專利名稱：海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)和擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋魚類線粒體基因組研究領(lǐng)域，具體涉及一種高效擴(kuò)增多種海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)和擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
魚類線粒體DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)呈共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括一條輕鏈及一條重鏈，是細(xì)胞核外相對獨(dú)立的復(fù)制單位。相比于核DNA，魚類線粒體DNA具有拷貝數(shù)多、分子結(jié)構(gòu)簡單、編碼效率高、進(jìn)化速度快、母系遺傳及不同區(qū)域存在不同進(jìn)化速率等 特點(diǎn)。由于魚類線粒體DNA所具有的這些特點(diǎn)，使其成為魚類分子群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護(hù)生物學(xué)等研究領(lǐng)域的重要分子標(biāo)記。與其他脊椎動(dòng)物類似，魚類線粒體DNA由13個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因(12S rRNA及16S rRNA)共37個(gè)編碼基因及一段主要的非編碼控制區(qū)組成。12S rRNA作為編碼線粒體中一種核糖體RNA的基因，與線粒體DNA上其它基因相比，在進(jìn)化上較為保守，但種間變異度較大，是進(jìn)行魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)評估、相似種類及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等研究領(lǐng)域的重要遺傳標(biāo)記，特別在研究魚類系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系中，12S rRNA基因廣泛地被應(yīng)用于種、屬、科、目不同分類階元，是一種理想的分子
T 己 O目前，利用線粒體12SrRNA基因序列作為分子標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用到魚類分子群體遺傳學(xué)及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等領(lǐng)域，然而卻缺乏擴(kuò)增魚類線粒體12S rRNA基因的通用引物，給相應(yīng)的研究帶了一定的困難。國內(nèi)外關(guān)于12S rRNA通用引物的報(bào)道主要有Springer等(MoI. Biol. EvoI, 1995，12: 1138-1150)設(shè)計(jì)的針對哺乳動(dòng)物線粒體12S rRNA基因引物及 Wang 等(Zoological Studies, 2000, 39: 61-66)設(shè)計(jì)的脊椎動(dòng)物線粒體 12S rRNA基因通用引物。然而設(shè)計(jì)模板序列的選取、設(shè)計(jì)方法的不同以及通用引物自身擴(kuò)增能力的局限性，利用已報(bào)道的通用引物擴(kuò)增以蝦虎魚類及石首魚類為主的多種海洋魚類均存在著一定的不穩(wěn)定性，因此設(shè)計(jì)新的針對魚類線粒體12S rRNA基因通用引物，同已報(bào)道的引物進(jìn)行互補(bǔ)，對于有效獲得絕大多海洋數(shù)魚類線粒體12S rRNA基因序列是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明旨在提供一對可高效特異擴(kuò)增多種海洋魚類線粒體12S rRNA基因的單鏈寡核苷酸引物，從而為快速有效獲取魚類線粒體12SrRNA基因序列以進(jìn)行種類鑒定、種質(zhì)資源調(diào)查及系統(tǒng)進(jìn)化研究提供一個(gè)有力工具。本發(fā)明的目的還在于提供所述海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，以及利用所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物對海洋魚類線粒體12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案
海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的輕鏈引物Marinefish-12SrRNA-F (SEQ ID No. I所示)有22個(gè)堿基ACTAAAGCATAACACTGAAGAT,位于 tRNA-Phe 基因上；重鏈引物 Marinefish_12SrRNA-R (SEQID No. 2 所示)有 22 個(gè)堿基TTCATTTCTCTTTCAGCTTTCC，位于 16S rRNA 基因上。本發(fā)明所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物對在東海海域采集的46種海洋魚類，以及I種淡水魚類的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得片段長度為1200bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序及與GenBank中同源序列的比較，確認(rèn)為包含12S rRNA基因全序列、tRNA-Val全序列及長度為146bp左右的16S rRNA基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，體現(xiàn)出本發(fā)明較廣的擴(kuò)增范圍與較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，從而為快速有效獲取海洋魚類線粒12S rRNA基因序列以進(jìn)行種類鑒定、種質(zhì)資源調(diào)查及魚類系統(tǒng)進(jìn)化研究提供一個(gè)有力工具。
作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物，其中所述的海洋魚類包括但不限于下述小黃魚、眼斑擬石首魚、白姑魚、黃姑魚、日本黃姑魚、黑鰓梅撞魚、棘頭梅撞魚、褐鯧鈾、尖頭黃鰭牙、中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、藍(lán)點(diǎn)深蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)刺蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、臺(tái)灣溝蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、龍頭魚、帶魚、鯔魚、鱖魚、青石斑魚、寶石石斑魚、褐牙鲆、橫帶髭鯛、斜帶髭鯛、黃鰭刺鯛、條石鯛、二長刺鯛、角木葉鰈、斑鰷、三線舌鰨、刺鯧、銀鯧、黑鯛、黃鯽、鳳鱭。本發(fā)明所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物還可用于擴(kuò)增的淡水魚類包括但并不限于鯽魚。本發(fā)明還提供了上述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，即登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)搜索已測定的海洋魚類線粒體基因組的tRNA-Phe和16S rRNA基因序列，經(jīng)同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5. O軟件設(shè)計(jì)出海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物。