專利名稱：一種抗cd3/抗cd133雙特異性抗體及該雙抗裝載的cik細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種雙特異性抗體，具體講，涉及ー種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體及該雙抗裝載的CIK細胞。
背景技術(shù)：
越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細胞在腫瘤免疫逃逸、抵抗放、化療和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要作用，因此治療腫瘤需要創(chuàng)建有效靶向殺滅腫瘤干細胞的新策略才有可能根治腫瘤，靶向腫瘤干細胞的免疫治療在單克隆抗體和干細胞疫苗研究方面已經(jīng)開展了積極的探索。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細胞特異性標志物非常稀少，而CD133則是目前所發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞中最常見的標志物之一，在腦瘤、白血病、黑色素瘤、腎癌、大腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌和卵巣癌等多種腫瘤干細胞中存在，它的高表達與腫瘤病人的低生存率密切相關(guān)。由此本發(fā)明選擇CD133作為針對CD133陽性腫瘤干細胞治療研究的新靶點，構(gòu)建了靶向⑶133靶點的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體。過繼免疫治療中，CIK作為新一代細胞所兼具的T淋巴細胞強大的殺瘤活性與NK細胞非MHC限制性殺瘤特征，在臨床取得了很大的進展，但是治療效果仍然有限，其原因是CIK細胞缺乏特異性靶向殺傷作用。本發(fā)明構(gòu)建了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細胞
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提出ー種抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體；本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出裝備有該雙抗的CIK細胞。為了完成本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及ー種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體，其特征在于，所述的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。本發(fā)明中抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟(I)將抗CD3的單克隆抗體溶解于Traut’ s試劑，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體；(2)CD133/1單克隆抗體溶于交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體；(3)將步驟(I)步驟(2)得到的交聯(lián)后的單克隆抗體混合，I 4°C下作用12 18小吋。本發(fā)明還涉及ー種抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細胞。該抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細胞的制備方法，包括以下步驟(I) CIK細胞的培養(yǎng)取健康外周靜脈血IOml，肝素抗凝，用生理鹽水I : I稀釋后，加至淋巴細胞分離液上層，離心收集單個核細胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2X106個/ml，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 24h，然后加入rhIL-1 a 100U/ml、鼠抗人CD3McAb50 ng/ml，rhIL-21000U/ml，每兩天添加 rhIL_21000U/ml，在培養(yǎng)第 14 天，檢查 CD3、CD4、CD8和CD56收獲CIK細胞；(2) CIK細胞表型的檢測調(diào)整培養(yǎng)0天和14天的CIK細胞濃度為5 X IO6個/ml，各取200 ill加入離心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標抗體及同型對照IgGl單抗各5 U 1，混勻，在4°C暗室反應(yīng)20 40min后，PBS洗滌I 3次，流式細胞儀檢測CIK細胞中CD3陽性細胞彡85%，CD3和CD8雙陽性細胞彡60%, CD3和CD56雙陽性細胞彡20% ；(3)抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載CIK細胞離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測的CIK細胞，PBS洗滌I 3次，按
