專利名稱：一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因mustn1及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種從北京鴨抑制消減雜交(SSH) cDNA文庫(kù)中篩選出來(lái)的在肌肉組織中高表達(dá)的基因(MUSTN1, Musculoskeletal Embryonic Nuclear Proteinl)及其應(yīng)用，同時(shí)還涉及一種該基因編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
北京鴨是世界上著名的優(yōu)良肉用鴨品種，具有生長(zhǎng)發(fā)育快、育肥性能好的特點(diǎn)。北京鴨肉用性能尚低于國(guó)外優(yōu)良肉鴨水平，其中骨骼肌發(fā)育時(shí)間晚且瘦肉率低是其最大的缺點(diǎn)。因此，篩選北京鴨肌肉發(fā)育相關(guān)基因，利用標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(MAS)，對(duì)加速瘦肉型北京 鴨的育成具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。肌肉的發(fā)育是由眾多基因共同調(diào)控的，利用抑制消減雜交技術(shù)可以分離到不同發(fā)育時(shí)期肌肉相關(guān)的差異表達(dá)基因。利用qRT-PCR可以分析差異表達(dá)基因在整個(gè)胸肌發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)而推測(cè)基因的功能。MUSTNl基因是2004年首次發(fā)現(xiàn)的，該基因編碼一種小核蛋白(LombardoF，Komatsu Dj Hadjiargyrou M. Molecular cloning and characterization of Mustang, anovel nuclear protein expressed during skeletal development and regeneration.FASEB. J，2004，18:52 - 61.)，該蛋白具有四個(gè) AP-1 結(jié)構(gòu)域(Liu Cj HadjiargyrouM. Identification and characterization of the Mustang promoter:regulationby AP-I during myogenic differentiation. Bone, 2006, 39:815824.)，在骨豁再生與發(fā)育中發(fā)揮重要作用。MUSTNl是一個(gè)肌肉特異性表達(dá)基因，也是一個(gè)成肌分化和肌融合的重要調(diào)節(jié)基因(Liu C，Gersch RP, Hawke TJj Hadjiargyrou M. Silencingof Mustnlinhibits myogenic fusion and differentiation. Am. J. Physiol. Cell.Physiol.，2010，298，CllOO-C1108.)，并對(duì)肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育具有促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，MUSTNl基因能促進(jìn)肉雞和蛋雞骨骼肌生長(zhǎng)(Zheng Q, ZhangY, ChenY, Yang N, Wang XJj ZhuD.Systematic identification of genes involved in divergent skeletal musclegrowth rates of broiler and layer chickens. BMC. Genomics. , 2009, 10:87.), 也是導(dǎo)致羊骨盆、四肢及腰部骨骼肌肉肥大的差異表達(dá)上調(diào)基因之一(Vuocolo T, ByrneK, White Jj McWilliam S，Reverter A，Cockett NE，Tellam RL Identification of a genenetwork contributing to hypertrophy in callipyge skeletal muscle. Physiol.Genomics.，2007，28:253 - 272.)。同時(shí)，MUSTNl基因?qū)∪鈸p傷修復(fù)、軟骨細(xì)胞的增殖與分化以及骨再生等都有一定作用(RobertP GiArifKj Lidia S，Gina S，Gerald HT. Mustnlisessential for craniofacial chondrogenesis during Xenopus development. Gene.Expr. Patterns.，2012，doi : 10. 1016/ j. gep. 2012. 01. 002.)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTN1。本發(fā)明的目的還在于提供了一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因在肌肉發(fā)育過(guò)程中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明的目的還在于提供了一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl編碼的蛋白質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTN1，其cDNA序列與SEQ ID NO. I所示的序列一致。MUSTNl基因的cDNA序列長(zhǎng)度為358bp，自38bp至274bp區(qū)段為其開(kāi)放閱讀框，編碼78個(gè)氨基酸，r37bp區(qū)段為5’非編碼區(qū)，275 358bp區(qū)段為3’非編碼區(qū)。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl編碼的蛋白質(zhì)，所含的氨基酸序列與SEQ ID NO. 2所示的序列一致。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl在胸肌發(fā)育調(diào)控過(guò)程中的應(yīng)用。本發(fā)明是采用qRT-PCR技術(shù)分析了 MUSTNl基因在2、4、6和8周齡北京鴨胸肌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明該基因在2、4、6周齡北京鴨胸肌組織中表達(dá)量逐漸增加，并在6周齡達(dá)到的最高峰，8周齡表達(dá)量又減少(如圖I所示)，該基因的表達(dá)模式與北京鴨胸肌的實(shí)際發(fā)育情況一致，表明MUSTNl基因是北京鴨胸肌發(fā)育的正調(diào)控基因。用同樣的方法分析了 MUSTNl基因在4周齡北京鴨胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝臟和腎臟組織中的表達(dá)情況(如圖2所示)，表明該基因主要在肌肉組織中表達(dá)。以上研究表明，MUSTNl對(duì)北京鴨胸肌的發(fā)育起重要的調(diào)控作用。


