專利名稱：一種檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的方法。
背景技術：
生物堿是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類由小分子含氮化合物組成的次生代謝產(chǎn)物，目前世界上已有超過12000種的生物堿類物質(zhì)被分離鑒定。生物堿在煙草及其制品中有特殊的地位，它不僅是煙草重要的品質(zhì)要素，而且規(guī)定了煙草作為一種商品的特質(zhì)。煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿是煙草中的4中主要生物堿。人們吸食煙草主要是吸食其中的煙堿(nicotine)，又名尼古丁。普通煙草屬于煙堿積累型，煙堿含量占總生物堿含量的90 95%，另外3種僅占生物堿總含量的5% 10%，降煙堿含量一般不超過總生物堿含 量的3. 5 %。普通煙草是純合雙隱性基因型(ctctcscs)，不具有煙堿去甲基能力。但在栽培品種的煙株群體中，一些植株會因為基因突變而具有煙堿去甲基能力，導致煙堿含量顯著降低，降煙堿含量則相應增加，甚至可以達到95 %以上。這種煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的性狀稱為煙堿轉(zhuǎn)化，具有煙堿轉(zhuǎn)化能力的煙株稱為轉(zhuǎn)化株(converter)。降煙堿含量的升高會直接影響煙葉的香吃味品質(zhì)，導致烤煙調(diào)制后出現(xiàn)“櫻紅”現(xiàn)象且香味不佳。同時由于降煙堿易于在煙葉調(diào)制和調(diào)制后的陳化過程中發(fā)生氧化、亞硝化和?；壬磻?，形成許多有害成分，如麥斯明(myosmine)、?；禑焿A(acylnornicotines)和亞硝基降煙堿(NNN)等，因此降煙堿含量的升高對人體健康也存在不利影響。控制較低水平的降煙堿不僅是因為它作為許多有害成分的前體物質(zhì)對人體具有潛在的致癌性，還因為降煙堿本身對人體的健康也具有負面影響。降煙堿可以導致蛋白質(zhì)的異常糖基化，而且還可同許多常用的類固醇藥物(如強的松)發(fā)生共價反應，從而改變這類藥物的藥效和毒理。因此，及時剔除煙草群體中的轉(zhuǎn)化株從而控制較低水平的降煙堿含量成為國際煙草工業(yè)界和學術界關注的熱點問題之一。目前檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化水平的方法主要是通過氣相色譜法(GC)和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)檢測其生物堿組分與含量，進而計算煙堿轉(zhuǎn)化水平。雖然該方法穩(wěn)定性、可操作性都比較好，但該方法通常僅能分析采收后的成熟煙葉或調(diào)制后的煙葉，且采收后需要一定的處理，較為耗時，無法在整個生育期動態(tài)了解不同品種煙葉及同一品種的不同群體內(nèi)的煙堿轉(zhuǎn)化水平，進而無法及時地將不良轉(zhuǎn)化株淘汰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的方法，利用該方法可以簡便快速檢測同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間煙堿轉(zhuǎn)化相對水平。
一種檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的方法，包括如下步驟(I)收集同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片；(2)分別提取所述葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(3)針對煙堿轉(zhuǎn)化相關基因設計特異性引物，以所述cDNA為模板，利用所述特異性引物進行實時熒光定量PCR，得到各自的Ct值；(4)根據(jù)所述Ct值，利用標準曲線計算得到各cDNA中煙堿轉(zhuǎn)化相關基因的模板量，判斷同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間的煙堿轉(zhuǎn)化相對水平；所述特異性引物為 上游引物5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；下游引物5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’ ；所述煙堿轉(zhuǎn)化相關基因為煙堿去甲基化酶基因CYP82E4，其全長cDNA核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。在檢測同一煙草品種不同部位或不同煙草品種的葉片煙堿轉(zhuǎn)化相對水平時，一般選用成熟期葉片。煙堿去甲基化酶基因CYP82E4是CYP82E2基因家族的成員，介導煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化。