IX 106CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟耿?/抗⑶133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置40 80分鐘，PBS洗滌I 3次。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進ー步的解釋和說明本發(fā)明提出并構(gòu)建了ー種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體；并將所構(gòu)建的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載到CIK細胞表面，使其雙抗體與CIK細胞融為一體發(fā)揮靶向殺傷作用，篩選出高表達CD133陽性細胞的人胰腺癌細胞株SW1990作為靶細胞，在體外和動物體內(nèi)對靶向治療高表達CD133人胰腺癌進行了實驗，實驗結(jié)果證實，與單純CIK細胞的治療比較，抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細胞能夠更有效地殺傷高表達⑶133陽性的人胰腺癌細胞。本發(fā)明所制備的裝載了雙抗的CIK細胞，通過雙功能抗體的橋聯(lián)和靶向結(jié)合作用，在腫瘤局部發(fā)揮抗體和CIK細胞的雙重靶向殺傷作用，有可能消滅包括CD133陽性腫瘤干細胞在內(nèi)的全部腫瘤細胞，從而有效地解決CIK細胞免疫治療不能消滅具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移種子-腫瘤干細胞的缺陷，本發(fā)明為高效靶向消滅腫瘤干細胞的新型免疫治療提供了新的方案，為臨床試驗研究奠定了基礎(chǔ)。由于直接作用于腫瘤干細胞的CTL細胞治療腫瘤的方法還沒有問世，而單純CIK細胞又不能靶向殺傷腫瘤干細胞，所以本發(fā)明利用單克隆抗體的靶向殺傷作用和CIK細胞所具有的非MHC限制性強大殺瘤活性的特性，成功構(gòu)建了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備CIK的新型抗腫瘤免疫效應(yīng)細胞，在體外和動物體內(nèi)開展了靶向治療高表達CD133胰腺癌的研究。通過用抗⑶133抗體對10種人腫瘤細胞株的⑶133抗原表達的篩查后，選擇了兩對配對腫瘤細胞株作為靶細胞ー對是高表達⑶133人胰腺癌細胞株SW1990和低表達⑶133的人胰腺癌細胞CAPAN-2配對，另ー對是高表達⑶133人肝癌細胞株H印-3B和低表達⑶133人肝癌細胞株HepG2配對，通過體外殺傷試驗的比較發(fā)現(xiàn)，在同一個效靶比濃度下，抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細胞對高表達⑶133靶細胞SW1990細胞和H印-3B細胞的殺瘤效果要明顯強于單純CIK細胞組，p < 0. 05。而在低表達⑶133靶細胞Capan2和H印G2細胞，抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細胞與單純CIK細胞之間殺瘤效果差異不顯著。通過用抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細胞治療高表達⑶133的胰腺癌細胞系SW1990制備的裸鼠皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細胞比單純CIK具有更強的抑制腫瘤生長的作用，p〈0. 05。以上實驗結(jié)果表明CIK細胞在裝備了抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體之后，CIK細胞不僅發(fā)揮廣譜直接殺傷腫瘤細胞的治療作用，而且利用雙功能抗體的橋聯(lián)作用將效應(yīng)細胞和高表達CD133的腫瘤靶細胞有機的結(jié)合到一起，形成殺傷組合體，發(fā)揮了抗體靶向打擊消滅CD133陽性的腫瘤干細胞的作用。雙抗體不僅將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍，而且可以模擬天然配體的作用，與細胞表面引發(fā)分子結(jié)合，激活效應(yīng)細胞，實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向性的殺傷，由于抗體對抗原的識別不需要抗原提呈及MHC的表達，因此CIK裝備特異性雙抗的治療方案不但能夠有效地解決腫瘤干細胞對宿主免疫監(jiān)視逃逸和耐藥性等影響療效的關(guān)鍵難題，而且能夠修補CIK細胞免疫治療不能消滅具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的種子ー腫瘤干細胞的缺陷。