專利名稱：利用核苷酸化學(xué)分子式鑒定植物品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用核苷酸化學(xué)分子式鑒定植物品種的方法。
背景技術(shù)：
植物品種是指經(jīng)過人工選育而形成種性基本一致、遺傳性比較穩(wěn)定、具有人類需要的某些經(jīng)濟(jì)性狀如觀賞性狀、藥用性狀或其它經(jīng)濟(jì)性狀，作為特殊生產(chǎn)資料用的栽培植物群體。如牡丹品種、核桃品種、蘋果品種等。植物品種一般利用表型性狀進(jìn)行鑒定和識(shí)別。但是，植物品種在特征表現(xiàn)上存在季節(jié)差異，在有的季節(jié)可能表現(xiàn)不出品種間有差異的性狀。例如，牡丹品種通常按照花型和花色分類，然而，每年只有一個(gè)月左右的開花期，花期以外的時(shí)間存在品種鑒定難的問題， 牡丹品種通過嫁接無性繁殖；有些西瓜品種只有到瓜熟期根據(jù)瓜外皮表面的斑紋和色澤才能鑒定，其它時(shí)期難以區(qū)分。品種的準(zhǔn)確度和純度的分析一直是經(jīng)濟(jì)植物和資源植物(如花卉)產(chǎn)業(yè)發(fā)展上的重要課題。在規(guī)?；a(chǎn)領(lǐng)域，以某種具體植物品種為生產(chǎn)資料和產(chǎn)品進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，通過市場(chǎng)銷售獲取利潤(rùn)的企業(yè)，鑒定品種名稱、分析批量產(chǎn)出的植物品種純度及解決相關(guān)技術(shù)問題，需要借助靈敏度高的DNA分子分形檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行精確鑒定和分析。目前的DNA檢測(cè)技術(shù)，如DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記[random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD)]、重復(fù)序列間隔區(qū)多態(tài)性標(biāo)記[inters impIe sequencerepeat (ISSR)]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記[amplified fragment lengthpolymorphism(AFLP)]、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記[sequence-related amplifiedpolymorphism(SRAP)]以及微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記[microsatellites orpolymorphic simple sequence repeats (SSRs)],在應(yīng)用方面都可以解決一些問題,如品種間遺傳關(guān)系的推測(cè)等，但都存在不同程度的局限和不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)牡丹品種的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)用引物對(duì)對(duì)待測(cè)牡丹品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的區(qū)域的PCR產(chǎn)物；所述引物對(duì)由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成；2)將所述PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列；3)將所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列與核苷酸序列組群進(jìn)行比對(duì)，找出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，列出待測(cè)牡丹品種核苷酸分子式；所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式的通式為=BxlBx2By Bxn，其中，B為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基種類，為A、T、C和G四種堿基中的任意一種；xl為第I個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，類推，xn為第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)；所述BxlBx2Bx3…Bxn為所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起依次列出；所述核苷酸序列組群由序列表中序列3、序列4、序列5和序列6組成；4)將所述待測(cè)牡丹品種核苷酸分子式與核苷酸分子式組群比對(duì)，確定待測(cè)牡丹品種；所述核苷酸分子式組群由如下四種核苷酸分子式組成T3C3(I1A348G416C571G712、G3C301G348G416A571G712、TsA301G348G416A571T712 和 T3A301G348A416A571T712 ；每一種所述核苷酸分子式對(duì)應(yīng)一個(gè)牡丹品種組群。
上述方法中，步驟I)中，所述PCR擴(kuò)增的模板為所述待測(cè)牡丹品種的基因組DNA ；步驟3)中，所述列出待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式的方法包括如下步驟將所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起第3、301、348、416、571和712位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母按順序依次列出，并將每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中自5’末端起的位置順序號(hào)作為下標(biāo)，標(biāo)在所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母的右下角，得到待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式；所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式的通式為B3B3tllB348B416B571B712 ；步驟4)中，所述T3C3tllA348G416C571G712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’；所述T3C3tllA348G416C571G712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群具體由如下品種組成‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’；待測(cè)試的品種數(shù)量增多時(shí)，隸屬于該譜系的品種數(shù)目有可能增多；以下類推。