該基因家族尤其是煙堿去甲基化酶基因CYP82E4在煙草轉(zhuǎn)化株中的轉(zhuǎn)錄水平普遍高于非轉(zhuǎn)化株，使用RNAi干擾技術抑制該基因的表達，可以有效降低高降煙堿含量煙草在煙草轉(zhuǎn)化株的比例。因此，針對該基因設計方法，能準確靈敏地檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平。本發(fā)明實時熒光定量PCR所擴增的并不是煙堿轉(zhuǎn)化相關基因的全序列，而僅僅是其中的某一片段，其堿基序列如SEQ ID No.4所示。逆轉(zhuǎn)錄過程中，各組所取RNA的體積及濃度是相同的，通過計算煙堿轉(zhuǎn)化相關基因的模板量(濃度)，就可以得到該基因的表達水平。所述實時熒光定量PCR采用SYBR Green I熒光嵌合法。所述實時熒光定量PCR的擴增體系為20 μ L，其中Takara 2X SYBR Premix EXTaq 10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 5 μ L、cDNA模板2 μ L、滅菌蒸懼水7 μ L。所述實時熒光定量PCR的反應程序為94°C預變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s, 72°C延伸 50s, 35 個循環(huán)；72°C延伸 5min。所述標準曲線的制備方法為(I)制備一組濃度呈梯度分布的標準品；(2)以所述標準品為模板，利用所述引物，進行實時熒光定量PCR，記錄Ct值；(3)繪制得到標準曲線。所述標準品為含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長cDNA核苷酸序列的重組載體懸液，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細胞懸液。所述標準品的制備方法為(I)提取煙葉總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，進行PCR擴增獲得目的片段；(3)將所述目的片段連入T載體，獲得重組載體。所述PCR擴增所使用的引物為
上游引物為5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ ；下游引物為5’ -TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3 ’。所述總RNA的質(zhì)量至關重要,應采用高品質(zhì)的試劑盒或試劑進行提取,如QiagenRNeasy Plant Mini kit 試劑盒。由于RNA易降解且雜質(zhì)難以去除，因此要測定所提取RNA的純度。RNA純品的OD26tl/OD280比值為2. O，若該比值較低，說明有蛋白或酚污染；若該比值太高，說明RNA有不同程度的降解。一般0D26Q/0D28Q比值為I. 8-2. O的RNA可用。PCR擴增煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長cDNA，是用于構建重組載體；而實時熒光定量PCR是為了檢測該基因的表達量，因此在擴增時不需全序列擴增，但選用引物應具有更好的特異性。
本發(fā)明采用SYBR Green I熒光嵌合法進行實時熒光定量PCR，是基于該方法具有以下優(yōu)點對DNA模板無選擇性，適用于任何DNA ;不必設計復雜探針，使用方便；非常靈敏；價格低廉。但正是由于SYBR Green I對DNA模板無選擇性，使之易與非特異的雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。因此，在實時熒光定量PCR反應結(jié)束后要作熔解曲線分析，判斷擴增產(chǎn)物是否為目標片段。若曲線只有單峰，且出峰位置是退火溫度，則無非特異性熒光，定量準確；若出現(xiàn)雜峰或出峰位置不是退火溫度，則有其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，定量不準確。實時熒光定量PCR中，log X。(模板量)與Ct值呈線性關系，通過已知模板量的標準品可作出標準曲線，根據(jù)各樣品的Ct值，就可計算出所對應的模板量，進而分析各樣品的煙堿轉(zhuǎn)化相對水平。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明所述檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平所采用的SYBR Green I熒光嵌合法精確度高、靈敏性強；而且相比于相對定量法，本發(fā)明采用標準品進行絕對定量，在分析同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片的煙堿轉(zhuǎn)化相對水平方面具有更大的優(yōu)勢。(2)本發(fā)明所述的方法取樣量少，與現(xiàn)有的檢測方法(GC法和GC-MS法)相比，不會對取樣煙株造成明顯傷害，且操作簡便、結(jié)果精確、重復性好。(3)現(xiàn)有檢測方法只能在煙葉采收后才能對其煙堿轉(zhuǎn)化水平進行分析，而本發(fā)明可以在整個生育期對不同煙葉樣品的煙堿轉(zhuǎn)化相對水平進行實時監(jiān)控，避免了現(xiàn)有檢測方法的時間限制，為研究人員與種植戶及時剔除不良轉(zhuǎn)化株開辟了一條新的有效途徑。