圖I為本發(fā)明的鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl在2、4、6和8周齡北京鴨胸肌組織中的表達(dá)；圖2為本發(fā)明的鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl在4周齡北京鴨胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝臟和腎臟組織中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。I、樣品的采集選擇2周齡和6周齡發(fā)育正常的北京鴨Z5系母鴨各4只，另選擇同一品系4周齡和8周齡發(fā)育正常的北京鴨母鴨各4只，屠宰后立即無(wú)菌采集胸肌組織，組織樣品采集后立即投入液氮中保存?zhèn)溆谩?、RNA提取及檢測(cè)用Takara公司的RNAiso plus試劑盒提取組織總RNA，利用A260:A280確定RNA的純度，通過(guò)O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。3、消減雜交(SSH)正反cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和序列克隆正庫(kù)以6周齡北京鴨胸肌組織為T(mén)ester，以2周齡北京鴨胸肌組織為Driver ;反庫(kù)以2周齡北京鴨胸肌組織為T(mén)ester，以6周齡北京鴨胸肌組織為Driver。分別從4只2周齡北京鴨胸肌總RNA中取出2 μ 1，充分混合，制備成2周齡胸肌總RNA池；用同樣的方法制備6周齡胸肌總RNA池。從制備的2周齡和6周齡北京鴨胸肌總RNA池中各取出I μ I用 Clontech 公司的 SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成 cDNA 第一鏈,然后用Advantage2PCR Kit試劑盒合成cDNA第二鏈；將合成的第二鏈用CHR0MASPIN-1000柱色譜純化后，用Rsa I限制性內(nèi)切酶消化、乙醇沉淀純化，回收酶切完全的cDNA第二鏈。將Tester cDNA兩端加上接頭IR和2R，進(jìn)行2次消減雜交和2輪PCR擴(kuò)增，富集差異表達(dá)基因?；厥占兓诙哖CR產(chǎn)物后與PMD-19T載體(Takara)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α(Takara)，在含有AMP/IPTG/X_Gal的固體培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑選白斑菌落震蕩培養(yǎng)。4.差異表達(dá)克隆的測(cè)序、序列分析和Unigene功能注釋對(duì)來(lái)自正、反庫(kù)的克隆進(jìn)行測(cè)序(ABI3730XL測(cè)序儀)，測(cè)序結(jié)果利用phred程序(版本phred_0. 020425. c)從峰圖文件提取序列信息,運(yùn)用cross_match (版本0· 990329)程序去除EST中的低質(zhì)量序列、載體序列、重復(fù)序列，rRNA和污染序列。然后，使用phrap序列拼接軟件(版本I. 080812)將上一步篩選到的高質(zhì)量EST進(jìn)行組裝，得到Unigenes (包括單個(gè)的EST序列和疊連群)，并通過(guò)人工進(jìn)行錯(cuò)誤矯正。對(duì)Unigenes的分析主要包括以下 三個(gè)方面(I)用getorf軟件(EMB0SS-4. I. O里面的軟件)進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)；(2)通過(guò)BLAST比對(duì)進(jìn)行Unigenes的基因注釋；(3)對(duì)已經(jīng)注釋的Unigenes進(jìn)行GO分析和KEGG分析。5.熒光實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)分析分別將2、4、6和8周齡北京鴨的胸肌組織和4周齡北京鴨胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝臟和腎臟組織的RNA各300ng用DNAse (Promega)處理，以去掉殘存的基因組DNA，用Clontech公司的SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈，以這些cDNA第一鏈為摸板，采用Takara公司生產(chǎn)的SYBRD Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行熒光定量分析(Stratagene Mx3005P)，總的反應(yīng)體系為20 μ 1，其中模板cDNA第一鏈I μ 1，IO'< S Y BR Premi X Ex Taq 2 μ 1，上、下游引物各 O. 7 μ 1，ddH207. 6 μ I。反應(yīng)過(guò)程為 95°C預(yù)變性Imin ;然后94°C變性30s，退火30s，72°C延伸30s，42個(gè)循環(huán)。引物序列信息見(jiàn)表I。表1MUSTN1基因qRT-PCR的引物序列信息表
Tm 產(chǎn)物K.度
稱O丨物卬列
(V) (bp)
5’ GCCCAGAACATTATCCCAG 3' 55.0 GAPDH 94 _ 5' AGCCCATTCCGGTAAAGC 3’ 57.5__
5* AAAAAGAAGCGTCCTCC 3' 49.3
MUSTNl................................................................................................................................................................................................................................................................................ 173
_ S1 AAGACTGTTTCACCTCCTG 3' 48.9 _序列表SEQUENCELISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用<130>說(shuō)明書(shū)
權(quán)利要求
1.一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTN1，其特征在于其CDNA序列與SEQID NO. I所示的序列一致。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTN1，其特征在于MUSTN1基因的cDNA序列長(zhǎng)度為358bp，自38bp至274bp區(qū)段為其開(kāi)放閱讀框，編碼78個(gè)氨基酸，I 37bp區(qū)段為5’非編碼區(qū)，275 358bp區(qū)段為3’非編碼區(qū)。
3.—種如權(quán)利要求I所述的鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，所含的氨基酸序列與SEQ ID NO. 2所示的序列一致。
4.一種如權(quán)利要求I所述的鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTNl在胸肌發(fā)育調(diào)控過(guò)程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTN1及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。鴨肌肉發(fā)育調(diào)控基因MUSTN1，其cDNA序列與SEQIDNO.１所示的序列一致。本發(fā)明是采用qRT-PCR技術(shù)分析了MUSTN1基因在2、4、6和8周齡北京鴨胸肌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明該基因在2、4、6周齡北京鴨胸肌組織中表達(dá)量逐漸增加，并在6周齡達(dá)到的最高峰，8周齡表達(dá)量又減少(如圖１所示)，該基因的表達(dá)模式與北京鴨胸肌的實(shí)際發(fā)育情況一致，表明MUSTN1基因是北京鴨胸肌發(fā)育的正調(diào)控基因。用同樣的方法分析了MUSTN1基因在4周齡北京鴨胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝臟和腎臟組織中的表達(dá)情況(如圖２所示)，表明該基因主要在肌肉組織中表達(dá)。以上研究表明，MUSTN1對(duì)北京鴨胸肌的發(fā)育起重要的調(diào)控作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816767SQ201210238148
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者徐鐵山, 侯水生, 張小輝, 葉保國(guó), 黃葦, 謝明, 喻俊英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 河南科技大學(xué), 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所