所述G3C3tllG348G416A571G712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘紅斑白’和‘鳳丹所述G3C3tllG348G416A571G712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群具體由如下品種組成‘紅斑白’和‘鳳丹，;所述T3A3tllG348G416A571T712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’；所述T3A3tllG348G416A571T712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群具體由如下品種組成‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’；所述T3A3tllG348A416A571T712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’；所述T3A3tllG348A416A571T712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群具體由如下品種組成‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’。上述方法中，步驟4)中，所述確定待測(cè)牡丹品種的方法包括如下步驟若所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式為T3C3tllA348G416C571G712,則待測(cè)牡丹品種為或候選為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’組成的品種組群中的任意一種；若所述待測(cè)牡丹品種的核昔酸分子式為G3C3tllG348G416A571G712,則待測(cè)牡丹品種為或候選為‘紅斑白’和‘鳳丹’組成的品種組群中的任意一種；若所述待測(cè)核苷酸分子式為T3A3tllG348G416A571T712,則待測(cè)牡丹品種的名稱為或候選為‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’組成的品種組群中的任意一種；
若所述待測(cè)品種的核苷酸分子式為T3A3tllG348A416A571T712,則待測(cè)牡丹品種的名稱為或候選為‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’組成的品種組群中的任意一種。上述方法中，在步驟4)后還包括如下步驟比較所述待測(cè)牡丹品種與其所屬的品種組群中的每一種品種的表型特征，若待測(cè)牡丹品種與其所屬的品種組群中的一種品種表型特征(花色或花型)相同，則所述待測(cè)牡丹品種為或候選為對(duì)應(yīng)的品種。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)牡丹品種的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括引物對(duì)、記載有核苷酸序列組和核苷酸分子式組的比對(duì)卡；所述引物對(duì)為由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成的引物對(duì)；所述核苷酸序列組由序列表中序列3、序列4、序列5和序列6組成；
所述核苷酸分子式組由如下四種核苷酸分子式組成T3C3(I1A348G416C571G712、G3C301G348G416A571G712、TsA301G348G416A571T712 和 T3A301G348A416A571T712 ；所述待測(cè)牡丹品種具體為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、
‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’或‘鳳丹粉’。上述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)牡丹品種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述待測(cè)牡丹品種具體為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、
‘首案紅’、‘肉芙蓉’或‘鳳丹粉’。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定植物品種的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)通過比對(duì)植物多個(gè)品種的葉綠體基因組序列，選取所述多個(gè)品種的葉綠體基因組序列中存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)差異的區(qū)域作為目的DNA區(qū)域；2)利用所述目的DNA區(qū)域兩側(cè)保守區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增所述目的DNA區(qū)域的引物；3)分別用所述引物對(duì)每一個(gè)品種分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到每個(gè)所述植物品種的目的DNA區(qū)域；4)測(cè)序每個(gè)所述植物品種的目的DNA區(qū)域，得到每個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列；5)比較所有品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，列出每個(gè)品種的核苷酸分子式；所述每個(gè)品種的核苷酸分子式由每個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端到3’末端或從3’末端到5’末端依次列出的所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其位置順序編號(hào)組成；所述每個(gè)品種的核苷酸分子式通式為BxlBx2Bx3…Bxn，其中，B為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基種類，為A、T、C和G四種堿基中的任意一種；xl為第I個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列從5’末端或從3’末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列從5’末端或從3’末端起的位置順序編號(hào)，類推，xn為第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列從5’末端或從3’末端起的位置順序編號(hào)；