圖I為煙堿去甲基化酶基因CYP82E4cDNA全長常規(guī)PCR的凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，M為Takara DL2000DNAMarker, I為煙堿去甲基化酶基因CYP82E4cDNA全長擴增產(chǎn)物。圖2為重組質(zhì)粒標準品構建常規(guī)PCR驗證的凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，M為TakaraDL2000DNA Marker, 1-6為不同陽性克隆中的目的片段。圖3為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標準品實時熒光定量PCR的擴增曲線。圖4為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標準品實時熒光定量PCR的標準曲線。其中，橫坐標代表模板數(shù)的對數(shù)值，縱坐標代表Ct值。
圖5A為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標準品實時熒光定量PCR的熔解曲線。圖5B為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標準品實時熒光定量PCR的熔融峰。圖6為不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒標準品常規(guī)PCR的凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，M為 Takara IOObp DNA Marker, 1-7 依次為 I X 105、I X 106、I X 107、I X 108、I X 109、I X 1010、I X IO11拷貝/mL的重組質(zhì)粒標準品。
具體實施例方式實施例I檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的標準品的制備下面僅以含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長cDNA 的重組質(zhì)粒為例，闡明其檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的效果，其它含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長cDNA的全部或部分核苷酸序列的重組載體或含有該重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細胞檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的效果都與該標準品相同。(I)煙葉取樣以白肋煙B37為材料，選取其成熟期中部葉片2g，取好的鮮葉樣品用錫箔紙包好并標記，迅速放入裝有液氮的冰盒中保存，快速送往實驗室進行下一步工作。(2)總RNA提取、含量測定及反轉(zhuǎn)錄反應總RNA提取取上述錫箔紙中的煙葉樣品200mg,采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其總RNA,具體步驟如下將煙葉加液氮磨細，液氮揮發(fā)前轉(zhuǎn)入Eppendorf管并加450 μ L RLT提取緩沖液，振蕩后56°C溫浴3min ;將提取液轉(zhuǎn)入紫色柱，IOOOOg離心2min,濾液轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管，加225 μ L無水乙醇混勻；濾液再轉(zhuǎn)入粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加700 μ L Rffl于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加500 μ L RPE于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液，重復一次，空管離心2min ;將粉紅色柱插到新的Eppendorf管上，加30 μ L無RNase水，IOOOOg離心Imin ;提取好的RNA樣品置_80°C保存?？俁NA含量測定用核酸蛋白測定儀內(nèi)置的RNA測定程序讀取RNA含量為345. 8 μ g/mL、OD260/OD280值為I. 933，表明總RNA純度較好，備用。反轉(zhuǎn)錄反應采用Takara公司的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后備用。具體步驟如下反應體系為20 μ L，其中總 RNA 2 μ L、50pmol/μ L Oligo (dT) 18primerl μ L, IOmMdNTP Mixture 2· 5 μ L、RNase Inhibitor 20U、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 10U、5 XAMV Buffer 4μ L,DEPC H2O定容至20yL。