本發(fā)明的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細胞不僅可以靶向治療高表達⑶133胰腺癌，還可以有效抑制高表達⑶133的H印3B肝癌細胞，該結(jié)果與應(yīng)用⑶133單抗結(jié)合細胞毒藥物monomethyl auristatin F (MMAF)有效殺傷高表達⑶133Hep3B肝癌細 胞和KATO-III胃癌細胞的結(jié)果相一致。由此可知抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細胞不僅能夠打擊⑶133高表達的胰腺癌細胞，而且有可能對各種腫瘤中的表達⑶133的干細胞細胞亞群進行有效抑制。發(fā)明人對加入雙抗裝備CIK或單純CIK共同培養(yǎng)前后的高表達⑶133胰腺癌細胞系SW1990的基因芯片表達譜進行分析。通過熒光定量PCR證實雙抗裝備的CIK細胞能夠使SW1990癌細胞中的S100P基因明顯下調(diào)和STATl顯著上調(diào)。結(jié)果表明這些基因表達的改變與雙抗裝備CIK細胞的增效作用密切相關(guān)。本發(fā)明的雙抗裝備CIK細胞，在作用高表達⑶133胰腺癌細胞SW199024小時后，該細胞中S100P基因表達明顯下調(diào)，是未處理親本腫瘤細胞的0. 26倍，單純CIK組的0. 18倍(p〈0. 01)。由于該基因下調(diào)在單純CIK細胞與裝備了雙抗CIK的細胞之間差異顯著，因此抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的靶向殺傷作用與胰腺癌細胞中S100P基因水平顯著下調(diào)密切相關(guān)。S100P基因是調(diào)控細胞増殖周期的基因，近年來關(guān)于S100P在腫瘤組織中的異常表達受到重視，S100P在多種腫瘤組織中均有明顯的高表達水平，如胰腺癌、肺腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巣癌、宮頸癌等，并且與部分腫瘤的分期、預(yù)后、治療等有一定的相關(guān)性。S100P在大約90%的胰腺腫瘤中均有表達，通過SiRNA敲除胰腺癌中S100P的表達之后，論證了 S100P在體外有著促進腫瘤生長、延緩腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤遷移及侵襲的作用。用轉(zhuǎn)染了 S100P基因的胰腺癌細胞接種裸鼠，腫瘤生長5倍大于對照組；而敲除了S100P基因的腫瘤細胞接種裸鼠后，腫瘤體積不僅明顯小于對照組，而且出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的幾率也明顯減少。這些研究證明了 S100P與腫瘤細胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本發(fā)明證明靶向CD133陽性胰腺癌細胞的雙抗聯(lián)合CIK免疫靶向治療作用機理直接涉及到了與促進胰腺癌細胞生長、延緩凋亡、促進遷移及侵襲的關(guān)鍵基因S100P的分子機制，胰腺癌靶細胞中該基因的顯著下調(diào)與該方案抗腫瘤效果直接關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體裝備的CIK細胞對胰腺癌細胞的殺傷作用明顯增強，伴有IFN- y的分泌量増加，以雙抗裝備CIK組數(shù)值最高，三組間比較差異顯著。免疫效應(yīng)細胞通過分泌干擾素能夠在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)雙抗裝備CIK細胞不但對高表達CD133的胰腺癌和肝癌細胞有更強大的靶向殺傷作用，同時，當BsAb-CIK效應(yīng)細胞與腫瘤靶細胞相互作用吋，免疫效應(yīng)細胞能夠分泌更多的IFN- y，從而實現(xiàn)了 BsAb-CIK免疫細胞強力打擊腫瘤靶細胞的殺傷作用。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)經(jīng)BsAb-CIK效應(yīng)細胞作用的腫瘤靶細胞自身的STATl基因表達顯著上調(diào)，經(jīng)基因表達譜芯片分析和熒光定量PCR檢測證實，胰腺癌細胞經(jīng)單純CIK處理后，STATl基因表達顯著上調(diào)為11. 91倍，而雙特異性抗體裝備的CIK作用后的腫瘤細胞STATl基因表達顯著上調(diào)為17. 11倍，兩治療組差異顯著，p〈0. 05。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STATs是ー個轉(zhuǎn)錄因子家族，是對細胞增殖、存活和分化所必須的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細胞因子和生長因子的受體信號。