所述BxlBx2Bx3…Bxn為將所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列從5’末端或3’末端起依次列出；6)將具有相同所述核苷酸分子式的品種組成同一個(gè)譜系，具有不同核苷酸分子式的品種組成不同的譜系；將所有譜系組成核苷酸分子式譜系表；所述核苷酸分子式譜系表中，每一種核苷酸分子式對(duì)應(yīng)來自一個(gè)譜系的品種組群;7)將待測(cè)植物按照步驟3) -5)重復(fù)操作，將步驟3) _5)中的品種替換為待測(cè)植物，得到所述待測(cè)植物的目的DNA區(qū)域的核苷酸分子式；將所述待測(cè)植物的目的DNA區(qū)域的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中所有核苷酸分子式比較，確定所述待測(cè)植物的品種名稱及其隸屬的譜系。
上述核苷酸分子式的下標(biāo)也可以為從任意可比起點(diǎn)開始算起的位數(shù)。上述方法中，步驟I)中，所述目的DNA區(qū)域?yàn)椴糠謕sbf-petL基因間隔區(qū)；步驟3)中，所述PCR擴(kuò)增的模板為每個(gè)所述植物品種的基因組DNA ；步驟5)中，所述每個(gè)品種的核苷酸分子式由每個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端到3’末端依次列出的所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母及其位置順序編號(hào)組成；所述每個(gè)品種的核苷酸分子式通式為BxlBx2By Bxn，其中，B為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基種類，為A、T、C和G四個(gè)堿基中的任意一種；xl為第I個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，類推，xn為第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)；所述BxlBx2Bx3…Bxn為將所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起依次列出；步驟7)中，所述確定所述待測(cè)植物的品種名稱及其隸屬的譜系的方法包括如下步驟若所述待測(cè)植物的目的DNA區(qū)域的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的一個(gè)核苷酸分子式相同，則所述待測(cè)植物品種為或候選為所述一個(gè)核苷酸分子式對(duì)應(yīng)的所述譜系中的任意一種品種。上述方法中，步驟5)中，所述列出每個(gè)品種的核苷酸分子式的方法包括如下步驟將每一個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中的所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的順序依次列出，且將所述每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序號(hào)作為所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母的下標(biāo)；得到每個(gè)品種的核苷酸分子式。上述方法中，步驟I)中，所述植物為牡丹，所述植物多個(gè)品種及其對(duì)應(yīng)的所述部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列如下所述植物品種為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’;所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪
浪’、‘花斑白’、‘景玉’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；
所述‘紅斑白’、‘鳳丹’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述‘肉芙蓉’、‘鳳丹粉’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；步驟2)中，所述引物為由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成；步驟4)中，所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列3 ；、所述‘紅斑白’、‘鳳丹’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列4 ；所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列5 ；所述‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列6 ;步驟2)中，所述引物為由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成；步驟4)中，所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列3 ；所述‘紅斑白’、‘鳳丹’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列4 ；所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列5 ；所述‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列6 ;步驟5)中，所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’的核苷酸分子式均為T3C3tllA348G416C571G712 ；所述‘紅斑白’和‘鳳丹’的核苷酸分子式均為G3C3tllG348G416A571G712 ；所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’的核苷酸分子式均為