室溫下放置lOmin，移入42°C恒溫槽中保溫I. 5h，在冰水中冷卻2min即可。將得到的cDNA稀釋10倍后備用。(3)標準品的制備以上述cDNA為模板，以下述引物對煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長cDNA序列進行常規(guī)PCR擴增，所述引物為正向引物序列5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ ；反向引物序列5，-TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3，。所述常規(guī)PCR擴增的具體步驟為I)目的基因的克隆和純化
PCR 反應體系為 50 μ L，其中5U/ μ L Takara LATaq O. 5 μ L、2. 5mMdNTP 8 μ L、LATaq Buffer (Mg2+Free) 5 μ L,25mM MgCl25 μ L、20 μ M 正反向引物各 I μ L、cDNA 模板 I μ L、滅菌蒸懼水28. 5 μ L0PCR 反應程序為94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 90s，30個循環(huán)；72°C延伸7min。取5 μ L PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖I所示。結(jié)果表明該擴增產(chǎn)物大小為1600bp左右，顯示該擴增產(chǎn)物為目的片段。取剩余的45 μ L PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳回收，利用Promega膠回收試劑盒(編號Α9281)進行目的片段的回收純化。回收純化后取5μ L進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明回收純化的效果較好，可用于T-A或其他雙酶切克隆。2) T-A克隆技術
a、反應將回收純化的目的片段和Takara pMD18_T simple Vector載體連接，連接體系為IOyL,其中目的片段2yL、pMD18-T simple Vector載體I μ L、高效連接液Solution I 5 μ UdH2O 2yL;4°C過夜連接。b、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化將10 μ L連接產(chǎn)物加入至IOOyL DH5 α感受態(tài)細胞中，冰上放置30min ;42°C加熱45s，再在冰中放置Imin ;加入890 μ L LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min ;在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，形成單菌落。3)陽性克隆的鑒定a、陽性克隆驗證在轉(zhuǎn)化后涂板的培養(yǎng)基上分別挑取16個白色單菌落至含有5mLLB (Amp+)液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)。取I μ L菌液為模板，采用步驟I)中的PCR體系與程序進行PCR擴增，驗證質(zhì)粒中是否轉(zhuǎn)入了 1600bp左右的目的條帶。驗證結(jié)果如圖2所示。將經(jīng)PCR證明為陽性克隆的菌液送測序，測序結(jié)果為1554bp，blast比對結(jié)果證明其為陽性重組質(zhì)粒，且該重組質(zhì)粒和GenBank中煙堿去甲基化酶基因CYP82E4mRNA序列(GenBank 登錄號DQ205656. I ；DQ131885. I ；DQ131886. I)具有 99% 以上的同源性，表明質(zhì)粒標準品構建成功。該重組質(zhì)粒中所承載的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。b、提取質(zhì)粒選擇含有目的片段的菌液，采用Axygen公司改進的SDS堿裂解法AxyPrep質(zhì)粒DNA試劑盒提取質(zhì)粒DNA。具體過程如下取3mL菌液,12000g離心Imin,盡棄上清；加入250 μ L SI緩沖液重懸浮細菌沉淀；加入250 μ L S2緩沖液，溫和并充分地混勻使菌體充分裂解；加入350 μ L S3緩沖液，溫和混勻，12000g離心IOmin ;吸取上清轉(zhuǎn)移到制備管中，12000g離心Imin,棄濾液；加入500 μ L Wl緩沖液，12000g離心Imin,棄濾液；加入700 μ L W2緩沖液，12000g離心Imin,棄濾液；在制備管中加入80 μ L去離子水，12000g離心Imin ;_20°C保存?zhèn)溆谩?4)重組質(zhì)粒標準品檢測I)重組質(zhì)粒的濃度測定和拷貝數(shù)計算取純化的質(zhì)粒標準品2 μ L，利用核酸蛋白測定儀測得其濃度為94.5 μ g/mL，且OD26tZOD28tl比值為I. 888，表明質(zhì)粒標準品純度較好。根據(jù)質(zhì)粒標準品濃度可計算其拷貝數(shù)，計算公式如下DNA的拷貝數(shù)=(DNA的質(zhì)量/DNA的摩爾質(zhì)量)X 6. 02 X IO23雙鏈DNA 中 Ibp = 660Da，則 DNA 的摩爾質(zhì)量=660DaX (2692+1554)bp。帶入上述公式，得出質(zhì)粒標準品的拷貝數(shù)為2. 030X IO13拷貝/mL。2)實時突光定量PCR檢測重組質(zhì)粒標準品的范圍將重組質(zhì)粒標準品進行10倍的倍比稀釋，各稀釋梯度為1X1011，