STATl在細胞內(nèi)能夠有效地阻止乳腺上皮的増殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，對不同小鼠移植模型的研究驗證，無論是在ErbB2/HER2陽性或陰性小鼠模型和STATl-/-小鼠中都證實了 STATl具有抑制小鼠體內(nèi)腫瘤形成的作用，而且在floxed statl等位基因的小鼠進ー步證實了 STATl抑制腫瘤形成的作用是通過細胞自治實現(xiàn)的。因此目前認為STATl是ー個通用型的腫瘤抑制基因或抗癌基因。研究發(fā)現(xiàn)喪失STATl的腫瘤細胞會失去對干擾素 介導(dǎo)的生長抑制反應(yīng)，而且可能導(dǎo)致MHC表達下調(diào)，從而逃避CTL介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者細胞內(nèi)STATl激活的低水平與預(yù)后較差關(guān)系密切。而我們的發(fā)明證實了在BsAb-CIK的靶向殺傷作用是與腫瘤靶細胞自身STATl基因表達顯著上調(diào)是一致的。本發(fā)明從免疫細胞治療學(xué)的角度首次證實了 anti-⑶3/anti_CD133BsAb裝備CIK細胞強大靶向殺傷作用與CD133高表達胰腺癌靶細胞自身所發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化基因S100P基因明顯下調(diào)和statl抗癌基因的顯著上調(diào)的作用機制密切相關(guān)，從而使該治療得到更好的靶向治療效果。該方法不但適用于⑶133高表達的胰腺癌,而且也可能對其它高表達⑶133的腫瘤靶細胞具有療效，而且免疫效應(yīng)細胞分泌IFN-Y細胞因子水平和腫瘤靶細胞內(nèi)抗癌基因statl和S100P基因變化規(guī)律也可能作為監(jiān)測該項免疫細胞治療的有效指標，值得進ー步深入研究。本發(fā)明研究表明通過Anti-⑶133xAnti_⑶3BsAb裝備的CIK細胞能夠在體內(nèi)外有效的靶向殺傷高表達CD133的腫瘤細胞，為創(chuàng)建高效靶向消滅CD133陽性腫瘤干細胞的新型免疫治療策略與方案提供了重要科學(xué)論據(jù)，為深入探討增效殺瘤作用機制奠定了基礎(chǔ)。綜上，本發(fā)明的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細胞可應(yīng)用于制備治療靶向殺傷高表達CD133的癌細胞的制劑，還可應(yīng)用于制備治療靶向殺傷高表達CD133的腫瘤干細胞的制劑，還可應(yīng)用制備抑制腫瘤生長的制劑。本發(fā)明的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載的CIK細胞還可降低癌細胞中的S100P基因表達，増加癌細胞中的STATl基因表達的藥物中的應(yīng)用，癌細胞包括胰腺癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、膠質(zhì)瘤細胞、前列腺癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、卵巣癌細胞、宮頸癌細胞。


圖I為抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體產(chǎn)物8%非還原變性SDS-聚丙烯胺凝膠電泳圖；圖2為FACS檢測CIK細胞表型結(jié)果圖，培養(yǎng)第I天；圖3為FACS檢測CIK細胞表型結(jié)果圖，培養(yǎng)第14天；圖4為抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備CIK細胞熒光顯微鏡檢測結(jié)果；圖5為正常人的雙抗裝備的CIK細胞對SW1990細胞殺傷實驗結(jié)果圖6為腫瘤病人的雙抗裝備的CIK細胞對SW1990細胞殺傷實驗結(jié)果圖；圖7為正常人的雙抗裝備的CIK細胞對Capan-2殺傷實驗結(jié)果圖；圖8為正常人的雙抗裝備的CIK細胞對H印3B殺傷實驗結(jié)果圖；圖9為正常人的雙抗裝備的CIK細胞對HepG2殺傷實驗結(jié)果圖；圖10細胞殺傷實驗的細胞培養(yǎng)上清液IFN-gamma分泌的結(jié)果圖；圖11為裸鼠致瘤實驗的結(jié)果統(tǒng)計圖；圖12為雙抗裝備的CIK細胞治療對基因的熒光定量RT-PCR分析的結(jié)果圖，左圖為S100P、右圖為STATl0本發(fā)明的具體實施方式