^3-^301^348^416-^571^712 ;所述‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’的核苷酸分子式均為T3A3tllG348A416A571T71215本專利中描述的方法構(gòu)建核苷酸分子式適用于植物品種分類、鑒定、調(diào)查和管理等企業(yè)式贏利活動(dòng)，社會(huì)公益性科學(xué)研究不包括在內(nèi)，本文使用的核苷酸分子式是指利用植物葉綠體基因組DNA的可變區(qū)序列中的多態(tài)單核苷酸字母與其所處的位置順序數(shù)構(gòu)建的、用于區(qū)分品種的基因型類型的簡(jiǎn)單表達(dá)式。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的方法為利用植物葉綠體基因組DNA序列，以核苷酸分子式的形式對(duì)植物品種進(jìn)行鑒定和譜系分析，是一種較為精確、簡(jiǎn)捷的方法，可以提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效率和質(zhì)量監(jiān)控水平，彌補(bǔ)了以往方法的不足，可以使分析精度達(dá)到一個(gè)核苷酸分子的水平。具體是通過18個(gè)觀賞性牡丹葉綠體psbE-petL基因間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，建立核苷酸分子式，根據(jù)不同的核苷酸分子式建立不同的譜系；該由不同核苷酸分子式建立的譜系群表可以用來檢測(cè)待測(cè)植物是否為18個(gè)觀賞性牡丹，方法簡(jiǎn)便且易操作；與形態(tài)特征結(jié)合，進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定待測(cè)植物的品種。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中用18種觀賞牡丹品種‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、
‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’。牡丹品種通過嫁接無性繁殖。用于分析的新鮮葉片于春季采集，利用變色硅膠(干燥劑)立即快速干燥保存。實(shí)施例I、鑒定牡丹品種
本方法的原理植物體內(nèi)含有3個(gè)基因組，分別為葉綠體基因組、線粒體基因組和細(xì)胞核基因組。本方法是利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)從植物葉綠體基因組中采集生物信息的創(chuàng)新方法之一。植物的DNA (脫氧核糖核酸)序列由A、G、C、T四種堿基(核苷酸)構(gòu)成。根據(jù)它們英文名稱的首字母，分別稱之為A (Adenine腺嘌呤)、T (Thymine胸腺嘧啶)、G (Guanine 鳥嘌呤)、C (Cytosine 胞卩密唳)。本方法先利用常規(guī)方法(如CTAB法或市售的植物基因組DNA提取試劑盒)從多個(gè)目的品種的植物材料中分別提取出DNA，再從葉綠體基因組中選擇I至數(shù)個(gè)DNA區(qū)域，利用其兩端的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱PCR)擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，測(cè)序獲得每個(gè)品種的基因組中的該區(qū)域的DNA序列；比較其之間的差異，利用同一位點(diǎn)上有差異的核苷酸分子字母及從5’端的某個(gè)可比的起點(diǎn)位置算起(或任意確定一個(gè)可比的起點(diǎn)位置)，計(jì)算出突變堿基在同源序列中的順序位次數(shù)字，在突變堿基字母的右下角，附上該突變位點(diǎn)的位置數(shù)字，將這樣的突變堿基描述按照順序連接起來，即可構(gòu)建出核苷酸分子式，該核苷酸分子式可用于區(qū)分或鑒定植物品種(譜系或品系)，當(dāng)一個(gè)以上品種擁有同樣的一個(gè)核苷酸分子式(即需要鑒定屬于同一譜系或品系的多個(gè)品種時(shí))，可結(jié)合表型性狀進(jìn)行植物品種(譜系或品系)的深入鑒定。表型性狀指植物體所表現(xiàn)的性狀，包括形態(tài)性狀、生理特征、特性等。I、引物的設(shè)計(jì)針對(duì)DNA可變區(qū)域，可以設(shè)計(jì)出不止一對(duì)引物，均可用于分析、鑒定植物品種。但是，通常選擇其中分辨率最高的區(qū)域之一加以利用，即可滿足需要。選取牡丹葉綠體基因組DNA的psbE-petL基因間隔區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)新的引物，正向引物 psbE-petL-356F(引物序列5’ 一CCTTCTTCTGACACAGCAATG—3’，序列 I)和反向引物psbE-petL-1219R(引物序列5’ 一TTACCATTATAGACAGCACTAACAA—3’，序列 2)。2、psbE-petL基因間隔區(qū)的擴(kuò)增利用中國天根生物技術(shù)有限公司的植物基因組提取試劑盒(DP305)分別提取18種觀賞牡丹品種‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’、‘鳳丹粉’的基因組DNA。將DNA稀釋為每微升25納克的工作液濃度(25ng/ul)，用上述引物psbE-petL-356F和psbE-petL_1219R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)品種均可得到一條長(zhǎng)度為728bp的目的DNA區(qū)域的序列。PCR擴(kuò)增過程中采用的Taq DNA聚合酶和PCR緩沖液是常規(guī)的、普通市售生化試齊U，本實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程中購買的是寶生物技術(shù)(大連)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為TaKaRaCode:DR100B，根據(jù)產(chǎn)品隨附的操作指南進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在Applied BiosystemsVerit 96-Well Thermal Cycler (Model#: 9902, made in Singapore) PCR 儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增的程序?yàn)橄?4度保持4分鐘；再進(jìn)行如下34個(gè)溫度循環(huán)，每個(gè)溫度循環(huán)的設(shè)置為94度I分鐘，53度(退火溫度)40秒，72度I. 5分鐘；最后，72度延伸8分鐘。