IXio10......I X IO1拷貝/mL。利用下述特異性引物進行實時熒光定量PCR檢測，該引物
的核苷酸序列為正向引物序列為5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；反向引物序列為5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’。采用SYBR Green I熒光嵌合法進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系為20 μ Lj 中Takara 2 X SYBR Premix EX Taq 10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 5 μ L、質(zhì)粒標準品 2 μ L、滅菌蒸餾水7 μ L。實時熒光定量PCR反應程序為94°C預變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，35個循環(huán)；72°C延伸5min ;55_95°C緩慢升溫，產(chǎn)生熔解曲線。擴增曲線如圖3所示，由圖可知實時熒光定量PCR檢測重組質(zhì)粒標準品的范圍為Ixio5-Ixio11 拷貝 /mL。3)實時熒光定量PCR檢測標準曲線的繪制取已知的7個倍比稀釋的重組質(zhì)粒標準品(I X IO11U X IO10U X IO9UX IO8,I X IO7,1 X 106、I X IO5拷貝/mL)，進行實時熒光定量PCR檢測標準曲線的繪制。每個稀釋梯度做3次重復，進行實時熒光定量PCR反應，反應體系和程序同實施例I步驟(4)-2)。標準曲線如圖4所示，質(zhì)粒標準品在I X IO5-I X IOltl拷貝/mL的范圍內(nèi)R2 = O. 9937，說明該體系線性較好；斜率為-4. 4208，說明該體系擴增效率較高。圖中結(jié)果為3次重復試驗的平均結(jié)果。4)實時熒光定量PCR檢測標準曲線的熔解曲線重組質(zhì)粒標準品的熔解曲線的測定方法同步驟(4)_2)。測定結(jié)果如圖5A和58所示，特異性反應的Tm值為81. 5±0.5°C，且曲線為單峰，說明未出現(xiàn)非特異性熒光，定量準確。5)常規(guī)PCR檢測重組質(zhì)粒標準品的范圍將稀釋梯度為I X IO5-I X IO11拷貝/mL的重組質(zhì)粒標準品進行常規(guī)PCR檢測。常規(guī)PCR 反應體系為 50 μ L，其中，5U/μ L Takara LA Taq O. 5μ L,2. 5mM dNTP8μ L.LA Taq Buffer (Mg2+ Free) 5 μ L、25mM MgCl2 5 μ L、20 μ M 正反向引物各 I μ L、重組質(zhì)粒標準品I μ L、滅菌蒸懼水28. 5 μ L0常規(guī)PCR反應程序為94°C預變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s, 30 個循環(huán)；72°C延伸 7min。取5 μ L PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖6所示，擴增產(chǎn)物大小在200-300bp之間，測序結(jié)果為238bp，通過blast比對后，證明其為重組質(zhì)粒標準品目的片段中的部分核苷酸片段，該核苷酸片段的序列如SEQ ID N0.4所示。實施例2檢測白肋煙野生型和突變型煙堿轉(zhuǎn)化相對水平以白肋煙B37和高煙堿轉(zhuǎn)化突變體HNC-I為材料，利用所述引物檢測其煙堿轉(zhuǎn)化相對水平，具體步驟如下(I)煙葉取樣
以白肋煙B37和高煙堿轉(zhuǎn)化突變體HNC-I為材料，分別選取其團棵期、旺長期和成熟期的中部葉片各2g，取好的鮮葉樣品用錫箔紙包好并標記，迅速放入裝有液氮的冰盒中保存，快速送往實驗室進行下一步工作。⑵總RNA提取、含量測定 及反轉(zhuǎn)錄反應總RNA提取取上述錫箔紙中的煙葉樣品200mg,采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其總RNA,具體步驟如下將煙葉加液氮磨細，液氮揮發(fā)前轉(zhuǎn)入Eppendorf管并加450 μ L RLT提取緩沖液，振蕩后56°C溫浴3min ;將提取液轉(zhuǎn)入紫色柱，IOOOOg離心2min,濾液轉(zhuǎn)入新Eppendorf管，加225 μ L無水乙醇混勻；濾液再轉(zhuǎn)入粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加700 μ L RWl于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液；加500 μ L RPE于粉紅色柱，8000g離心15s，棄濾液，重復一次，空管離心2min ;將粉紅色柱插到新Eppendorf管上,加30 μ L無RNase水，IOOOOg離心Imin ;提取好的總RNA樣品置_80°C保存。總RNA含量測定 總RNA用RNase-free處理水稀釋60倍，用核酸蛋白測定儀內(nèi)置的RNA測定程序讀取RNA的含量(表2)。表2白肋煙樣品RNA含量