僅限于對本發(fā)明進行進一歩的解釋和說明，并不對本發(fā)明 的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實施例方式主要試劑及儀器RPMI1640 購自 GIBCO 公司(Grand Island, NY)；胎牛血清購單克隆抗體購于Ortho Biotech公司，Tokyo, Japan鼠抗人CD133/1 (AC133)單克隆抗體購于 Miltenyi Biotech 公司,Bergisch Gladbach, Germany ；鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標抗體及同型對照IgGl購自BDpharmingen 公 ロ]；鼠抗人⑶133-PE抗體購自Miltenyi Biotec公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；細胞計數(shù)試劑盒(CellCounting Kit-8, CCK-8)購于 D0JIND0，WSTe 公司；人IFN- y ELISA 試劑盒購自 R & D pharmingen ；流式細胞儀購自R & D pharmingen o實施例I :雙特異性抗體的制備I.取鼠抗人⑶3單克隆抗體0KT3抗體(Img)溶于5倍摩爾濃度的交聯(lián)劑Traut’s試劑(2-iminothiolane HCl;Pierce, Rockford, IL) 500 u I,室溫下作用 I 小時；用 PD-10柱(Pharmacia, Uppsala, Sweden)過濾,移除未交聯(lián)的單克隆抗體，2.取鼠抗人⑶133/1單克隆抗體(Img)溶于4倍摩爾濃度的交聯(lián)劑Sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl4_(N_ma丄eimidomethyl)cyclohexane—l—carboxylate) 500 U I,至溫下作用I小時后，用F1D-IO柱(Pharmacia, Uppsala, Sweden)過濾,移除未交聯(lián)的單克隆抗體；3.將已交聯(lián)的0KT3和鼠抗人⑶133/1單抗混合后4°C過夜，制備得到抗⑶3/抗CD 133雙特異性抗體?？耿?/抗⑶133雙抗體蛋白產(chǎn)物通過8%非還原、變性SDS-聚丙烯胺凝膠電泳圖，考馬斯亮藍染色檢測。實驗結(jié)果如圖I所示；其中第I電泳帶為蛋白marker，2為IOug的0KT3單克隆抗體，3為IOug的⑶133/1單克隆抗體，4為30ug的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體。通過蛋白電泳檢測，證實抗⑶3/抗⑶133兩種抗體交聯(lián)的雙體蛋白條帶為300KD，而單體為150KD。蛋白定量用BCA(Pierce)試劑盒,按說明書要求操作,檢測雙抗的蛋白含量。
實施例2 :抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細胞I. CIK細胞的培養(yǎng)取健康志愿者外周靜脈血10ml，肝素抗凝，用生理鹽水I : I稀釋后，加至淋巴細胞分離液上層，離心收集單個核細胞(PBMC)，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2 X IO5個/ml，并加入IFN- y終濃度為1，000單位/mL，置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入rhIL-1 a終濃度為1000U/ml、鼠抗人CD3McAb終濃度為50ng/ml，rhIL_2終濃度為1000U/ml，每2d加液補充rhIL-2，在培養(yǎng)第14天，流式細胞儀檢查培養(yǎng)細胞⑶3、⑶4、⑶8和⑶56表型，收獲CIK細胞。2. CIK細胞表型的檢測

將培養(yǎng)I天和14天的CIK細胞調(diào)整濃度為5 X IO6個/ml，各取200 U I加入Falcon管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標抗體及同型對照IgGl單抗各5 yl，混勻，在4°C暗室反應(yīng)30min后，PBS洗滌2次，上流式細胞儀檢測。實驗結(jié)果如圖
2、圖3所示。3.特異性抗體抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細胞離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測的CIK細胞，PBS洗滌兩次，按IX 106CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤雽嵤├齀制備的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置60分鐘，PBS洗滌CIK細胞沒有結(jié)合上的游離抗體，離心后經(jīng)熒光顯微鏡檢測雙特異性抗體裝載CIK細胞的狀態(tài)。4.