將上述18個(gè)品種擴(kuò)增得到的DNA片段送北京華大基因有限公司(BeijingGenome Institute,簡(jiǎn)稱 BGI),利用上述引物，在 3730x1 DNA analyzer (AppliedBiosystems, Foster City, California, USA)測(cè)序儀上直接PCR測(cè)序,每個(gè)品種取樣測(cè)序了3個(gè)或3個(gè)以上個(gè)體，品種內(nèi)個(gè)體間的測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致。結(jié)果具體如下‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’品種擴(kuò)增、測(cè)序得到的長(zhǎng)度為728bp的(psbE-petL區(qū))的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；
‘紅斑白’、‘鳳丹’品種擴(kuò)增、測(cè)序得到的長(zhǎng)度為728bp的(psbE-petL區(qū))的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’品種擴(kuò)增、測(cè)序得到的長(zhǎng)度為728bp的(psbE-petL區(qū))的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；‘肉芙蓉’、‘鳳丹粉’品種擴(kuò)增、測(cè)序得到的長(zhǎng)度為728bp的(psbE-petL區(qū))的核苷酸序列為序列表中的序列6。3、序列比對(duì)將上述18個(gè)品種的長(zhǎng)度為728bp的序列(序列3_序列6)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表I :表I為18個(gè)觀賞牡丹品種的4個(gè)遺傳譜系間的可變堿基位點(diǎn)位置
權(quán)利要求
1.一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)牡丹品種的方法，包括如下步驟 1)用引物對(duì)對(duì)待測(cè)牡丹品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的區(qū)域的PCR產(chǎn)物；所述引物對(duì)由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成； 2)將所述PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列； 3)將所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列與核苷酸序列組群進(jìn)行比對(duì)，找出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，列出待測(cè)牡丹品種核苷酸分子式； 所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式的通式為=BxlBx2By Bxn，其中，B為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基種類，為A、T、C和G四種堿基中的任意一種；xl為第I個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，類推，xn為第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)；所述BxlBx2By Bxn為所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起依次列出； 所述核苷酸序列組群由序列表中序列3、序列4、序列5和序列6組成； 4)將所述待測(cè)牡丹品種核苷酸分子式與核苷酸分子式組群比對(duì)，確定待測(cè)牡丹品種； 所述核苷酸分子式組群由如下四種核苷酸分子式組成T3C3(I1A348G416C571G712、G3C301G348G416A571G712、TsA301G348G416A571T712 和 T3A301G348A416A571T712 ； 每一種所述核苷酸分子式對(duì)應(yīng)一個(gè)牡丹品種組群。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述PCR擴(kuò)增的模板為所述待測(cè)牡丹品種的基因組DNA ； 步驟3)中，所述列出待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式的方法包括如下步驟將所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起第3、301、348、416、571和712位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母按順序依次列出，并將每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述待測(cè)牡丹品種目的區(qū)域的核苷酸序列中自5’末端起的位置順序號(hào)作為下標(biāo)，標(biāo)在所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母的右下角，得到待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式； 所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式的通式為B3B3tllB348B416B571B712 ； 步驟4)中，所述T3C3tllA348G416C571G712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉，; 所述G3C3tllG348G416A571G712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘紅斑白’和‘鳳丹，; 所述T3A3tllG348G416A571T712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’； 所述T3A3tllG348A416A571T712對(duì)應(yīng)的牡丹品種組群至少由如下品種組成‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉，。