所用的PremierPrimer5. O 軟件在生物軟件網(wǎng) http://www. bio-soft, net/ 下載。本發(fā)明還提供了一種對海洋魚類線粒體12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其是采用上述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物對待測樣品的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對海洋魚類線粒體12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中PCR擴(kuò)增的條件為95 °C預(yù)變性5min，然后95 °C變性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸75s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對海洋魚類線粒體12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為PCR反應(yīng)體系為25μ ，內(nèi)含dNTP (2. 5mM) 2μ 、IOXTaqDNA聚合酶Buffer 2. 5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各WUTaqDNA聚合酶(5U/ul) O. 2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17. 3μ 。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對海洋魚類線粒體12S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中所述的待測樣品來自包括但不限于下述小黃魚、眼斑擬石首魚、白姑魚、黃姑魚、日本黃姑魚、黑鰓梅撞魚、棘頭梅撞魚、褐鯧鈾、尖頭黃鰭牙、中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、藍(lán)點(diǎn)深蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)刺蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、臺(tái)灣溝蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、龍頭魚、帶魚、鯔魚、鱖魚、青石斑魚、寶石石斑魚、褐牙鲆、橫帶髭鯛、斜帶髭鯛、黃鰭刺鯛、條石鯛、二長刺鯛、角木葉鰈、斑鰷、三線舌鰨、刺鯧、銀鯧、黑鯛、黃鯽、鳳鱭、鯽魚。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明提供的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物，可以高效特異性地?cái)U(kuò)增多種海洋魚類線粒體12S rRNA基因，能應(yīng)用于魚類不同分類階元系統(tǒng)進(jìn)化的分析研究，從而為魚類種類鑒定、種質(zhì)資源調(diào)查及系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了一個(gè)有力工具。同時(shí)本發(fā)明所述通用引物及其設(shè)計(jì)方法也可作為通用引物PCR擴(kuò)增原理及關(guān)鍵參數(shù)研究的具體實(shí)例，促進(jìn)本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的前進(jìn)發(fā)展，因而具備重要發(fā)明價(jià)值和理論意義。


圖I為本發(fā)明海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物用以擴(kuò)增不同魚類線粒體 12S rRNA基因的電泳圖譜。其中M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，1_47 :依次為小黃魚、眼斑擬石首魚、白姑魚、黃姑魚、日本黃姑魚、黑鰓梅撞魚、棘頭梅撞魚、褐鯧鈾、尖頭黃鰭牙、中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、藍(lán)點(diǎn)深蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)刺蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、臺(tái)灣溝蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、龍頭魚、帶魚、鯔魚、鱖魚、青石斑魚、寶石石斑魚、褐牙鲆、橫帶髭鯛、斜帶髭鯛、黃鰭刺鯛、條石鯛、二長刺鯛、角木葉鰈、斑鰷、三線舌鰨、刺鯧、銀鯧、黑鯛、黃鯽、鳳鱭、鯽魚。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。主要材料、試劑和儀器設(shè)備
軟件及序列資源Premier Primer5. O引物設(shè)計(jì)軟件(下載自生物軟件網(wǎng)http://www. bio-soft, net/),海水魚類線粒體基因組序列資源(下載自NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/),序列分析軟件MEGA5. 0(下載自生物軟件網(wǎng) http: //www.bio-soft, net/)。PCR擴(kuò)增檢測相關(guān)試劑儀器海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，北京)，常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)(Thermo)，Bio-Rad C1000TMThermal Cycler擴(kuò)增儀器(Bio-Rad，美國)，微量移液器(Enppdorf，德國)，96孔PCR板(Axygen), dNTP (TIANGEN，北京)，10 X TaqDNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN，北京)，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN，北京)，滅菌雙蒸水，DL2000 DNA marker (TIANGEN,北京)，瓊脂糖(Biowest，香港)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一)，凝膠成像儀(Bio-Rad⑶2000，美國)?？寺y序相關(guān)試劑儀器高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO，日本)，加氨芐(Amp)抗生素的滅菌LB培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)平皿(上海生工)，超凈工作臺(tái)(SW — CJ一IG型，名牌之星，中國)，恒溫水浴鍋(上海精宏)，DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)，Amp抗生素(上海生工)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(上海生工)，異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(上海生工)，pGEM-T載體(Promega，美國)，恒溫培養(yǎng)箱(PH070A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，恒溫振蕩搖床(培英，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)自動(dòng)DNA測序儀(ABI 3730型，美國)。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。實(shí)施例I