熒光顯微鏡檢測熒光抗體標記的雙抗裝備CIK細胞雙標記法將抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細胞PBS洗滌離心后加入抗小鼠FITC-IgG2a單克隆抗體(抗小鼠IgG2a單抗針對Anti_CD3單抗，)和抗小鼠PE-IgGl單克隆抗體(抗小鼠IgGl單抗，針對Anti-⑶133單抗)4°C避光孵育30分鐘后，PBS洗滌兩次，熒光顯微鏡下檢查細胞熒光顏色。同時采用I X IO6CIK細胞做對照。實驗結(jié)果如圖4所示，在圖B中，⑶133抗體在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光；在圖C中，CD3抗體在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光；在圖D中，雙抗裝載的細胞紅綠顏色重合在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)橙色熒光。實施例3 :檢測雙特異性抗體裝備的CIK細胞對SW1990的細胞毒作用以CIK細胞為效應(yīng)細胞，以人胰腺癌細胞系SW1990作為靶細胞，檢測對比抗⑶3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細胞的殺傷作用。分別取10份正常人和10份腫瘤病人的外周靜脈血制備CIK細胞，并且將每一例CIK細胞裝載抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體，分別對比檢測CIK細胞和裝載了抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體的CIK細胞對SW1990細胞的殺傷實驗。實驗步驟為取對數(shù)生長期腫瘤細胞，5000個細胞/孔鋪96孔細胞培養(yǎng)板，第二天分別加入CIK細胞、實施例2制備的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細胞，50ng/l X IO6CIK細胞，以效靶比2: I、10:1和50:1的濃度共同培養(yǎng)72h,每個濃度3個平行孔；棄上清液，PBS漂洗細胞兩次后，加入Cell counting Kit CCK-8細胞計數(shù)試劑盒中應(yīng)用液繼續(xù)培養(yǎng)4小吋，96孔細胞培養(yǎng)板放入酶聯(lián)儀檢測在450nm處吸光度OD值，按公式計算細胞殺傷率殺傷率(%) = [!-(實驗組OD值)/CIK對照OD值+靶細胞對照OD值]X 100%。
實驗同時設(shè)單純CIK細胞對照組、靶細胞對照組和空白組。細胞毒作用的檢測對各實驗組采用t檢驗，以P〈0. 05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。正常人的CIK細胞殺傷實驗結(jié)果圖5所示。病人的的CIK細胞殺傷實驗結(jié)果如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在2: I、10 :1和50 1的不同效靶比條件下，在同一個效靶比濃度下，抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細胞對胰腺癌靶細胞的殺傷作用均大于單純CIK 組。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明無論是正常人的還是病人的CIK，經(jīng)過雙抗裝備的CIK細胞對高表達⑶133的胰腺癌細胞系SW1990的殺傷作用對明顯大于單純CIK組，p〈0. 05。CIK細胞和雙抗裝備的CIK細胞，殺傷靶細胞的作用與效應(yīng)細胞的濃度呈正相關(guān)，濃度越大，殺瘤 作用越強。實施例4 :檢測雙特異性抗體裝備的CIK細胞對人胰腺癌細胞系Capan-2的細胞
毒作用以CIK細胞為效應(yīng)細胞，以低表達⑶133的人胰腺癌細胞系Capan-2作為靶細胞，檢測對比裝備了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的CIK細胞的殺傷作用。以正常人外周靜脈血制備的CIK細胞分別對Capan-2殺傷實驗做了 10人次實驗方法同實施例3 :實驗結(jié)果如圖7所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在2 :I、10 :1和50 1的不同效靶比條件下，在同一個效靶比濃度下，雙抗裝備的CIK對低表達D133的胰腺癌細胞系Capan2細胞殺傷作用均大于單純CIK組，但是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析兩組的殺傷作用差異不顯著，P>0. 05。實驗例5 :檢測雙特異性抗體裝備的CIK細胞對人肝癌細胞系Ifep3B和H印G2的細胞毒作用以CIK細胞為效應(yīng)細胞，以人肝癌細胞系H印3B和H印G2作為靶細胞，檢測對比抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細胞的殺傷作用。