jìn)行到150min時(shí),加入蛋白質(zhì)重量I. 0%的活性碳,繼續(xù)水解30min,升溫至85 V,保溫8min,鈍化酶活，超濾過(guò)膜，分子量為10000 Da，超濾液通過(guò)NKA-9大孔樹脂進(jìn)行分離純化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制備過(guò)程為在IOOml O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液中，添加O. OIgNaOH,O. 3gKC1、0.04 g尿素、58 mg α-淀粉酶、3 mg尿酸和5 mg粘蛋白，混合均勻后,用HCl調(diào)整pH為 6.6 ;
胃液的制備過(guò)程為在IOOml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液中添加O. I g CaCl2'
O.12 g葡萄糖、O. 066 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、O. 2 g牛血清白蛋白、O. 5g胃蛋白酶和O. 6 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為I. 2 ;
十二指腸液的制備過(guò)程為在100 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4緩沖液，添加I gNaCUO. 01 g MgCl2^O. 02 g尿素、O. 04g CaCl2、0. 2 g牛血清白蛋白、I. 8 g胰酶和O. 3 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為7.8。通過(guò)本實(shí)施例方法制得的活性肽在羥自由基清除能力評(píng)價(jià)模型中的IC5tl值為380μ g/ml0
實(shí)施例2 :全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，具體操作如下以市售魚皮蛋白質(zhì)20 g為原料，同時(shí)建立人體全仿生消化系統(tǒng)模型，該消化系統(tǒng)模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個(gè)過(guò)程，將原料依次通過(guò)人體全仿生消化系統(tǒng)進(jìn)行水解，每個(gè)過(guò)程料液比為I :50，在35°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動(dòng)的頻率進(jìn)行攪拌(100r mirT1)，仿生唾液水解2min,仿生胃液水解30min,十二指腸液水解30min,十二指腸液水解開始時(shí),加入蛋白質(zhì)重量3%的活性炭，水解30min，升溫至100°C保溫3min，鈍化酶活，冷卻，超濾過(guò)膜，分子量為2000 Da，超濾液通過(guò)DA201-C大孔樹脂進(jìn)行分離純化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制備過(guò)程為在IOOOml O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液中，添加O. lgNaOH、4gKCl、0.4g尿素、580 mg α-淀粉酶、30 mg尿酸和50 mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整PH 為 7 ;
胃液的制備過(guò)程為在IOOOml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液中添加I g CaCl2U. 2g葡萄糖、O. 66g氨基葡萄糖鹽酸鹽、2 g牛血清白蛋白、5g胃蛋白酶和6g粘蛋白，混合均勻 后，用HCl調(diào)整pH為1.5 ;
十二指腸液的制備過(guò)程為在1000 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4緩沖液，添加10 gNaCUO. Ig MgCl2、O. 2g尿素、O. 4 g CaCl2、2g牛血清白蛋白、18 g胰酶和3g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為8。通過(guò)本實(shí)施例方法制得的活性肽在抑制ACE酶活性評(píng)價(jià)模型中的IC5tl值為422μ g/ml0
實(shí)施例3 :全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，具體操作如下
以提取自竹蓀的蛋白質(zhì)20 g為原料(采用水提鹽析法制備蛋白質(zhì))，同時(shí)建立人體全仿生消化系統(tǒng)模型，該消化系統(tǒng)模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個(gè)過(guò)程，將原料依次通過(guò)人體全仿生消化系統(tǒng)進(jìn)行水解，每個(gè)過(guò)程料液比為I :25，在37°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動(dòng)的頻率進(jìn)行攪拌(100r mirT1)，仿生唾液水解5min，仿生胃液水解90min，十二指腸液水解120min,在十二指腸液水解進(jìn)行到90min時(shí),加入蛋白質(zhì)重量I. 5%的活性碳,繼續(xù)水解30min,升溫至90°C保溫5min，鈍化酶活，超濾過(guò)膜，分子量為3000 Da,超濾液通過(guò)AB-8大孔樹脂進(jìn)行分離純化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制備過(guò)程為在500ml O. 02mol/L的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液中，添加
0.05gNa0HU.8 g KC1、0. 2 g尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸和25 mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為6.8 ;
胃液的制備過(guò)程為在500ml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液或甘氨酸_鹽酸緩沖液中添加O. 5 g CaCl2、0.6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為2.0 ;
十二指腸液的制備過(guò)程為在500 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4緩沖液或碳酸鹽緩沖液，添加5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0. I g尿素、O. 2 g CaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和
1.5 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為8. 2。通過(guò)本實(shí)施例方法制得的活性肽在羥自由基清除能力評(píng)價(jià)模型中的IC5tl值為110μ g/ml0
權(quán)利要求
1.一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于首先建立人體全仿生消化系統(tǒng)模型，該消化系統(tǒng)模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個(gè)過(guò)程，然后以來(lái)源于植物、動(dòng)物或菌類的蛋白質(zhì)為原料，并將該原料依次通過(guò)人體全仿生消化系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，每個(gè)過(guò)程料液比為I :5 I :50，在35 38°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動(dòng)的頻率進(jìn)行攪拌，唾液水解過(guò)程進(jìn)行2 8min，胃液和腸液的水解過(guò)程分別進(jìn)行30 180min，腸液水解結(jié)束前30min，加入原料重量I 3%的活性炭，水解結(jié)束后，升溫至85 100°C，保溫3 8min,鈍化酶活，冷卻，超濾，超濾液經(jīng)大孔樹脂分離純化后，得到高活性、高抗性的活性肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于 人體唾液仿生消化系統(tǒng)中唾液的制備過(guò)程為在500ml O. 02mol/L的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液中，添加 O. 05gNa0H、l. 50 2. 00 g KC1、0. 2 g 尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg 尿酸和 25mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為6. 6 7. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于人體胃液仿生消化系統(tǒng)中胃液的制備過(guò)程為在500ml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中添加O. 5 g CaCl2^O. 6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為I. 2 2. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于人體十二指腸仿生消化系統(tǒng)中十二指腸液的制備過(guò)程為在500 ml O. 01 mol/LNaHCO3-KH2POjl沖液或碳酸鹽緩沖液，添加 5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0. I g 尿素、O. 2 gCaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和I. 5 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調(diào)整pH為7. 8 8. 2。
5.根據(jù)權(quán)利I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于超濾的分子量范圍為2000 10000 Da。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種仿生消化模型法制備活性肽的制備方法，以來(lái)源于植物、動(dòng)物或菌類的蛋白質(zhì)為原料，以全仿生消化系統(tǒng)，包括唾液、胃液和十二指腸液，進(jìn)行水解，水解液通過(guò)超濾過(guò)膜，并進(jìn)一步通過(guò)大孔樹脂進(jìn)行分離純化后，制備高活性、高抗性的活性肽，該方法簡(jiǎn)單易操作。
文檔編號(hào)A23J3/30GK102823715SQ20121034713
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者莊永亮, 張玉鋒, 劉蒙蒙, 孫麗平 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)