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟4)中，所述確定待測(cè)牡丹品種的方法包括如下步驟 若所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式為T3C3tllA348G416C571G712，則待測(cè)牡丹品種為或候選為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’組成的品種組群中的任意一種； 若所述待測(cè)牡丹品種的核苷酸分子式為G3C3tllG348G416A571G712，則待測(cè)牡丹品種為或候選為‘紅斑白’和‘鳳丹’組成的品種組群中的任意一種； 若所述待測(cè)核苷酸分子式為T3A3tllG348G416A571T712，則待測(cè)牡丹品種的名稱為或候選為‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’組成的品種組群中的任意一種； 若所述待測(cè)品種的核苷酸分子式為T3A3tllG348A416A571T712，則待測(cè)牡丹品種的名稱為或候選為‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’組成的品種組群中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在步驟4)后還包括如下步驟比較所述待測(cè)牡丹品種與其所屬的品種組群中的每一種品種的表型特征，若待測(cè)牡丹品種與其所屬的品種組群中的一種品種表型特征相同，則所述待測(cè)牡丹品種為或候選為對(duì)應(yīng)的品種。
5.一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)牡丹品種的試劑盒，包括引物對(duì)、記載有核苷酸序列組和核苷酸分子式組的數(shù)據(jù)比對(duì)卡； 所述引物對(duì)為由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 所述核苷酸序列組由序列表中序列3、序列4、序列5和序列6組成； 所述核苷酸分子式組由如下四種核苷酸分子式組成T3C3(I1A348G416C571G712、G3C301G348G416A571G712、TsA301G348G416A571T712 和 T3A301G348A416A571T712 ； 所述待測(cè)牡丹品種具體為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’或‘鳳丹粉’。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)牡丹品種中的應(yīng)用；所述待測(cè)牡丹品種具體為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘紅斑白’、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’或‘鳳丹粉’。
7.一種鑒定或輔助鑒定植物品種的方法，包括如下步驟 1)通過比對(duì)植物多個(gè)品種的葉綠體基因組序列，選取所述多個(gè)品種的葉綠體基因組序列中存在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)差異的區(qū)域作為目的DNA區(qū)域； 2)利用所述目的DNA區(qū)域兩側(cè)保守區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增所述目的DNA區(qū)域的引物； 3)用所述引物對(duì)每一個(gè)品種分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到每個(gè)所述植物品種的目的DNA區(qū)域； 4)測(cè)序每個(gè)所述植物品種的目的DNA區(qū)域，得到每個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列； 5)比較所有品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，列出每個(gè)品種的核苷酸分子式；所述每個(gè)品種的核苷酸分子式由每個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端到3’末端或從3’末端到5’末端依次列出的所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母及其位置順序編號(hào)組成；所述每個(gè)品種的核苷酸分子式通式為BxlBx2Bx3…Bxn，其中，B為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基種類，為A、T、C和G四個(gè)堿基中的任意一種；xl為第I個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端或從3’末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端或從3’末端起的位置順序編號(hào)，類推，xn為第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端或從3’末端起的位置順序編號(hào)； 所述BxlBx2Bx3-Bxn為將所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端或3’末端起依次列出； 6)將具有相同所述核苷酸分子式的品種組成同一個(gè)譜系，具有不同核苷酸分子式的品種組成不同的譜系；將所有譜系組成核苷酸分子式譜系表； 所述核苷酸分子式譜系表中，每一種核苷酸分子式對(duì)應(yīng)來自一個(gè)譜系的品種組群； 7)將待測(cè)植物按照步驟3)-5)重復(fù)操作，將步驟3) -5)中的品種替換為待測(cè)植物，得到所述待測(cè)植物的目的DNA區(qū)域的核苷酸分子式；將所述待測(cè)植物的目的DNA區(qū)域的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中所有核苷酸分子式比較，確定所述待測(cè)植物的品種 名稱及其隸屬的譜系。