權利要求
1.一種檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)收集同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片； (2)分別提取所述葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA； (3)針對煙堿轉(zhuǎn)化相關基因設計特異性引物，以所述cDNA為模板，利用所述特異性引物進行實時熒光定量PCR，得到各自的Ct值； (4)根據(jù)所述Ct值，利用標準曲線計算得到各cDNA中煙堿轉(zhuǎn)化相關基因的模板量，判斷同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間的煙堿轉(zhuǎn)化相對水平； 所述特異性引物為上游引物5’ -ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；下游引物5’ -GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’ ； 所述煙堿轉(zhuǎn)化相關基因為煙堿去甲基化酶基因CYP82E4，其全長cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR采用SYBRGreen I突光嵌合法。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的擴增體系為20 ii L，其中Takara 2X SYBR Premix EX Taq 10 ii L、10 ii M 正反向引物各 0. 5 ii L、cDNA 模板2 ii L、滅菌蒸懼水7 ii L。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應程序為94°C預變性3min ;94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸50s，35個循環(huán)；72°C延伸5min。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述標準曲線的制備方法為 (1)制備一組濃度呈梯度分布的標準品； (2)以所述標準品為模板，利用權利要求I所述的引物，進行實時熒光定量PCR，記錄Ct值； (3)繪制得到標準曲線； 所述標準品為含有煙堿去甲基化酶基因CYP82E4全長cDNA核苷酸序列的重組載體懸液，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細胞懸液。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述重組載體的制備方法為 (1)提取煙草葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA； (2)以所述cDNA為模板，進行PCR擴增獲得目的片段； (3)將所述目的片段連入T載體，獲得重組載體。
所述PCR擴增所使用的引物為 上游引物為5’ -ATGCTITCTCCCATAGAAGCC-3’ ； 下游引物為5’ -TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平的方法，包括(1)收集同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片；(2)分別提取所述葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(3)針對煙堿轉(zhuǎn)化相關基因設計特異性引物，以所述cDNA為模板，利用所述特異性引物進行實時熒光定量PCR，得到各自的Ct值；(4)根據(jù)所述Ct值，利用標準曲線計算得到各cDNA中煙堿轉(zhuǎn)化相關基因的模板量，判斷同一品種煙草不同時期或不同部位或不同品種煙草的葉片之間的煙堿轉(zhuǎn)化相對水平。本發(fā)明公開的方法不僅能對煙草煙堿轉(zhuǎn)化相對水平進行實時監(jiān)控，且準確度高，靈敏性強，能及時將不良煙草轉(zhuǎn)化株淘汰。
文檔編號C12Q1/68GK102796821SQ20121031505
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權日2012年8月30日
發(fā)明者儲國海, 周國俊, 孫勃, 黃芳芳, 林福呈, 楊軍, 張芬, 金立鋒 申請人:浙江中煙工業(yè)有限責任公司, 中國煙草總公司鄭州煙草研究院