I、海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和合成
登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索已測定的海洋魚類的線粒體基因組的 tRNA-Phe和16S rRNA基因序列，將序列載入到分析軟件MEGA5. O中，利用ClustalW算法進(jìn)行多序列對位比對分析，找到保守序列，將所找到的保守序列載入到Premier Primer5. O軟件在手動(dòng)設(shè)計(jì)模式下(即在manual選項(xiàng)下選擇Low，具體參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置)設(shè)計(jì)出海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物其中輕鏈引物Marinefish_12SrRNA_F (SEQ IDNo. I所示)有22個(gè)堿基ACTAAAGCATAACACTGAAGAT，位于tRNA-Phe基因上；重鏈引物Marinefish-12SrRNA-R (SEQ ID No. 2 所示)有 22 個(gè)堿基TTCATTTCTCTTTCAGCTTTCC，位于16S rRNA基因上。由南京金斯瑞生物科技有限公司根據(jù)發(fā)明人的要求合成符合SEQ ID No. I和SEQID No. I所示核苷酸序列的引物。2、對海洋魚類線粒12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增
本發(fā)明中的47個(gè)待測樣本均采集于我國的東海海域，來自46種海洋魚類和I種淡水魚類。其中擴(kuò)增的海洋魚類為以下種類小黃魚、眼斑擬石首魚、白姑魚、黃姑魚、日本黃姑魚、黑鰓梅撞魚、棘頭梅撞魚、褐鯧鈾、尖頭黃鰭牙、中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、藍(lán)點(diǎn)深蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)刺蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、臺(tái)灣溝蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、龍頭魚、帶魚、鯔魚、鱖魚、青石斑魚、寶石石斑魚、褐牙鲆、橫帶髭鯛、斜帶髭鯛、黃鰭刺鯛、條石鯛、二長刺鯛、角木葉鰈、斑鰷、三線舌鰨、刺鯧、銀鯧、黑鯛、黃鯽、鳳鱭；擴(kuò)增的淡水魚類為鯽魚一種。利用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取待測樣本的基因組DNA，方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，瓊脂糖電泳檢測提取的基因組DNA。用于擴(kuò)增多種海洋魚類線粒體12S rRNA基因的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下PCR 反應(yīng)體系為 25μ ，內(nèi)含 dNTP (TIANGEN)，10XTaqDNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN), ΙΟμΜ的輕鏈引物 Marinefish-12SrRNA-F 和 ΙΟμΜ 的重鏈引物 Marine_12SrRNA-R，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN)，含IOOng的上述提取的基因組DNA模板溶液，ddH20，其中
10 X TaqDNA 聚合酶 Buffer 2. 5μdNTP2μ
Marinefish-12SrRNA-F μ
Marinefish-12SrRNA-R μ
Template DNAIM-LddH2017. 3μ
Taq DNA 聚合酶O. 2μ 。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad C1000 Thermal Cycler儀器上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸75s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和純度。不同魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖I。運(yùn)用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增多數(shù)海洋魚類線粒12S rRNA基因，均獲得了單一的目的片段，產(chǎn)物大小約為1200 bp，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，其步驟為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物初步定量后，濃度達(dá)到約lOOng/μΙ的樣品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其進(jìn)行雙向測序，測序引物為 Marinef ish-12SrRNA-F (ΙΟμΜ)和 Marinef ish_12SrRNA_R (ΙΟμΜ)。經(jīng)測序及與GenBank中的同源序列進(jìn)行比對，確認(rèn)為包含12S rRNA基因全序列、tRNA-Val全序列及長度為146bp左右的16S rRNA基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。運(yùn)用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增重要經(jīng)濟(jì)海洋魚類小黃魚，普氏細(xì)刺蝦虎魚和青彈涂魚線?！んw12S rRNA基因，均獲得了單一的目的片段，產(chǎn)物大小約為1200 bp，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，上海)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物同pGEM_T載體(Promega公司，美國)連接，轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆并測序。其步驟為經(jīng)膠回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下與pGEM-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為載體 μ ，Τ4 DNA連接酶Iμ ，連接Buffer 5ul，PCR純化產(chǎn)物3μ1。連接反應(yīng)于冰上操作，反應(yīng)液置于4°C冰箱連接過夜(至少12小時(shí))。取DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN，北京)，熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用含有氨節(jié)抗生素(Amp)LB平板(使用前預(yù)先均勻涂布40ul 20mg/ml的5-溴-4-氯-3-口引哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal)和30ul O. 2mol/L的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG))進(jìn)行藍(lán)白篩選，并通過菌液PCR擴(kuò)增確認(rèn)挑取的陽性克隆子。陽性克隆子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行雙向直接測序。測序引物為SP6/T7。序列分析儀為ABI 3730全自動(dòng)DNA測序儀。經(jīng)測序及與GenBank中的同源序列進(jìn)行比對，確認(rèn)為包含線粒體12S rRNA基因全序列、tRNA-Val全序列及長度為146bp左右的16S rRNA基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)用性