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述目的DNA區(qū)域?yàn)椴糠謕sbE-petL基因間隔區(qū)； 步驟3)中，所述PCR擴(kuò)增的模板為每個(gè)所述植物品種的基因組DNA ； 步驟5)中，所述每個(gè)品種的核苷酸分子式由每個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端到3’末端依次列出的所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母及其位置順序編號(hào)組成；所述每個(gè)品種的核苷酸分子式通式為BxlBx2ByBxn，其中，B為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基種類，為A、T、C和G四個(gè)堿基中的任意一種；xl為第I個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)，類推，功為第n個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序編號(hào)； 所述BxlBx2Bx3-Bxn為將所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所檢測(cè)的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起依次列出； 步驟7)中，所述確定所述待測(cè)植物的品種名稱及其隸屬的譜系的方法包括如下步驟若所述待測(cè)植物的目的DNA區(qū)域的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的一個(gè)核苷酸分子式相同，則所述待測(cè)植物品種為或候選為所述一個(gè)核苷酸分子式對(duì)應(yīng)的所述譜系中的任意一種品種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于 步驟5)中，所述列出每個(gè)品種的核苷酸分子式的方法包括如下步驟將每一個(gè)品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中的所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)按照其在所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的順序依次列出，且將所述每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列中從5’末端起的位置順序號(hào)作為所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸字母的下標(biāo)；得到每個(gè)品種的核苷酸分子式。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述植物為牡丹，所述植物多個(gè)品種及其對(duì)應(yīng)的所述部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列如下 所述植物品種為‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白，、‘景玉’、‘紅斑白，、‘鳳丹’、‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’、‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’; 所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 所述‘紅斑白’、‘鳳丹’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列·4 ； 所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序列5 ； 所述‘肉芙蓉’、‘鳳丹粉’的部分psbE-petL基因間隔區(qū)的核苷酸序列為序列表中的序 列6 ； 步驟2)中，所述引物為由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子組成；步驟4)中，所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列3 ； 所述‘紅斑白’、‘鳳丹’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列4 ； 所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’、‘首案紅’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列5 ； 所述‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列均為序列表中的序列6 ；步驟5)中，所述‘花二喬’、‘金針繡紅袍’、‘疊云’、‘洛陽紅’、‘珊瑚臺(tái)’、‘冠世紅玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’的核苷酸分子式均為T3C3tllA348G416C571G712 ； 所述‘紅斑白’和‘鳳丹’的核苷酸分子式均為G3C3tllG348G416A571G712 ； 所述‘豆綠’、‘姚黃’、‘大胡紅’、‘羅絨紅’和‘首案紅’的核苷酸分子式均為^3-^301^348^416-^571^712 ; 所述‘肉芙蓉’和‘鳳丹粉’的核苷酸分子式均為T3A3tllG348A416A571T7121全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用核苷酸化學(xué)分子式鑒定植物品種的方法。包括如下步驟1)利用葉綠體基因組DNA序列設(shè)計(jì)引物，用引物對(duì)植物品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；2)PCR直接測(cè)序獲得品種的目的DNA區(qū)域的核苷酸序列，通過品種間的核苷酸序列比對(duì)，找到多態(tài)位點(diǎn)及其位置，列出各品種對(duì)應(yīng)的核苷酸分子式；3)將核苷酸分子式應(yīng)用于植物品種分類鑒定和管理。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本方法以核苷酸分子式的形式鑒定植物品種的譜系，是一種較為精確、簡(jiǎn)捷的方法，彌補(bǔ)了以往分析方法的不足。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102719543SQ201210213488
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者索志立 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所