以正常人外周靜脈血制備的CIK細胞分別對Ifep3B和IfepG2殺傷實驗做了 20人次實驗方法同實施例3 :實驗結(jié)果如圖8、9所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在2: I、10 :1和50 1的不同效靶比條件下，在同一個效靶比濃度下，雙抗裝備的CIK細胞對肝癌系靶細胞的殺傷作用均大于單純CIK組。經(jīng)過抗⑶3/抗CD 133雙特異性抗體裝備的CIK細胞對高表達CD133肝癌細胞系Hep3B具有更強的殺傷作用，與單純CIK細胞相比有顯著差異，p〈0. 05，而對低表達⑶133肝癌細胞系H印G2的殺傷作用差異不顯著，p>0. 05。CIK細胞和裝備了抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體的CIK細胞，其殺傷靶細胞的作用與效應(yīng)細胞的濃度呈正相關(guān)，濃度大，殺瘤作用越強。實驗例6 :細胞因子檢測取對數(shù)生長期人胰腺癌細胞系SW1990以5000個細胞/孔鋪96孔，第二天加入CIK細胞或抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK，以效靶比2:1、10:1和50:1的濃度共同培養(yǎng) 72 小時，收集上清液,用 ELISA Kit Human IFN- y (R & D pharmingen (San Diege,U. S. A))檢測細胞IFN- y分泌水平，實驗結(jié)果如圖10所示。
雙抗裝備的CIK細胞與四種不同的靶細胞共同培養(yǎng)72小時后，檢測細胞培養(yǎng)上清液，均伴有Y -干擾素分泌水平明顯增高，與單純CIK組比較差異顯著，p〈0. 05。同時還檢測了 TNF-a、IL-12、IL_4、IL-10和TGF-B的分泌水平，但是各組間與對照組無明顯差異，無可見陽性試驗結(jié)果。結(jié)果表明抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細胞對靶細胞的殺傷效應(yīng)與INF-Y分泌水平密切相關(guān)。實驗例7 :雙抗裝備的CIK細胞治療裸鼠皮下移植瘤實驗取8周齡雌裸鼠33只，每只裸鼠右腋下皮下注射2X IO6人胰腺癌細胞系SW1990細胞，10天后腫瘤長到0. 3cm大小，隨機分成3組對照組，單純CIK組和抗⑶3/抗⑶133裝備的CIK組，單純CIK組腹腔內(nèi)注射CIK細胞I X IO7次/周，每周2次；雙抗裝備CIK組腹腔內(nèi)注射BsAb+CIKl X IO7次/周，每周2次；對照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水200ul次/周， 每周2次。40天處死小鼠，統(tǒng)計各組瘤重平均值與SD為對照組0. 4592±0. 046克，CIK組
0.2683±0. 0733，雙抗裝備組0. 1197±0. 074，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明，與單純CIK治療組比較，經(jīng)雙抗裝備的CIK細胞對小鼠高表達⑶133SW1990細胞皮下移植瘤的生長抑制作用更加顯著，對照組與CIK組比較p=0. 01，對照組與雙抗裝備的CIK細胞組比較p=0. 003，CIK組與雙抗裝備的CIK細胞組p=0. 013。統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)如圖11所示。實驗結(jié)果顯示，裝備有雙抗的CIK細胞對腫瘤的生長期到非常明顯的抑制作用。實驗例8 熒光定量RT-PCR人胰腺癌細胞系SW1990以2X106個細胞種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，第二天分別加入
2X IO7CIK細胞或抗⑶3/抗⑶133裝備的CIK (效靶比濃度10 :1)，留ー瓶未處理的腫瘤細胞做空白對照，共同培養(yǎng)24小時，棄上清液，PBS漂洗細胞兩次，加入TRIZOLlml，收集細胞裂解液，用總RNA試劑盒提取總RNA，以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用ABI-Prism7000Sequence Detector system 做突光定量 PCR 檢測；合成引物序列S100P 上游引物SEQ ID NO: 1GCAGCACGCAGACCCTGACCAA ；S100P 下游引物SEQ ID NO: 2GCAGCCACGAACACGATGAAC ；STATl 上游引物SEQ ID NO:3GTTAGGCTATTCACAACCACTC ；STATl 下游引物SEQ ID NO: 4ACTTCACGAAACATCATCCAC ；P -actin 上游引物SEQ ID NO: 5AGCGAGCATCCCCCAAAGTT ；P -actin 下游引物SEQ ID NO: 6GGGCACGAAGGCTCATCATT ；上述引物序列由百維信生物invitrogen公司合成。反應(yīng)體系10XBufferlul，dNTP (IOmM) 0. 25ul，primer2ul，Taq 酶 0. Iul，SYBRGreen 10. 5ul,模板 cDNAlul, ddH205. 15ul,總體積 IOul。反應(yīng)程序預(yù)變性95°C 2mi,30個循環(huán)變性94°C，lOsec，退火55°C，IOsec延伸72°C，30sec。數(shù)據(jù)處理計算Folds=2-AA ct, AA Ct= (Ctl-Ct2) - (Ct3_Ct4)，Ctl :處通樣品待測基因的；Ct2 :處通樣品看豕基因的；Ct3 :對照樣品待測基因的；Ct4 :對照樣品。統(tǒng)計學(xué)分析