本發(fā)明所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物對在東海海域采集的46種海洋魚類和舟山水產(chǎn)市場采集的I種淡水魚類的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得片段在1200bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序及與GenBank中同源序列的比較，確認(rèn)為包含線粒體12S rRNA基因全序列、tRNA-Val全序列及長度為146bp左右的16S rRNA基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，體現(xiàn)出本發(fā)明較廣的擴(kuò)增范圍與較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，因此，本發(fā)明所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物在海洋魚類種類鑒定、種質(zhì)資源調(diào)查及系統(tǒng)進(jìn)化研究領(lǐng)域可予以應(yīng)用。盡管發(fā)明人已經(jīng)對本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對于本領(lǐng)域一個(gè)熟練的技術(shù)人員來說，對上述實(shí)施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語用于對本發(fā)明技術(shù)方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.海洋魚類線粒體12SrRNA基因擴(kuò)增引物，其特征是由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID No. I所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的海洋魚類線粒體12SrRNA基因擴(kuò)增引物，其特征是所述的海洋魚類包括小黃魚、眼斑擬石首魚、白姑魚、黃姑魚、日本黃姑魚、黑鰓梅撞魚、棘頭梅撞魚、褐鯧鈾、尖頭黃鰭牙、中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、藍(lán)點(diǎn)深蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)刺蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、臺(tái)灣溝蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、龍頭魚、帶魚、鯔魚、鱖魚、青石斑魚、寶石石斑魚、褐牙鲆、橫帶髭鯛、斜帶髭鯛、黃鰭刺鯛、條石鯛、二長刺鯛、角木葉鰈、斑鰷、三線舌鰨、刺鯧、銀鯧、黑鯛、黃鯽、鳳鱭。
3.—種如權(quán)利要求I所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征是登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索已測定的海洋魚類線粒體基因組的tRNA-Phe和16S rRNA基因序列，經(jīng)同源性比較,找到保守序列，并利用Premier Primer5. O軟件設(shè)計(jì)出海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物。
4.一種對海洋魚類線粒體12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征是采用如權(quán)利要求I所述的海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物對待測樣品的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求4所述的一種對海洋魚類線粒體12SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征是PCR擴(kuò)增的條件為95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸75s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
6.如權(quán)利要求4所述的一種對海洋魚類線粒體12SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征是PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為PCR反應(yīng)體系為25μ ，內(nèi)含2. 5mM的dNTP 2μ 、10XTaqDNA聚合酶Buffer 2. 5μ 、10μΜ的輕鏈引物和重鏈引物各lPL、5U/ul的TaqDNA聚合酶O. 2μ ,含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17. 3μ 。
7.如權(quán)利要求4所述的一種對海洋魚類線粒體12SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征是所述的待測樣品來自包括小黃魚、眼斑擬石首魚、白姑魚、黃姑魚、日本黃姑魚、黑鰓梅撞魚、棘頭梅撞魚、褐鯧鈾、尖頭黃鰭牙、中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、藍(lán)點(diǎn)深蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)刺蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、臺(tái)灣溝蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、龍頭魚、帶魚、鯔魚、鱖魚、青石斑魚、寶石石斑魚、褐牙鲆、橫帶髭鯛、斜帶髭鯛、黃鰭刺鯛、條石鯛、二長刺鯛、角木葉鰈、斑鰷、三線舌鰨、刺鯧、銀鯧、黑鯛、黃鯽、鳳鱭的海洋魚類。
全文摘要
本發(fā)明屬于海洋魚類線粒體基因組研究領(lǐng)域，具體涉及一種海洋魚類線粒體12S rRNA基因擴(kuò)增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法和利用該擴(kuò)增引物對海洋魚類DNA溶液進(jìn)行擴(kuò)增的方法。本發(fā)明可以高效特異性地?cái)U(kuò)增多種海洋魚類線粒體12S rRNA基因，能應(yīng)用于魚類不同分類階元系統(tǒng)進(jìn)化的分析研究，從而為魚類種類鑒定、種質(zhì)資源調(diào)查及系統(tǒng)進(jìn)化研究提供一個(gè)有力工具。
文檔編號C12N15/10GK102912012SQ201210314978
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者徐田軍, 孫悅娜, 王日昕, 金逍逍 申請人:浙江海洋學(xué)院