實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS11. 5統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差分析、相關(guān)性分析和t檢驗，檢驗水準a =0. 05，以？ < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分析結(jié)果 如圖12所示(*p< 0. 05，#p < 0. 01)，其中，左圖為 S100P、右圖為 STATl0
權(quán)利要求
1.一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體，其特征在于，所述的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將抗⑶3的單克隆抗體Img溶解于Traut's試劑，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體； (2)CD133/1單克隆抗體Img溶于交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體； (3)將步驟(I)步驟(2)得到的交聯(lián)后的單克隆抗體混合，I 4°C下作用12 18小時。
3.—種權(quán)利要求I所述的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的CIK細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)CIK細胞的培養(yǎng) 取健康外周靜脈血10ml，肝素抗凝，用生理鹽水I :1稀釋后，加至淋巴細胞分離液上層，離心收集單個核細胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2X106個/ml，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 24h，然后加入rhIL-1 a 100U/ml、鼠抗人CD3McAb 50ng/ml,rhIL-2 1000U/ml，每兩天添加 rhIL-2 1000U/ml，在培養(yǎng)第 14 天，檢查 CD3、CD4、CD8和⑶56，收獲CIK細胞； (2)CIK細胞表型的檢測 調(diào)整培養(yǎng)O天和14天的CIK細胞濃度為5 X IO6個/ml，各取200 μ I加入離心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標抗體及同型對照IgGl單抗各5 μ 1，混勻，在4°C暗室反應(yīng)20 40min后，PBS洗滌I 3次，流式細胞儀檢測CIK細胞中⑶3陽性細胞彡85%，CD3和CD8雙陽性細胞彡60%, CD3和CD56雙陽性細胞彡20% ； (3)抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細胞 離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測的CIK細胞，PBS洗滌I 3次，按IX 106CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟耿?/抗⑶133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置40 80分鐘，PBS洗滌I 3次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙特異性抗體，具體講，涉及一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體及該雙抗裝備的CIK細胞，及其制備方法。本發(fā)明的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。本發(fā)明的該雙抗裝備的CIK細胞可靶向殺傷高表達CD133的癌細胞，并具有很強的抑制腫瘤生長的作用。
文檔編號C12N5/0783GK102775494SQ20121023852
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者黃建華 申請人:黃建華